張傲潔 李青云，2 宋文紅 顏少慧 唐愛星，2 劉幽燕，2

（1. 廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，南寧 530004；2. 廣西生物煉制實(shí)驗(yàn)室，南寧 530004）

苯酚是一種常見的芳香族污染物，普遍存在于煉油、造紙、印刷、塑料等工業(yè)廢水中［1-3］。目前處理苯酚廢水的主要方法包括物理法、化學(xué)法、生物法以及這幾種方法相互聯(lián)用的處理技術(shù)，如利用活性炭載體固定微生物去除［4］。相比于其他處理方法，生物法成本較低，更具有可持續(xù)性，而且它能使苯酚完全礦化，是最清潔環(huán)保的處理方法，在廢水處理中發(fā)揮著重要作用［5-6］。近年來，越來越多的苯酚降解微生物從污染地區(qū)分離出來，目前已知紅球菌（Rhodococcus sp.）［7］、假單胞菌（Pseudomonas sp.）［7］、鐮刀菌（Fusarium sp.）［8］、芽孢桿菌（Bacillus sp.）［9］和產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes sp.）［10］等微生物都能降解苯酚，其中產(chǎn)堿桿菌屬對芳香族化合物表現(xiàn)出廣泛的代謝多樣性，對苯酚［11-12］、菲［13］、多環(huán)芳烴［14-15］、偶氮染料［16］、農(nóng)藥［17-18］等多種物質(zhì)都具有降解能力。

已知微生物可以通過好氧和厭氧途徑降解苯酚，其中好氧途徑最為常見。在好氧降解途徑中，苯酚首先被羥化生成鄰苯二酚，然后經(jīng)由otho?（鄰位）或者meta?（對位）降解途徑將鄰苯二酚脫氫、開環(huán)，去除支鏈最后進(jìn)入三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA cycle）而被徹底降解［19-20］。苯酚的降解基因通常成簇排列，位于大質(zhì)粒上或染色體上，編碼苯酚降解的第一個(gè)酶為苯酚羥化酶（PH），它將苯酚羥基化為鄰苯二酚后，由鄰苯二酚1,2?雙加氧酶（C12O）和鄰苯二酚2,3?雙加氧酶（C23O）將鄰苯二酚通過otho?或者meta?途徑開環(huán)裂解為TCA的無毒中間體［21-22］。大量研究表明，編碼雙加氧酶C12O和C23O的基因在不同的降酚菌株中具有高度的同源性，編碼PH的基因一般高度保守，但是存在不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制［23-25］。Teramoto等［26］發(fā)現(xiàn)1株來自于降酚菌R5的苯酚羥化酶基因（Phc）中有3個(gè)調(diào)節(jié)蛋白參與轉(zhuǎn)錄，使得降酚菌R5表現(xiàn)出相對高的苯酚降解活性。Powlowski等［27］發(fā)現(xiàn)菌株P(guān)seudomonas sp. CF600中的苯酚羥化酶與常見的細(xì)菌羥基化酚類化合物的黃素蛋白單加氧酶并不相同。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄激活因子XylR促進(jìn)C23O的活性比DmpR作用強(qiáng)，并且XylR可以代替DmpR并控制C23O酶的活性，以此來調(diào)節(jié)菌株對甲苯和二甲苯的降解［28］。因此，充分開展苯酚降解基因的研究對進(jìn)一步深入認(rèn)識苯酚生物降解機(jī)制及在此基礎(chǔ)上開展定向代謝調(diào)控具有重要意義。

本課題組在前期的研究中分離得到1株能夠降解苯酚的糞產(chǎn)堿桿菌—A. faecalis JF101，基于產(chǎn)堿菌屬的代謝多樣性，為了進(jìn)一步深入了解并挖掘其生物學(xué)功能和基因資源，通過基因組測序和生物信息學(xué)方法，分析菌株基因組中與苯酚降解相關(guān)的功能基因；采用比較基因組學(xué)分析，比較菌株JF101與其他近緣菌株的基因組異同，解析JF101基因組中苯酚降解的合成和調(diào)控基因，為苯酚污染生物修復(fù)的大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用和高效降解工程菌的構(gòu)建提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

糞產(chǎn)堿桿菌A. faecalis JF101（CMCC17153）由實(shí)驗(yàn)室前期分離獲得，本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 方法

1.2.1 菌株JF101的培養(yǎng)及DNA的提取 菌株JF101使用Luria?Bertani培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)，30℃、160 r/min培養(yǎng)至靜止期?；蚪MDNA通過參考天根細(xì)菌DNA試劑盒（DP302?02）（天根生物科技（北京）有限公司）說明提取。

1.2.2 基因組測序、組裝與注釋 糞產(chǎn)堿桿菌JF101的基因組由Pacific Biosciences RS II平臺和Illumina MiSeq平臺確定。測序數(shù)據(jù)采用Pbdagcon（https://github.com/PacificBiosciences/pbdagcon）軟件對模板序列（Subread）進(jìn)行自我糾正，基于糾正的Reads采用Celera、Falcon軟件組裝，選擇出最優(yōu)組裝結(jié)果。為了提高基因組序列的準(zhǔn)確性，利用GATK（https://www.broadinstitute.org/gatk/）和SOap工具包對二代小片段數(shù)據(jù)進(jìn)行單堿基糾正，得到高可信的組裝序列后對組裝結(jié)果進(jìn)行序列成環(huán)判斷、基因組序列及質(zhì)粒序列區(qū)分。

采用Hidden Markov模型和GLIMER3（http://www.cbcb.umd.edu/software/glimmer/）軟件預(yù)測JF101的組裝結(jié)果，同時(shí)使用RNAmmer［29］軟件、tRNAscan?SE［30］軟件、Infernal［31］軟件、Rfam［32］數(shù)據(jù)庫、TRF（Tandem Repeat Finder）［33］軟件預(yù)測基因組中的rRNA、tRNA、sRNA和重復(fù)序列，并根據(jù)重復(fù)單元長度及數(shù)目篩選出其中的微衛(wèi)星以及小衛(wèi)星序列。

1.2.3 基因功能注釋 各基因功能注釋均使用Diamond軟件結(jié)合各個(gè)數(shù)據(jù)庫的特點(diǎn)完成，這些數(shù)據(jù)庫包括COG（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/research/cog?project/）、GO（http://geneontology.org/docs/ontolo gy?documentation/）、KEGG（https://www.kegg.jp/）等。

1.2.4 比較基因組分析 完成JF101基因組的測序與分析后，進(jìn)一步將JF101與公布了完整的基因組信息且研究較深入的5株糞產(chǎn)堿桿菌A.faecalis.MUB14、A. faecalis.P156、A. faecalis.ZD02、ASM96730v2、A. faecalis.c16（以下簡稱MUB14、P156、ZD02、ASM96730v2、c16）進(jìn)行比較基因組分析，基因組信息來自GenBank。本文通過6株菌株基因組的基本特征比較、基因家族統(tǒng)計(jì)及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹對6株菌株進(jìn)行了比較基因組分析。

系統(tǒng)發(fā)育樹的建立，首先通過蛋白序列BLAST比對、solar去除冗余得到基因家族統(tǒng)計(jì)，隨后使用Hcluster?sg（https://anaconda.org/bioconda/hcluster_sg）軟件對比對結(jié)果進(jìn)行TreeFam聚類處理以及Muscle［29］（http://www.drive5.com/muscle）軟件對聚類的基因家族進(jìn)行多序列比對，并將比對結(jié)果轉(zhuǎn)化為CDS區(qū)域的氨基酸多序列比對結(jié)果，最后使用TreeBeST［34］軟件對Muscle多序列比對結(jié)果采用NJ法進(jìn)行單拷貝基因（Gene family模塊）的建樹分析。

1.2.5 基因功能挖掘 使用antisMASH（https://antismash.secondarymetabolites.org/#!/about）對JF101進(jìn)行生物合成基因簇進(jìn)行預(yù)測。

2 結(jié)果

2.1 糞產(chǎn)堿桿菌JF101基因組基本信息

糞產(chǎn)堿桿菌JF101二代測序共得到1 314 Mb原始數(shù)據(jù)，Reads長度150 bp，過濾后數(shù)據(jù)大小為1 310 Mb。三代測序得到的總堿基讀數(shù)為7 410 174 502 bp，Reads N90為7 978 bp，Reads N50為12 788 bp。經(jīng)過組裝得到完整的基因組，大小為 4 143 816 bp，GC占比為57.44%，組裝基因3 804個(gè)（圖1）。RNA預(yù)測結(jié)果得知該菌含有55個(gè)tRNA，9個(gè)rRNA，5個(gè)sRNA。目前糞產(chǎn)堿桿菌JF101序列已提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號為CP118772。

圖1 糞產(chǎn)堿桿菌JF101基因組Fig. 1 Circular representation of Alcaligenes faecalis JF101 genome

2.2 基因功能注釋分析

2.2.1 COG數(shù)據(jù)庫注釋 為了進(jìn)一步了解JF101基因組的功能，將蛋白序列與COG、GO、KEGG等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對獲得對應(yīng)的注釋結(jié)果，并根據(jù)注釋結(jié)果對蛋白功能歸類分析。圖2是基于COG數(shù)據(jù)庫差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能注釋結(jié)果，菌株JF101的全基因組中有3 040個(gè)基因得到功能注釋，占全基因序列的79.9%，其中cellular processes and signal transduction（細(xì)胞過程與信號傳導(dǎo)）占21.32%、information processing and storage（信息處理及儲存）占28.17%、metabolism（新陳代謝）占33.33%、function unidentified（未知功能）占17.18%。菌株基因組中參與新陳代謝類的基因最多，預(yù)示著其對多種污染物具有潛在的降解能力。在細(xì)胞過程與信號傳導(dǎo)類注釋的基因中，細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的生物反應(yīng)基因占比最大（5.46%），說明菌株JF101在生物膜形成方面具有較強(qiáng)的能力。

圖2 糞產(chǎn)堿桿菌JF101 基因組 COG 功能注釋分類Fig. 2 Functional classification of COG of A. faecalis JF101 genome

2.2.2 GO數(shù)據(jù)庫注釋 圖3為基于GO數(shù)據(jù)庫對基因功能進(jìn)行cell component（細(xì)胞組分）、molecular function（分子功能）和biological process（生物過程）的注釋分析，結(jié)果表明，菌株JF101有2 529個(gè)（占比66.48%）基因得到注釋。分子功能注釋基因中參與cytological processes（細(xì)胞過程）、catabolic processes（代謝流程）、microbial regulation（微生物調(diào)節(jié)）、positioning（定位）的基因占比較多，其中bioconjugation capacity（生物結(jié)合能力）和biocatalyt?ic viability（生物催化活力）過程的基因在生物過程中的基因注釋最多，預(yù)示著菌株在催化方面具有良好的潛力。細(xì)胞組分注釋基因包括cellular anatomi?cal entities（細(xì)胞解剖實(shí)體）、cellular intracellular（細(xì)胞內(nèi)）和complex?containing proteins（含復(fù)合體的蛋白質(zhì)），其中cellular anatomical entities功能注釋的基因數(shù)量最多。

圖3 糞產(chǎn)堿桿菌JF101 基因組GO功能注釋分類Fig. 3 Functional classification of GO of A. faecalis JF101 genome

2.2.3 KEGG數(shù)據(jù)庫注釋 菌株有2 415個(gè)基因在KEGG數(shù)據(jù)庫中得到功能注釋，圖4所示，在6大類的代謝通路中，注釋出的基因主要?dú)w屬于metabo?lism（新陳代謝）、heredity（遺傳）、environment（環(huán)境）和cell process（細(xì)胞過程）等相關(guān)通路。其中，新陳代謝通路中synthesis and metabolism of amino acids（氨基酸合成及代謝）、synthesis and metabolism of carbohydrates（碳水化合物合成及代謝）和general and outlined maps（全部概覽）通路的基因得到較多注釋，分別有264個(gè)、196個(gè)和760個(gè)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，新陳代謝通路中有42個(gè)基因功能注釋與芳香族化合物的降解相關(guān)，側(cè)面說明菌株JF101具有潛在的降解苯酚的能力。在環(huán)境通路中，cellular transfer（膜轉(zhuǎn)運(yùn)）的注釋基因最多，這與細(xì)胞的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)有著重要的聯(lián)系。值得關(guān)注的是，在organic system（有機(jī)系統(tǒng)）通路中有關(guān)于adaptation of bacte?ria to their environment（細(xì)菌對環(huán)境的適應(yīng)性）的注釋基因，預(yù)示著菌株JF101在酚類等有機(jī)化合物的環(huán)境中具有良好的適應(yīng)性。

圖4 糞產(chǎn)堿桿菌JF101 基因組KEGG功能注釋分類Fig. 4 Functional classification of KEGG of A. faecalis JF101 genome

2.3 苯酚降解基因及其功能分析

對菌株JF101降解苯酚的關(guān)鍵蛋白及其功能進(jìn)行注釋與分析，結(jié)果顯示菌株JF101有11個(gè)潛在的降解苯酚酶：GL?1751、GL?1752、GL?1755、GL?1756、GL1849、GL?1850、GL1851、GL1852、GL1853、GL1854、GL?1855。根據(jù)全基因序列的功能注釋，GL?1849為特異性調(diào)節(jié)蛋白，它對苯酚羥化酶基因的反向轉(zhuǎn)錄起到調(diào)節(jié)作用；GL?1850、GL1851、GL1852、GL1853、GL1854、GL?1855位點(diǎn)標(biāo)記的分別是苯酚羥化酶P0、P1、P2、P3、P4、P5蛋白，其中P2為羥化酶，P4為還原酶，其他3個(gè)為調(diào)節(jié)蛋白，它們共同組成一個(gè)多組分PH（苯酚羥化酶），分別由基因dmp?KLMNOP編碼，參與苯酚的羥基化生成鄰苯二酚。GL?1752位點(diǎn)標(biāo)記為C12O（鄰苯二酚1,2?雙加氧酶），催化鄰苯二酚轉(zhuǎn)化為順-順粘糠酸，啟動otho?通路。粘糠酸環(huán)異構(gòu)酶、粘內(nèi)脂D?異構(gòu)酶和3?氧代己二酸烯醇內(nèi)酯酶分別由GL?1751、GL?1756、GL?1755編碼，這些基因參與順-順粘糠酸轉(zhuǎn)化為（+）?粘糠酸內(nèi)脂、3?氧乙酸烯醇內(nèi)脂和丁二酸，最后進(jìn)入三羧酸循環(huán)。

將上述11個(gè)參與苯酚降解的蛋白通過BLAST軟件進(jìn)行氨基酸序列比對，表1顯示同源性最高的相關(guān)基因及菌株。在菌株JF101潛在的多組分PH中，GL?1849由MOPR基因編碼，該氨基酸序列與Sediminispirochaeta smaragdinae DSM 11293的MOPR氨基酸序列有47.9%的同源性，而PH（由dmp?KLMNOP基因編碼）與菌株P(guān)sychrobacter sp.和Alcaligenes faecalis的PH的同源性高達(dá)86.7%-100%。菌株JF101潛在的其他苯酚降解蛋白粘糠酸環(huán)異構(gòu)酶、粘內(nèi)脂D?異構(gòu)酶、3?氧代己二酸烯醇內(nèi)酯酶與比對蛋白具有很高的同源性（97%-100%），說明菌株JF101理論上通過otho?途徑降解苯酚。

表1 糞產(chǎn)堿桿菌JF101苯酚降解相關(guān)基因與其他細(xì)菌同源基因的同源性比較Table 1 Homology comparison of phenol degradation-related genes of A. faecalis JF101 and homologous genes in other bacteria

2.4 比較基因組學(xué)

為了對比研究相同菌屬菌株之間基因組的共性和差異性，選擇數(shù)據(jù)庫中公布了全基因組信息的5株糞產(chǎn)堿桿菌MUB14、P156、ZD02、c16和ASM96730v2進(jìn)行比較分析，結(jié)果如表2所示。6株菌的基因組大小為4.04-4.35 Mb，其中基因組最大的為MUB14，最小的為P156，編碼蛋白范圍為：3 616-3 973個(gè)，GC含量范圍為：56.3%-57.44%，rRNA與tRNA的數(shù)量相差不大。MUB14含有兩個(gè)分子量分別為0.04 Mb和0.06 Mb的質(zhì)粒，ZD02和ASM96730v2均含有一個(gè)0.01 Mb大小的質(zhì)粒，而菌株JF101與P156和 c16這2株菌株沒有質(zhì)粒。

表2 糞產(chǎn)堿桿菌基因組的基本特征Table 2 Basic characteristics of the genome of A. faecalis

基因家族統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明菌株JF101與5株糞產(chǎn)堿桿菌的共有同源基因家族有2 028個(gè)（圖5），說明這些基因家族成員的功能具有相似性。同時(shí)，JF101、MUB14和c16擁有5個(gè)特有基因家族，其他3株菌株沒有特有基因家族。基于Gene Family分析結(jié)果對上述6株糞產(chǎn)堿桿菌構(gòu)建進(jìn)化樹（圖6），糞產(chǎn)堿桿菌JF101與上述5株細(xì)菌都聚類到同一分支，說明這6株糞產(chǎn)堿桿菌有著共同的祖先，其中菌株JF101與c16的進(jìn)化關(guān)系最近，它們之間的遺傳變異度約為0.006，而與菌株MUB14、ZD02和ASM96730v2的遺傳變異度較大，約為0.024。

圖5 同源基因家族數(shù)目Venn圖Fig. 5 Venn diagram of the number of homologous gene families

圖6 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 6 Phylogenetic tree

2.5 菌株JF101潛在功能的挖掘

為了挖掘菌株JF101的耐鹽功能，通過基因功能注釋進(jìn)行分析，表3匯總了與細(xì)胞內(nèi)相容性溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因。其中K+transport system（K+轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)）包含Trk和Kdp系統(tǒng)，它們分別是組成型表達(dá)系統(tǒng)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控型系統(tǒng)；Proline and betaine transport（脯氨酸和甜菜堿轉(zhuǎn)運(yùn)）系統(tǒng)包含ProP系統(tǒng)，ProP系統(tǒng)在高滲條件下對積累脯氨酸和甜菜堿發(fā)揮著重要的作用；choline/glycine/proline betaine transport genes（膽堿/甘氨酸/脯氨酸甜菜堿轉(zhuǎn)運(yùn)基因）包含betT和betS基因，這些基因表明菌株JF101具有潛在的耐鹽能力?；谏鲜龌蚍治觯狙芯砍醪娇疾炝司暝邴}條件下的降解情況。發(fā)現(xiàn)JF101在無鹽和3% NaCl條件下，菌株10 h能完全降解50 mg/L苯酚，而在5% NaCl的條件下仍能獲得32.4%的降解率，說明菌株JF101具有一定的耐鹽性。

表3 菌株JF101與相容性溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的耐鹽基因Table 3 Salt-tolerant genes related to compatible solute transport in strain JF101

采用antisMASH分析的結(jié)果（圖7）表明，菌株JF101潛在有細(xì)菌素類基因簇和萜類基因簇。其中JF101中細(xì)菌素基因簇與貝氏芽孢桿菌FZB42的桿菌素生物合成基因簇的相似性為60%，與埃爾吉芽孢桿菌B69的嗜鐵素生物合成基因簇相似性為50%。另外菌株中萜類基因簇與金鏈球菌ATCC11523四氫嘧啶生物合成基因簇相似性最高，為75%。說明JF101具有合成桿菌素、嗜鐵素和四氫嘧啶等物質(zhì)的潛力。

圖7 糞產(chǎn)堿桿菌JF101次級代謝產(chǎn)物合成基因簇的序列比較Fig. 7 Sequence comparison of the JF101 secondary metabolite synthesis gene cluster in A. faecalis JF101

3 討論

生物降解是環(huán)境污染物轉(zhuǎn)化的根本途徑，本研究通過全基因組測序和生物信息學(xué)分析的方法，對1株糞產(chǎn)堿桿菌A.faecalis JF101進(jìn)行了苯酚降解基因解析和比較基因組學(xué)分析，為進(jìn)一步闡釋苯酚降解機(jī)制以及開展工程應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。JF101的基因組大小為4 143 816 bp，GC 含量為57.44%，共編碼3 804個(gè)編碼基因。在GO、COG、KEGG數(shù)據(jù)庫中分別有2 529、3 040、2 415個(gè)蛋白序列被注釋出了功能，在這些功能蛋白中被注釋最多的單元與新陳代謝相關(guān)，預(yù)示著其對多種污染物具有潛在的降解能力。研究發(fā)現(xiàn)，生物體的膜結(jié)構(gòu)會因?yàn)榉枷阕寤衔锏挠H脂性引起疏水作用而受到破壞［35］。細(xì)胞過程與信號傳導(dǎo)類注釋基因中細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的生物反應(yīng)基因較多，說明菌株JF101在生物膜形成方面具有較強(qiáng)的能力，并且對芳香族化合物的毒害作用具有潛在的耐受能力。同時(shí)，KEGG數(shù)據(jù)庫中注釋了42個(gè)與芳香族化合物的降解相關(guān)的基因，表明JF101對芳香族化合物具有降解能力。

通過基因功能注釋分析了菌株JF101潛在的苯酚降解酶，包括PH、C12O、粘糠酸環(huán)異構(gòu)酶、粘內(nèi)脂D?異構(gòu)酶和3?氧代己二酸烯醇內(nèi)酯酶，預(yù)示著菌株JF101通過otho?途徑降解苯酚。其中，由MOPR基因編碼的調(diào)節(jié)蛋白GL?1849是苯酚降解的正調(diào)控基因，此類正調(diào)控基因還包括dmpR、mphR、aphR等，它們編碼的調(diào)控蛋白屬于DmpR和XylR調(diào)控蛋白家族，能起始基因的轉(zhuǎn)錄［36-38］。而在C.testosteroni TA441和R5等苯酚降解菌中存在負(fù)調(diào)控基因aphS、phcS和phcT［39］。aphS位于正調(diào)控基因aphR基因的下游，苯酚存在時(shí)會完全抑制aphR蛋白激活的苯酚羥化酶的表達(dá)，使得菌株TA441不能以苯酚作為碳源生長［40］。苯酚羥化酶PH是啟動苯酚生物降解的第一步關(guān)鍵酶，盡管PH基因一般高度保守，所有多組分PH都由6個(gè)亞基組成，分別由KLMNOP基因編碼［41］，但是不同的菌株可能存在轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制上的差異，從而使得PH的活性產(chǎn)生不同，因此需要進(jìn)一步開展菌株JF101的代謝調(diào)控研究。

JF101與同屬的5株糞產(chǎn)堿桿菌基因組的基本特征存在一定的差異，表明不同菌株在進(jìn)化過程中會發(fā)生基因丟失或者獲得新的基因和質(zhì)粒，使得菌株之間在基因水平上逐漸出現(xiàn)差異［42］?；蚨鄻有允俏锓N進(jìn)化的結(jié)果，菌株JF101與5株糞產(chǎn)堿桿菌MUB14、P156、ZD02、c16和ASM96730v2具有2 028個(gè)共有同源基因家族，同源基因具有功能相似性［43］。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，MUB14具有降解多種物質(zhì)的基因，如三硝基甲苯、萘、雙酚A等［44］；P156能以煙酰胺作為唯一碳源生長［45］；ZD02可作為根結(jié)線蟲的生物殺蟲劑［46］，以及用于有機(jī)污染物和化學(xué)農(nóng)藥的降解［47］；c16具有異養(yǎng)硝化和好氧反硝化能力，能去除高濃度的氨氮［48］，由此推測菌株JF101在生物降解方面可能具有相似的功能或者可以作用相似的底物。在菌株JF101的KEGG功能注釋分析中，發(fā)現(xiàn)新陳代謝通路潛在有15個(gè)與氨代謝和6個(gè)與萘降解的相關(guān)基因。質(zhì)粒攜帶的遺傳信息能賦予生物體某些生物學(xué)性狀，有利于菌株在特定的環(huán)境條件下生存［49］。菌株JF101與菌株P(guān)156和菌株c16不含有質(zhì)粒，可能不具有某些生物學(xué)形狀，但是菌株JF101的特有基因數(shù)目多于其他5株菌株。在GO數(shù)據(jù)庫分析中，特有基因和非共有基因主要集中于未知功能、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性等過程，預(yù)示著菌株JF101可能具有某些潛在的功能，例如對次級代謝產(chǎn)物基因簇的分析發(fā)現(xiàn)菌株對萜類、細(xì)菌素類物質(zhì)有潛在的合成能力等。

研究表明，苯酚降解中間產(chǎn)物粘糠酸在高鹽條件下易于累積，導(dǎo)致產(chǎn)物抑制使得苯酚降解速率降低［50］，而大多數(shù)工業(yè)廢水中都含有可溶性無機(jī)鹽［51］，大部分微生物在鹽環(huán)境下常因滲透脅迫而受到抑制，甚至完全失活。面向?qū)嶋H廢水鹽條件而開展的功能挖掘，對進(jìn)一步發(fā)展菌株JF101的工程應(yīng)用非常有指導(dǎo)意義。通過全基因組分析，菌株JF101潛在有與細(xì)胞內(nèi)相容性溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因：Trk、Kdp、ProP系統(tǒng)和betT和betS基因，這些基因在高滲透壓的刺激下會轉(zhuǎn)運(yùn)K+、脯氨酸、甜菜堿和膽堿等物質(zhì)來調(diào)節(jié)細(xì)胞膨脹壓力，使細(xì)胞能快速適應(yīng)鹽分波動從而抵抗外界的高鹽環(huán)境。Tanudjaja等［52］發(fā)現(xiàn)嗜鹽菌株Escherichia coli K?12具有Trk型鉀離子（K+）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TrkG和TrkH，其中TrkH比TrkG更支持細(xì)胞生長，而TrkG能夠補(bǔ)充大腸桿菌中trkh介導(dǎo)的K+吸收的損失。在嗜鹽菌Halobacterium salinarum中，K+吸收系統(tǒng)編碼的KdpFABC基因表達(dá)嚴(yán)格依賴于生長培養(yǎng)基中的K+濃度，當(dāng)外源K+濃度為250 μmol/L-20 mmol/L時(shí)，kdpFABCQ操縱子呈中等水平表達(dá)；當(dāng)胞外K+濃度為20-250 μmol/L時(shí)表達(dá)顯著增加，并且在20 μmol/L時(shí)表達(dá)最強(qiáng)，說明K+濃度過高會抑制基因轉(zhuǎn)錄［53］。Souii等［54］發(fā)現(xiàn)甘氨酸甜菜堿可以保護(hù)Microbacterium metallidurans TL13免受高滲透脅迫，它主要由膽堿高親和性轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（BetT），膽堿脫氫酶（BetA）和甜菜堿醛脫氫酶（BetB）進(jìn)行作用合成。另外，試驗(yàn)初步證明了JF101具有一定的耐鹽性，目前文獻(xiàn)報(bào)道的降解苯酚的耐鹽菌或者嗜鹽菌有Arthrobacter sp.、Brachybacterium sp.、Halomonas sp.和Bacillus sp.［51］，這些苯酚降解菌大多數(shù)能夠在NaCl為1-10%的培養(yǎng)基中降解苯酚，如苯酚降解菌SASS1能夠在0-4% NaCl濃度范圍內(nèi)將1 500 mg/L苯酚完全降解［55］；Gong等［56］從沿海土壤分離出一株酵母菌SDP?1能夠在0-5% NaCl下有效去除苯酚；Zhang等［57］發(fā)現(xiàn)在3% NaCl下耐鹽菌株SAS26可以在60 h內(nèi)完全降解1 500 mg/L的苯酚，但是當(dāng)鹽度升高到4%-6%時(shí)苯酚降解率降低。然而，目前關(guān)于耐鹽并且能夠降解苯酚的糞產(chǎn)堿菌屬鮮見報(bào)道，菌株JF101的耐鹽功能為后續(xù)系統(tǒng)研究其耐鹽特性及作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)，研究認(rèn)為苯酚濃度和鹽度都會影響相關(guān)調(diào)控蛋白和代謝基因的表達(dá)，因此，菌株JF101的苯酚降解機(jī)制和耐鹽機(jī)制需要進(jìn)一步深入的研究，以充分開發(fā)利用菌株的生物功能價(jià)值。

4 結(jié)論

本研究對糞產(chǎn)堿桿菌JF101進(jìn)行了全基因組測序，獲得該菌株的完整基因組信息，并對其進(jìn)行了比較基因組學(xué)分析。在功能注釋基因中篩選和鑒定了與苯酚降解相關(guān)的基因。與耐鹽性質(zhì)相關(guān)的相容性溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)基因的挖掘和初步試驗(yàn)證明了菌株JF101具有耐鹽特性。