陶娜 李茂興 郭華春

（1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院薯類作物研究所，昆明 650201；2. 云南省薯類生物育種與良種繁育工程研究中心，昆明 650201）

甘薯（Ipomoea batatas L.）屬于雙子葉旋花科番薯屬，為一年或多年蔓生草本植物，是世界第六大主糧作物［1］。中國是全球最大的甘薯產(chǎn)區(qū)，總產(chǎn)量占全球60%以上［2-3］。甘薯的塊根和葉片均可食用，營養(yǎng)均衡［4］，塊根中富含碳水化合物（淀粉、單糖和膳食纖維）和多種功能活性物質(zhì)（類胡蘿卜素、花色苷、抗壞血酸），葉片中富含多種有益脂肪酸（ω-3類脂肪酸）和維生素，能夠作為能量和營養(yǎng)來源在人類飲食中發(fā)揮重要作用［5-6］，在保障區(qū)域糧食安全和擴大營養(yǎng)來源上具有較高的價值。甘薯植株生物量較高，生長適應(yīng)性強，利用現(xiàn)代生物技術(shù)開展種質(zhì)改良與創(chuàng)新，能進一步提高甘薯的應(yīng)用開發(fā)價值。建立遺傳轉(zhuǎn)化體系是實現(xiàn)甘薯遺傳改造的必要條件之一，目前主要采用基因槍法和根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）轉(zhuǎn)化法對其開展轉(zhuǎn)基因操作，但轉(zhuǎn)化再生周期長、成本高，且對基因型具有較強選擇性［7-8］。因此，建立更為高效快捷的甘薯轉(zhuǎn)基因體系對甘薯分子育種十分重要。

發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacterium rhizogenes）為根瘤菌科農(nóng)桿菌屬的革蘭氏陰性土壤細菌，能感染大多數(shù)雙子葉植物和少數(shù)單子葉植物以及個別裸子植物［9］，其含有Ri質(zhì)粒，侵染植物后能夠從植物外植體組織中快速誘導(dǎo)出大量毛狀根［10］，其發(fā)根原理是將Ri質(zhì)粒上的T?DNA通過侵染植物受傷部位的方式整合到植物基因組中進而誘導(dǎo)植物形成毛狀根。毛狀根是具有多分枝、無向地性、生長速度快、遺傳穩(wěn)定、具有激素自養(yǎng)等特性的不定根［11-12］。不同農(nóng)桿菌的Ri質(zhì)粒對不同植物、同一植物不同部位敏感性不同［13］，此外侵染時間等對發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)毛狀根也有著重要影響。轉(zhuǎn)基因體系常與基因工程方法，如過表達、基因沉默、基因編輯等技術(shù)相結(jié)合［14］。Otani等［15］利用發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化甘薯，通過對培養(yǎng)基的篩選，在供試材料10個品種中有5個品種獲得了完整植株的再生，較傳統(tǒng)育種相對節(jié)約時間。

因此，建立一個發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高效穩(wěn)定甘薯遺傳轉(zhuǎn)化體系顯得尤為重要。本研究對發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)甘薯毛狀根發(fā)根條件進行優(yōu)化分析，以便找到最佳發(fā)根誘導(dǎo)條件。在本研究中，以‘泰中6號’‘徐薯22’‘灰薯’‘1610’（品系）、‘YS’（品系）為試驗材料，通過篩選外植體和農(nóng)桿菌菌株、侵染時間等重要因素開展毛狀根誘導(dǎo)，建立發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘薯遺傳轉(zhuǎn)化體系，為后期開展甘薯特定基因功能鑒定和甘薯遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 以甘薯‘泰中6號’‘徐薯22’‘灰薯’‘1610’、‘YS’為試驗材料，試驗材料組培苗由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)薯類作物研究所提供。在MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)20-25 d后［培養(yǎng)條件：光照時間16 h/d，光照強度100 μmol/（m2·s），培養(yǎng)溫度（25±2）℃］，分別選取長勢良好植株（高度超過10 cm）上的葉片、葉柄和莖段為外植體材料；其中葉片選取完全舒展、嫩綠的葉片，莖段選取莖部節(jié)間，切除兩端腋芽。

1.1.2 發(fā)根農(nóng)桿菌菌株 Ar.1193、K599、C58C1、ArQual、MSU440（均購自上海唯地生物技術(shù)有限公司）。

1.1.3 試劑與相關(guān)培養(yǎng)基 卡那霉素（kanamycin,Kan）、鏈霉素（streptomycin, Strep）、頭孢噻肟（cefotaxime sodium, Cef）和MS Base Salts（購自北京酷來搏科技有限公司）、M519（購自PhytoTech LABS），植物表達載體pCAMBIA1301S為本實驗室保存，該載體含有35S啟動子，NOS 終止子。發(fā)根農(nóng)桿菌的培養(yǎng)采用TY培養(yǎng)基（3 g/L酵母提取物+5 g/L蛋白胨+10 μmol/L氯化鈣，pH 7.0），重懸液（M519+30 g/L蔗糖），共培養(yǎng)基（M519+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂+6?BA 0.1 mg/L+NAA 0.2 mg/L），毛狀根誘導(dǎo)培養(yǎng)基（M519+30 g/L蔗糖+6?BA 0.1 mg/L+NAA 0.2 mg/L＋200 mg/L Cef+7 g/L瓊脂），重懸液、培養(yǎng)基pH值調(diào)到5.8，然后高溫（121℃）滅菌20 min備用。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計及測定指標(biāo) 研究侵染時間、外植體類型、發(fā)根農(nóng)桿菌菌株對甘薯毛狀根誘導(dǎo)率的影響，采用 3×3×5 三因子完全隨機試驗設(shè)計，因子1為侵染時間：15、20、25 min；因子2為外植體類型：葉片、葉柄、莖段；因子3為發(fā)根農(nóng)桿菌菌株：Ar.1193、K599、C58C1、ArQual、MSU440；‘泰中6號’為試驗材料，每個處理20-25個外植體，3次重復(fù)。研究發(fā)根農(nóng)桿菌菌株與試驗材料對甘薯毛狀根誘導(dǎo)率的影響，采用5×5雙因子設(shè)計。毛狀根誘導(dǎo)率的計算公式如下：

毛狀根誘導(dǎo)率（%）=產(chǎn)生毛狀根的外植體數(shù)量/外植體總數(shù)量×100%。

產(chǎn)生與鑒定轉(zhuǎn)基因毛狀根，利用同源重組將目的基因與載體pCAMBIA1301S連接，獲得表達載體。表達載體轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞。以野生型菌株侵染的毛狀根作為陰性對照，并計算陽性轉(zhuǎn)化率，計算公式如下：

陽性轉(zhuǎn)化率（%）=陽性的毛狀根數(shù)量/外植體總數(shù)量×100%

1.2.2 菌株的選擇和活化 選取Ar.1193、K599、C58C1、ArQual、MSU440共5種野生型發(fā)根農(nóng)桿菌菌株進行測試。取保存的發(fā)根農(nóng)桿菌菌液，劃平板后挑取單菌落，分別接種至加有不同抗生素的 TY液體培養(yǎng)基中（表1）。在28℃，200 r/min的恒溫搖床中培養(yǎng)過夜，4 000 r/min離心10 min收集菌液，棄上清，加入等體積的重懸液，待侵染。

表1 發(fā)根農(nóng)桿菌類型及抗性Table 1 A. rhizogenes strains and their resistances

1.2.3 發(fā)根農(nóng)桿菌侵染液的制備 將?80℃冰箱保存的菌株在TY（100 mg/L Kan）固體培養(yǎng)基上涂板倒置培養(yǎng)48-72 h后，用滅菌的槍頭挑取陽性發(fā)根農(nóng)桿菌單菌落于1 mL TY（100 mg/L Kan）液體培養(yǎng)基中，28℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)約4 h，吸取100 μL活化的菌液于30 mL TY液體培養(yǎng)基中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，菌液OD600=0.8時，將其活化的菌液4 000 r/min離心15 min后去上清，用MS Base Salts液體培養(yǎng)基（含100 μmol/L 乙酰丁香酮）重懸菌體，即獲得侵染液。1.2.4 發(fā)根的誘導(dǎo) 取培養(yǎng)25 d左右的‘泰中6號’葉片、葉柄、莖段為外植體，在外植體表面用手術(shù)刀劃出傷口后分別浸入活化的Ar.1193、K599、C58C1、ArQual、MSU440菌液中搖晃15、20、25 min，然后用無菌濾紙吸干表面的菌液，接種于共培養(yǎng)基上25℃暗培養(yǎng)2-3 d 后，轉(zhuǎn)入毛狀根誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含200 mg/L Cef）。2-3周后統(tǒng)計誘導(dǎo)出的毛狀根數(shù)，計算誘導(dǎo)率。以‘泰中 6 號’篩選出適宜的外植體為莖段、適宜的侵染時間為20 min，在此基礎(chǔ)上分別取培養(yǎng)25 d左右的‘徐薯22’‘1610’‘灰薯’‘YS’的莖段在表面用手術(shù)刀劃出傷口后分別浸入以上5種活化的菌液中侵染 20 min，然后按上述方法培養(yǎng)并統(tǒng)計。

1.2.5 表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因毛狀根的檢測 設(shè)計HBFD1特異性引物分別通過PCR技術(shù)擴增目的基因cDNA，利用同源重組的方法將目的基因與載體pCAMBIA1301S連接，獲得表達載體。將35S::HBFD1、空載體表達載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化方法見上海唯地生物技術(shù)公司的感受態(tài)使用說明書。通過提取轉(zhuǎn)基因毛狀根DNA，目的基因設(shè)計引物，通過PCR檢測。

1.2.6 發(fā)根農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化方法見上海唯地生物技術(shù)公司的發(fā)根農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞使用說明書，從平板中挑選單克隆蘸入到1 mL TY液體培養(yǎng)基（100 mg/L Kan+100 mg/L Strep）中，28℃200 r/min搖菌4 h。挑取單克隆進行PCR鑒定獲得陽性克隆，搖菌后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 DNA提取和PCR檢測 用CTAB法提取培養(yǎng)的毛狀根DNA，用rolB基因檢測誘導(dǎo)出來的根是否為毛狀根，使用HBFD1基因進行PCR檢測確定目的基因是否整合到毛狀根中（表2）。

表2 引物列表Table 2 List of primers

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 采用Excel 進行試驗的數(shù)據(jù)記錄，采用SPSS分析軟件進行單方差分析（ANOVA），采用Photshop2021作圖。

2 結(jié)果

2.1 不同外植體對甘薯毛狀根誘導(dǎo)的影響

不同外植體對植物毛狀根的誘導(dǎo)能力存在差異。5種不同類型的發(fā)根農(nóng)桿菌Ar.1193、K599、C58C1、ArQual、MSU440均能誘導(dǎo)甘薯莖段發(fā)根且誘導(dǎo)率較高，葉片、葉柄為材料基本誘導(dǎo)不出毛狀根，適宜以莖切段為材料來誘導(dǎo)發(fā)根的形成（圖1）。

圖1 不同菌株誘導(dǎo)不同外植體對毛狀根的影響Fig. 1 Effects of different explants induced by different strains on hairy roots

2.2 侵染時間對毛狀根誘導(dǎo)率的影響

不同侵染時間對甘薯‘泰中6號’毛狀根的誘導(dǎo)能力存在差異。15、20、25 min三個不同侵染時間段都可以誘導(dǎo)出毛狀根，但侵染20 min時毛狀根誘導(dǎo)率相對較高（圖2）。

圖2 不同菌株和侵染時間對毛狀根影響Fig. 2 Effects of different strains and infection times on hairy roots

2.3 不同發(fā)根農(nóng)桿菌對甘薯莖段的誘導(dǎo)培養(yǎng)

5種發(fā)根農(nóng)桿菌菌株均可誘導(dǎo)5種甘薯莖段外植體產(chǎn)生發(fā)根，但是每個菌株對每種基因型誘導(dǎo)率間存在差異，侵染10 d左右切口處發(fā)出毛狀根。侵染18-21 d后發(fā)根布滿整個培養(yǎng)皿（圖3）。

圖3 不同菌株對不同甘薯品種（系）毛狀根誘導(dǎo)率Fig. 3 Hairy roots induction rates of different sweet potato varieties（lines） by different strains

2.4 不同甘薯品種（系）對發(fā)根誘導(dǎo)率影響

5種甘薯莖段都能誘導(dǎo)出毛狀根，但是不同基因型甘薯間也存在差異（圖4），其中‘徐薯22’‘泰中6號’ ‘1610’誘導(dǎo)率相對較高，‘灰薯’‘YS’誘導(dǎo)率較低。

圖4 不同甘薯品種（系）發(fā)根誘導(dǎo)率Fig. 4 Hairy root induction rates of different sweet potato varieties（lines）

2.5 發(fā)根農(nóng)桿菌類型和甘薯品種（系）對毛狀根誘導(dǎo)的影響

發(fā)根農(nóng)桿菌類型和甘薯品種（系）均顯著影響發(fā)根誘導(dǎo)率（表3）?！焓?2’的發(fā)根誘導(dǎo)率最高為79.63%，其適宜菌株為MSU440；‘泰中6號’的發(fā)根誘導(dǎo)率最高為59.19%,適宜菌株為K599;‘1610’的發(fā)根誘導(dǎo)率為最高為57.16%，適宜菌株為C58C1;‘YS’的發(fā)根誘導(dǎo)率最高為25.43%，適宜菌株為K599；‘灰薯’的發(fā)根誘導(dǎo)率最高為20.0%，適宜菌株為C58C1。

表3 發(fā)根農(nóng)桿菌類型和甘薯品種（系）對毛狀根誘導(dǎo)率Table 3 Type of Agrobacterium rhizogenes and sweet potato varieties（lines）%

不同甘薯品種（系）用5種菌平均發(fā)根誘導(dǎo)率為：‘徐薯22’＞‘泰中6號’＞‘1610’＞‘灰薯’＞‘YS’。不同發(fā)根農(nóng)桿菌菌株在5個品種中平均發(fā)根誘導(dǎo)率為：K599＞ArQual＞C58C1＞MSU440＞Ar.1193。

2.6 毛狀根、轉(zhuǎn)基因毛狀根PCR鑒定結(jié)果

以T?DNA上的rolB基因為檢測對象，提取甘薯毛狀根和未轉(zhuǎn)化的甘薯根的DNA進行PCR擴增，通過與DNA分子量標(biāo)記和農(nóng)桿菌陽性對照的比較，可以確定甘薯毛狀根DNA中含有rolB基因的片段，證實了這是由發(fā)根農(nóng)桿菌產(chǎn)生的毛狀根（圖5）。在優(yōu)化的毛狀根誘導(dǎo)體系上，為進一步驗證HBFD1外源基因是否整合到發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)形成的甘薯毛狀根基因組中，另外提取轉(zhuǎn)了質(zhì)粒的毛狀根DNA，并用特異性引物PCR進行檢測。提取了84個毛狀根，有32個毛狀根有目標(biāo)基因，毛狀根轉(zhuǎn)基因率為38.1%，擴增出基因片段符合大小，部分轉(zhuǎn)基因毛狀根示意圖如圖6所示。

圖5 甘薯毛狀根rolB基因PCR檢測圖Fig. 5 PCR detection of rolB gene in sweet potato hairyroots

圖6 甘薯毛狀根HBFD1基因PCR檢測圖Fig. 6 PCR detection of HBFD1 gene in sweet potato hairyroots

3 討論

發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系具有簡便性和高效性，適用于轉(zhuǎn)化周期長、轉(zhuǎn)化難度大的植物，本研究使優(yōu)化的體系簡單易行且發(fā)根可靠性強。發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立受許多因素的影響，包括菌株類型、外植體類型、植物基因型等［10］。發(fā)根農(nóng)桿菌侵染甘薯莖段之后，在其侵染部位產(chǎn)生大量生長迅速、多分支、沒有向地性的發(fā)根，在無外源激素的培養(yǎng)基中能正常生長并且不出現(xiàn)退化的情況，從形態(tài)學(xué)的角度可以鑒定是發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)產(chǎn)生的毛狀根［16］。不足之處為誘導(dǎo)出的毛狀根存在一定的假陽性率，所以從分子生物學(xué)上用PCR檢測是必要的。

外植體類型是毛狀根遺傳轉(zhuǎn)化過程中的一大重要因素。發(fā)根農(nóng)桿菌對外植體的發(fā)根誘導(dǎo)有一定的選擇性［17］。本研究中用葉片、葉柄、莖段作為外植體，盡管發(fā)根農(nóng)桿菌類型在誘導(dǎo)毛狀根上存在一定的差異，但是不管用哪種菌株只有莖段可以誘導(dǎo)出毛狀根，葉片、葉柄都不能誘導(dǎo)毛狀根。與之相似，吳飛等［18］在發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)甘薯發(fā)根條件的優(yōu)化中表明，莖段是最合適的外植體。不同的是吳飛等［18］用葉片、葉柄誘導(dǎo)時可以誘導(dǎo)出少量毛狀根，本文中葉片、葉柄誘導(dǎo)不出毛狀根，可能與甘薯品種（系）、發(fā)根農(nóng)桿菌類型有關(guān)。此外，Huang等［19］以莖段為外植體成功建立了發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的狗牙根轉(zhuǎn)化體系。

侵染時間對毛狀根誘導(dǎo)率有一定的影響［20］。農(nóng)桿菌侵染過程中，侵染時間影響著發(fā)根農(nóng)桿菌侵染外植體并吸附在外植體上的效率［21］。侵染時間過長或過短都會影響毛狀根誘導(dǎo)率，影響轉(zhuǎn)化，適宜的侵染時間有利于發(fā)根農(nóng)桿菌對植物轉(zhuǎn)化，從而提高轉(zhuǎn)化率。本研究中侵染莖段20 min可達最佳誘導(dǎo)效果，為79.63%。龐濱等［22］在非洲菊毛狀根轉(zhuǎn)化上，外植體在發(fā)根農(nóng)桿菌液中侵染20 min可達最佳誘導(dǎo)效果，誘導(dǎo)率為86.7%。侵染時間過長或過短都不利于毛狀根的轉(zhuǎn)化，而在20 min左右誘導(dǎo)效果最好［23］。

植物基因型是影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的主要因素［24］，說明品種（系）的選擇是建立發(fā)根體系的關(guān)鍵因素，本試驗結(jié)果也證實了這一點?！焓?2’‘泰中6號’‘1610’這3個品種（系）不論用哪種菌株誘導(dǎo)率都比‘YS’‘灰薯’高。這表明不同基因型材料會影響毛狀根的誘導(dǎo)，此結(jié)論與向潤等［25］研究相符，基因型不同誘導(dǎo)率不同。侵染能力會因植物種類的不同而有差別，某一基因型甚至有可能限制住發(fā)根農(nóng)桿菌的侵染能力［23］。

發(fā)根農(nóng)桿菌菌株影響發(fā)根，菌株的選擇也是轉(zhuǎn)化成功與否的重要因素［26］。發(fā)根農(nóng)桿菌具有廣泛的宿主植物細胞，菌株不同，對植物毛狀根的誘導(dǎo)能力也不同［27］。‘徐薯22’‘泰中6號’‘1610’‘YS’‘灰薯’最適宜發(fā)根農(nóng)桿菌分別為MSU440、K599、C58C1、K599、C58C1。由此可見，本研究所用方法簡單可行，為甘薯毛狀根基因功能驗證提供一定基礎(chǔ)。不同發(fā)根農(nóng)桿菌菌株對不同植物的發(fā)根能力也各不相同，邊慧慧等［28］分別利用Ar Qual、MSU440、C58C1、K599對番茄進行侵染，最后得到Ar Qual對番茄毛狀根誘導(dǎo)率最高可達90.4%，證明不同發(fā)根農(nóng)桿菌對植物的侵染能力各不相同。

已有研究報道了甘薯快速遺傳轉(zhuǎn)化的方法，利用發(fā)根農(nóng)桿菌或者根癌農(nóng)桿菌侵染莖段，無需組培就可以獲得轉(zhuǎn)基因甘薯。Zhang等［29］開發(fā)了一種高效的發(fā)根農(nóng)桿菌K599介導(dǎo)的方法，避免了組織培養(yǎng)的需要，可以用于快速獲得轉(zhuǎn)基因甘薯植株，用于生物技術(shù)和研究。Cao等［30］用一種發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的無需組培快速獲得轉(zhuǎn)基因甘薯的高效方法，CBD傳遞系統(tǒng)。Liu等［31］通過直接注射根癌農(nóng)桿菌來傳遞基因，認為發(fā)根農(nóng)桿菌K599轉(zhuǎn)化效率不高，發(fā)根農(nóng)桿菌和根癌農(nóng)桿菌具體的作用機理、轉(zhuǎn)化效率需要進一步探索。本研究運用組培方法，適用于大規(guī)模生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因毛狀根。后期會借鑒無需組培即可獲得轉(zhuǎn)基因甘薯的方法，對此體系進行優(yōu)化。

4 結(jié)論

本研究建立了發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘薯遺傳轉(zhuǎn)化體系，不同甘薯品種（系）適宜的發(fā)根農(nóng)桿菌類型不同。以‘ 泰 中 6 號 ’為試驗材料篩選出最適宜發(fā)根的外植體為莖段，最佳侵染時間是20 min。在此基礎(chǔ)上以莖段為外植體，侵染另外4種甘薯品種20 min，其中用MSU440侵染‘徐薯 22’莖段獲得毛狀誘導(dǎo)率最高為79.63%。。