崔若琪 張玲悅 江海溶 張毓羚 張明露 任連海

（1. 北京工商大學生態(tài)環(huán)境學院國家環(huán)境保護食品鏈污染防治重點實驗室，北京 100048；2. 北京鐵路疾病預防醫(yī)學研究中心，北京 100020）

近年來，隨著我國經濟的飛速發(fā)展，餐飲業(yè)的迅速崛起，城市廚余垃圾的占比越來越高，成為了生活垃圾的主要組成部分，其占比約為40%-60%［1］，年產量更是高達1.2×109t，且保持著快速增長的趨勢［2］。廚余垃圾具有含水率高、含鹽量高、有機成分多、容易腐敗、有害成分少等特點［3］，在具有資源化屬性特點的同時易產生大量含氮、含硫化合物的惡臭氣體［4］，如NH3和H2S等，這些氣體在污染大氣的同時也危害人類健康。目前，國內外常見的除臭方法主要為物理法、化學法和微生物法。與其他方法相比，微生物法具有去除效率高、二次污染少、能耗低、設備維護成本低且便于操作等特點，已被國內外廣泛地應用于惡臭的防治中［5］。

目前微生物法除臭的研究大多數(shù)是針對廢水以及畜牧業(yè)中惡臭物質的去除，對排放氣體中惡臭物質去除的研究不多，而針對廚余垃圾惡臭去除的高效除臭菌株選育的相關研究更少。微生物除臭法的核心是高效除臭菌株，單一微生物一般只能夠針對性地降解一種惡臭氣體，而混合菌群則可以同時去除多種惡臭氣體［6］。有研究表明各菌株相互協(xié)同更有利于臭氣的分解，增強除臭效果［7］。因此本研究將通過制備復合微生物除臭菌劑緩解廚余垃圾因降解或腐爛產生的典型惡臭氣體NH3和H2S造成的污染，并將復合菌劑加入廚余垃圾堆肥中評價其除臭效果及對堆肥過程的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 采自北京市環(huán)衛(wèi)集團污水處理廠曝氣池活性污泥樣品和石家莊某社區(qū)廚余垃圾堆肥樣品。

1.1.2 培養(yǎng)基 試驗用培養(yǎng)基配方如下：

NH3選擇培養(yǎng)基［8］：蔗糖50.0 g，KH2PO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1 g，1% ZnSO45.0 mL，NaCl 2.0 g，氨水10 m L，蒸餾水1 000 mL，121℃，滅菌20 min。

脫硫菌選擇培養(yǎng)基［9］：蛋白胨10.0 g，牛肉膏2.0 g，NaCl 5.0 g，Na2S·9H2O 2.0 g。蒸餾水1 000 mL，121℃，滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離純化 將預處理后不同濃度的稀釋液涂布在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基及MRS培養(yǎng)基上，分別用來培養(yǎng)細菌、真菌和乳酸菌。置于30℃恒溫培養(yǎng)箱5 d，隨后進行劃線分離，挑取形態(tài)特征差異顯著的單菌落，經液體培養(yǎng)后得到純化菌液［10］。

1.2.2 除臭菌株的篩選 將保存的菌株分別接種于NH3選擇培養(yǎng)基及脫硫菌選擇培養(yǎng)基中進行初篩，置于30℃培養(yǎng)箱48 h，保留能夠生長的菌株作為復篩的備選菌株。

初篩后的菌株制成菌懸液進行降氨試驗［11］及降硫化氫試驗［12］。NH3的測定采用納氏試劑分光光度法［13］，H2S的測定采用亞甲基藍分光光度法［14］。經篩選得到的對NH3和H2S去除率達50%以上的菌株作為優(yōu)勢菌株保留備用。

1.2.3 除臭菌株的鑒定 對分離得到的優(yōu)勢菌株進行形態(tài)學觀察和革蘭氏染色。采用16S rDNA測序進行菌種的分子生物學鑒定，將菌體交由北京開泰明鏡基因科技有限公司進行16S rDNA 測序鑒定。16S rDNA基因擴增的PCR引物為細菌通用引物，上游引物（341F）“5?CCTACGGGNGGCWGCAG?3”，下游引物（785R）“5?GACTACHVGGGTATCTAATCC?3”。擴增反應體系為25 μL，其中，上游引物、下游引物各0.25 μL、模板DNA 2 μL，2×Mastermix 12.5 μL，ddH2O 10 μL。擴增反應條件為：95℃預變性3 min；95℃變性30 s，55℃引物退火30 s，72℃延伸30 s，25個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。將PCR產物純化后加入到 Illumina Novaseq 6000 測序平臺進行高通量測序，得到測序結果后通過BLAST程序與NCBI Genbank中核酸數(shù)據(jù)進行比對分析，查找與各菌株相似性最高的菌株序列。

1.2.4 除臭菌株的拮抗實驗及菌劑的構建 將具有除臭能力的菌株進行拮抗實驗，拮抗實驗采用菌餅法進行［15］。在培養(yǎng)好的單菌株群落邊緣取5 mm菌餅接于另一菌株涂布后的平板中，每個菌株重復3次，同時將未接種菌株的空白培養(yǎng)基打孔接于此平板作空白對照，培養(yǎng)后觀察是否出現(xiàn)抑菌圈。將不拮抗的菌株按等比例進行復配制成液體菌劑［16］，并將菌液與滅菌后的木屑按照質量比1∶1混合攪拌均勻，在最適溫度的恒溫培養(yǎng)箱中晾干，以供后續(xù)使用。

1.2.5 菌劑除臭條件的優(yōu)化 為了進一步確定菌劑的最佳pH、溫度和接種量，利用響應面 Box?Behnken 法對菌株pH、溫度和接種量進行三因素三水平響應面試驗方案設計，響應面實驗因素水平及編碼見表1。

表1 響應面分析因素和水平Table 1 Response surface analysis factors and levels

1.2.6 堆肥實驗 本實驗采用容積為20 L的塑料桶，以廚余垃圾單獨堆肥作為空白對照組，以添加菌劑的廚余垃圾堆肥作為實驗組。在空白組（K）和實驗組（S）的堆肥桶內各加入約15 kg堆肥物料并攪拌均勻。在桶蓋上打孔接入導管，連接桶蓋的一端使用熱熔膠密封，另一端分別接入堿性鋅氨絡鹽溶液和硼酸溶液中，用于H2S和NH3的測定。實驗周期為20 d，每隔2 d取吸收液測定吸光度，并計算NH3和H2S濃度。

1.2.7 堆肥常規(guī)理化性質的測定 采用水銀溫度計測定環(huán)境及堆肥溫度；采用pH計測定pH；采用烘干法測定含水率；采用元素分析儀測定堆肥樣品中總碳和總氮的含量并計算得到C/N。采用分光光度計測定465 nm和665 nm處E4和E6值，并計算得到E4/E6值。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 采用 SPSS 22.0 和 Microsoft Office Excel 2019 進行統(tǒng)計分析，Origin 2021 作圖，并采用 Design Expert 13.0 軟件進行響應面分析。

2 結果

2.1 除臭菌株的篩選與鑒定

2.1.1 除臭菌株的初篩和復篩 從活性污泥中分離純化得到細菌35株及真菌9株，其中具有H2S降解能力的共19株，具有NH3降解能力的共6株；從廚余垃圾堆肥樣品中分離出細菌21株及真菌6株，其中具有H2S降解能力的共15株，具有NH3降解能力的共3株。

為了進一步明確除臭菌株的除臭能力，本研究對初篩中除臭效果較好的菌株分別進行了NH3和H2S的測定，結果如表2所示，篩選出5株對H2S去除率達90%的菌株，11株對H2S去除率達50%的菌株，2株對NH3去除率達50%以上的菌株。其中菌株J3對NH3的去除率最高，達到了75.14%；菌株X1對H2S去除率最高，達到了95.14%。

表2 篩選結果及其降解率Table 2 Screening results and degradation rates

2.1.2 除臭菌株的拮抗和鑒定 選取復篩去除率大于50%的18株菌株進行拮抗實驗，舍去與其他菌株拮抗的菌株，將剩余的8株菌株制備成菌劑，同時進行16S rDNA 測序。鑒定結果表明有3株氣單胞菌屬、2株迪茨氏菌屬、1株腸桿菌屬、1株申氏桿菌屬和1株賴氨酸桿菌屬。

2.2 除臭條件對NH4+?N降解率和SO42-生成量的影響

為了進一步確定菌劑最佳除臭條件，通過測定NH4+?N降解率和SO42-生成量得出菌劑最佳溫度、pH和接種量，利用Design Expert 13.0軟件進行實驗設計與分析，響應值為NH4+?N的降解率和SO42-生成量，共17組實驗，響應面實驗設計及結果如表3所示。

表3 BOX-Behnken響應面實驗設計及結果Table 3 Design and results of BOX-Behnken response surface experiment

對表3中的實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，建立的回歸預測模型為：

Y1=+0.8799+0.0513A-0.0928B+0.0888C-0.540AB?0.0333AC+0.0980BC-0.5281A2?0.0319B2+0.0020C2；

Y2=+184.75+8.06A+6.60B+4.40C+7.82AB+12.22 AC-8.31BC-66.47A2-24.44B2-23.95C2。

由實驗模型的回歸分析可知所選模型P值分別＜0.05和＜0.0001，說明建立的模型有意義。失擬項P值分別為0.886 4和0.055 1均大于0.05，不顯著，說明該模型較合理。R2分別為0.931 7和0.974 1，說明回歸方程的擬合度較好。

根據(jù)回歸方程繪制響應面，結果如圖1所示。通過實驗模型和響應面分析得到菌劑對NH4+?N降解率的最佳條件為溫度27℃、pH 6.21和接種量14%。培養(yǎng)48 h后，對NH4+?N的降解率為92.55%。菌劑生成SO42-的最佳條件為溫度29℃、pH 6.61和接種量為5%。培養(yǎng)48 h后，SO42-的生成量為173.57 mg/L。

圖1 三因素對NH4+-N降解率和SO42-生成量的響應面圖Fig. 1 Response surface plot of three factors on NH4+-N degradation rate and SO42- production

2.3 堆肥除臭效果評價

NH3與H2S的累積排放量如圖2所示，NH3與H2S排放的高峰期均出現(xiàn)在堆肥的高溫期，隨后排放速率逐漸降低，累積排放量逐漸趨于平緩。在整個堆肥過程中實驗組NH3與H2S的累積排放量均高于空白組，堆肥結束時，空白組NH3的累積釋放量達4 395.99 mg/m3，而實驗組為1 964.01 mg/m3，添加菌劑后NH3的去除率達到了55.32%。同時空白組H2S的累積釋放量達399.71 mg/m3，而實驗組為153.02 mg/m3，添加菌劑后H2S的去除率達到了61.72%。

圖2 NH3和H2S的累積排放量Fig. 2 Cumulative emissions of NH3 and H2S

2.4 除臭菌劑接種對堆肥的影響

由圖3?A可知，堆肥過程中堆體溫度呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢，第5天開始，堆體溫度迅速升高，實驗組在第10天升至47℃，保持了3 d，空白組在第11天升至41℃，保持了2 d。由圖3?B可知，空白組和實驗組的pH值均呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，堆肥結束時，實驗組的pH值低于空白組，具有降低堆肥pH的作用。由圖3?C可知，空白組和實驗組的初始C/N為25，且呈持續(xù)下降的趨勢，最終實驗組C/N低于空白組，可快速降低堆肥C/N。由圖3?D可知，空白組和實驗組的含水率整體呈下降趨勢，堆肥結束時，空白組的含水率為44.80%，實驗組的含水率為39.47%，分別下降23.38%和24.63%。

圖3 堆肥過程中溫度、pH、C/N和含水率的變化Fig. 3 Changes of temperature，pH，C/N and moisture content during composting

2.5 堆肥過程中微生物群落分析

2.5.1 微生物結構分析 空白組和實驗組的細菌群落豐度前十的門如圖4所示，其中厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和放線菌門（Actinobacteria）是堆肥過程中主要的門水平類群，占總細菌數(shù)的90.4%-99.7%。厚壁菌門廣泛存在于堆肥的全過程中，并且占主導地位。變形菌門在堆肥升溫期占主導地位，隨著溫度的上升，其相對豐度逐漸降低。

圖4 堆肥樣品中門水平微生物群落組成Fig. 4 Composition of microbial community at phylum level in compost samples

在屬水平上，如圖5所示，在堆肥的升溫階段（S5-S9和K5-K9）以及高溫及腐熟階段（S11-S13和K11-K13）微生物群落組成差異較大，優(yōu)勢菌群的種類和相對豐度各不相同。在堆肥的初始階段（S1-S3和K1-K3），泛菌屬（Pantoea）和明串珠菌屬（Leuconostoc）等占據(jù)主導地位，隨著溫度的上升（S5-S9和K5-K9），微生物群落更為豐富，占主導地位的菌屬轉變?yōu)槿樗釛U菌（Latilactobacillus）、伴生乳桿菌屬（Companilactobacillus）和乳植物桿菌屬（Lactiplantibacillus）等。本研究中賴氨酸桿菌屬（Lysinibacillus）和腸桿菌屬（Enterobacter）也在此階段占比較大，最高可達到12.48%，分別有助于NH3和H2S的去除。然而隨著溫度的升高，從第11天開始，兩菌株均降至1%以下。在堆肥的高溫及腐熟階段（S11-S13和K11-K13），微生物群落較為豐富，其中占主導地位的菌屬主要包括Pseudogracilibacillus、Schnuerera和芽孢桿菌屬（Bacillus）等。Bacillus和Pseudogracilibacillus均在第9天開始被檢測出，且實驗組S9-S19的平均相對豐度高于空白組K9-K19。同時乳酸菌屬（Lactococcus）在堆肥初期（S1-S3和K1-K3）就已經被檢測出，并且隨著時間的延長，豐度開始增加，空白組（K）的增幅明顯大于實驗組（S）。

圖5 堆肥樣品中屬水平微生物群落組成Fig. 5 Composition of microbial community at genus level in compost samples

2.5.2 微生物群落多樣性分析 為了可視化樣本之間群落組成的差異，對空白組（K）和實驗組（S）的微生物群落Beta多樣性進行NMDS分析，由圖6可知，在堆肥過程中，空白組（K）與實驗組（S）處理的微生物群落隨堆肥進程明顯地分割開來，形成了2個不同的分組，即堆肥的前期升溫階段（S1-S7和K1-K7）以及高溫及腐熟階段（S9-S19和K9-K19），表明堆肥各階段微生物群落結構存在明顯差異；在堆肥同一時期，空白組（K）與實驗組（S）之間也有明顯的間距，且隨堆肥進程差異越明顯，從S7和K7開始組間間距逐漸增大，表明添加菌劑影響了堆肥的微生物群落結構。

圖6 不同堆肥樣品NMDS分析Fig. 6 NMDS analysis of different compost samples

2.5.3 功能基因KEGG 統(tǒng)計與分析 通過KEGG對空白組和實驗組不同堆肥階段的10個樣品進行微生物代謝功能分析，結果如圖7所示：堆肥過程中存在6類（一級）生物代謝通路，最多的通路類別依次為新陳代謝、環(huán)境信息、遺傳信息和細胞過程。其中無論空白組S1-S19還是實驗組K1-K19，新陳代謝功能在多樣性和數(shù)量上均具有顯著優(yōu)勢，而生物體系統(tǒng)和人類疾病相關的功能基因數(shù)量較低。

圖7 功能基因KEGG統(tǒng)計Fig. 7 KEGG statistics of functional genes

在二級功能層上，空白組（K）與實驗組（S）中參與新陳代謝的菌群以碳水化合物代謝、氨基酸代謝、輔助因子及維生素代謝和能量代謝為最大類群，其中碳水化合物代謝和氨基酸代謝占比較高，參與環(huán)境信息菌群的膜運輸和信號轉導為第二大類群，復制和修復在參與遺傳信息處理的菌群上具有優(yōu)勢。

3 討論

本研究篩選得到的除臭菌株X1、X10和X21屬于氣單胞菌屬，是一種可以將硫化物氧化成硫酸鹽的硫氧化細菌［17-18］，可以有效去除H2S。菌株X6屬于申氏桿菌屬、菌株DX6屬于賴氨酸桿菌屬均具有去除NH3的能力［19-20］。復合微生物除臭菌劑應用在廚余堆肥后對于NH3和H2S的去除率分別為55.32%和61.72%。Guo等［21］研究的菌劑對于NH3的去除率為31.34%，Chen等［22］研究的菌劑對于H2S的去除率為35.4%，均低于本研究的去除效果。同時相較于牛永艷等［23］制備的復合菌劑對NH3和H2S的去除率62.84%和53.12%、宋冠林等［24］制備的菌劑對NH3和H2S的去除率63.1%和58.7%，本研究在保持較高除氨效率的同時提高了除硫效率。

接種微生物菌劑對促進堆肥以及減少惡臭氣體的排放都具有積極作用。堆體溫度反應堆肥的進程，也是評價堆肥穩(wěn)定度最簡潔的指標［25］。本研究中實驗組較空白組先開始升溫，并且保持時間更長，較張鐵文［26］的堆肥溫度更高，表明接種微生物菌劑有助于延長堆肥的高溫期，這是由于微生物菌劑刺激了堆肥過程中微生物對有機物的生物降解和礦化，促進了堆肥過程的熱量積累和溫度升高［22］。pH在堆肥中也是重要的指標，有研究表明低pH可以減少NH3揮發(fā)，抑制硝化作用，有效減少氮損失［27］，從最終堆肥來看實驗組的pH低于空白組，表明微生物除臭劑具有降低堆肥pH的作用。本研究中微生物除臭菌劑具有降低堆肥C/N的作用，且與張生偉等［28］研究相比，本研究的除臭劑可以更快地降低C/N，促進堆肥腐熟。而C/N的下降是由于大量的碳在微生物的生長繁殖過程被消耗以及氮的揮發(fā)損失減少［22］，因此C/N的降低也有利于減少NH3的揮發(fā)。含水率作為好氧微生物活性的重要因素［29］，是堆肥過程的重要參數(shù)之一。含水率的變化與堆體溫度和微生物生長代謝有關［27］，本研究中微生物除臭劑具有降低堆肥含水率的作用，這是由于微生物分解有機物產生熱量，使得更多的水分蒸發(fā)，降低了含水率，而適宜的含水率有利于促進微生物降解有機物的速率［30］。

有研究表明，在堆肥過程中，厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門和放線菌門是4種主要的菌門［31］，這與本實驗的研究結果一致。變形菌門是細菌中最大的一門，有研究表明，變形菌門是混合水果垃圾和蔬菜類垃圾腐爛過程中的優(yōu)勢菌門，范圍在16.9%-83.6%［32］。此外，變形菌門在硫元素和氮元素的循環(huán)中也發(fā)揮了重要作用［33］。

屬水平上，菌株Lysinibacillus被證實可有氧進行同步硝化、反硝化，在此過程中可顯著降低氨氮的含量，同時生成亞硝酸鹽［34-35］。菌株Enterobacter可氧化H2S，轉化成硫代硫酸根［36］，并在此過程中占據(jù)重要的地位［18］。本研究發(fā)現(xiàn)接種微生物菌劑增加了實驗組（S）Lysinibacillus和Enterobacter的豐度，從而減少了NH3和H2S的產生。有研究表明Bacillus是高溫期氨化的主要細菌［37］，因具有耐熱性普遍存在于堆肥系統(tǒng)中［38］，且有著重要的作用［39］。本研究中高溫期空白組（K11-K13）的Bacillus高于實驗組（S11-S13），因此，空白組的氨化作用在高溫期強于實驗組，會產生更多的NH3。Asano等［40］的研究也證實了這一點，并表明Bacillus是堆體氨化過程中的核心菌種。Pseudogracilibacillus屬于芽孢桿菌科，該菌屬可以在高溫環(huán)境中生長，并與氮循環(huán)有關［41-42］，其在S17-S19的相對豐度高于K17-K19，表明添加菌劑后具有更好的固氮效果。同時Lactococcus也被證實會對芳香族、支鏈和含硫氨基酸起降解作用［43］，從而產生H2S。Lactococcus隨著時間的延長（S1-S5和K1-K5），豐度開始增加，空白組（K）的增幅明顯大于實驗組（S），由此可推斷出空白組（K）會比實驗組（S）產生更多的H2S，表明添加菌劑有助于減少H2S的產生。

本研究基于KEGG代謝功能分析發(fā)現(xiàn)在二級功能層上，本研究中空白組（K）與實驗組（S）的碳水化合物代謝和氨基酸代謝是堆肥過程中的兩條主要代謝途徑，在整個堆肥過程中相對豐度占10%以上，與Zhang等［44］的研究結果一致，且在眾多功能基因中，碳水化合物代謝和氨基酸代謝是微生物的重要生物代謝，它們的代謝產物能夠調控微生物群落結構和豐度變化［45］，并影響碳氮損失，進而影響氮素損失。碳水化合物代謝在K1和S1階段豐度較高，并且在降解半纖維素和纖維素中起著至關重要的作用［31］。而細菌通過氨基酸代謝功能將堆體中的氮素合成為氨基酸和腐殖質，為堆體微生物提供生存代謝所需的能源與碳源［46］。因此，氨基酸代謝菌的豐度越大，對氨基酸生成和腐殖質合成的促進作用越明顯［31］。

4 結論

本研究以篩選出的8株菌株制備復合菌劑，通過響應面實驗確定了對NH4+?N降解率和SO42-生成量的最佳條件。在堆肥中添加菌劑后，NH3和H2S的去除率分別達到55.32%和61.72%，并且增加了去除NH3和H2S的微生物豐度，促進了群落的演替，改善了廚余垃圾堆肥的品質。