黃佳艷 馮小艷 沈林波 王文治 胡海燕 張樹珍

（1. 海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院，海口 570228；2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，?？?571101）

植物病程相關(guān)蛋白（pathogenesis related pro?teins, PRs）是一類在植物受到逆境脅迫后誘導(dǎo)產(chǎn)生并積累的蛋白質(zhì)的總稱［1］。根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和生物活性等特征，將PR蛋白分成17個家族，即PR1-PR17［2］。其中PR10是一類分子量小、等電點(diǎn)呈酸性、無信號肽的胞內(nèi)蛋白［3］。PR10蛋白不僅參與植物對炎熱、寒冷、干旱、鹽堿、細(xì)菌、真菌等逆境脅迫的響應(yīng)，還在植物抵抗病毒侵染過程中發(fā)揮重要作用［1-3］。辣椒（Capsicum annuum）CaPR10蛋白受煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）誘導(dǎo)表達(dá)水平顯著升高并發(fā)生磷酸化，增強(qiáng)了CaPR10的核酸酶活性，促使CaPR10對入侵的病毒RNA進(jìn)行切割，從而達(dá)到抗病毒的作用［4］。煙草（Nicotiana tabacum）NtPR10基因應(yīng)答TMV侵染，感、抗煙草品種在感染TMV后，其NtPR10表達(dá)水平整體呈現(xiàn)相反的變化趨勢，表明NtPR10可能在TMV侵染過程中發(fā)揮作用［5］。岷江百合（Lilium regale）編碼的LrPR10基因受黃瓜花葉病毒（Cucu?mber mosaic virus, CMV）誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，接種CMV 4 d后，LrPR10的表達(dá)水平達(dá)到最大值，為處理前的58倍，表明LrPR10可能在岷江百合抗CMV防御反應(yīng)中發(fā)揮作用［6］。煙草NbPR10a基因受煙草曲莖病毒（Tobacco curly shoot virus, TbCSV）誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，在煙草植株中沉默NbPR10a基因?qū)е耇bCSV積累量顯著增加，表明NbPR10a具有抵抗TbCSV侵染的作用［7］。

甘蔗（Saccharum spp.）是重要的糖料作物和能源作物，甘蔗糖約占我國食糖總產(chǎn)量的90%［8-9］。甘蔗線條花葉病毒（Sugarcane streak mosaic virus,SCSMV）是引起甘蔗花葉病的主要病原之一，其侵染甘蔗導(dǎo)致葉片褪綠斑駁、植株矮化、分蘗變少，繼而影響甘蔗的品質(zhì)和產(chǎn)量［10-11］。SCSMV在我國各大蔗區(qū)廣泛分布，對我國甘蔗產(chǎn)業(yè)的發(fā)展造成嚴(yán)重威脅［11］。其隸屬馬鈴薯Y 病毒科（Potyviridae）禾本科病毒屬（Poacevirus），基因組大小約10 kb，編碼1個多聚蛋白，該蛋白進(jìn)一步被蛋白酶水解成11個成熟的功能蛋白，從N端到C端依次是P1、HC?Pro、P3、P3N?PIPO、6K1、CI、6K2、VPg、NIa?Pro、NIb和CP［12-14］。其中，P1蛋白是RNA沉默抑制子，能夠抑制寄主的RNA沉默防御機(jī)制，從而幫助SCSMV成功侵染寄主［14-15］。

本課題組在前期研究中，以SCSMV編碼的P1蛋白為誘餌，采用酵母雙雜交（yeast two hybrid,Y2H）技術(shù)篩選獲得一個與SCSMV P1蛋白互作的甘蔗PR10蛋白，命名為ShPR10［15］。在本研究中，首先利用同源克隆技術(shù)克隆ShPR10基因的完整開放閱讀框（open reading frame, ORF）序列，并對其編碼蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)和亞細(xì)胞定位分析；然后利用Y2H和雙分子熒光互補(bǔ)（bimolecular fluorescence complementation, BiFC）技術(shù)驗(yàn)證ShPR10與SCSMV P1的互作關(guān)系；最后采用農(nóng)桿菌共浸潤瞬時表達(dá)系統(tǒng)和Western blot技術(shù)分析ShPR10對SCSMV P1沉默抑制子活性的影響。研究結(jié)果揭示ShPR10在甘蔗應(yīng)答SCSMV侵染過程中的作用，為甘蔗抗SCSMV育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 甘蔗品種為ROC22，種植于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所海南文昌試驗(yàn)基地。野生型本氏煙草（Nicotiana benthamiana）種植于相對濕度60%、光照16 h/d、溫度25℃的培養(yǎng)箱中。

1.1.2 主要試劑 EZNA Plant RNA Kit購自O(shè)mega BIO?TEK公司；RevertAid First?Strand cDNA Synthesis Kit購自Thermo Scientific公司；Nimble Cloning試劑盒購自海南壹田生物科技有限公司；HiPure Gel Pure DNA Mini Kit購自Magen公司；2× Magic Green Taq Mix購自TOLOBIO公司；大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Y2H Gold酵母（Saccharomyces cerevisiae）感受態(tài)細(xì)胞和農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101感受態(tài)細(xì)胞購自上海唯地生物技術(shù)有限公司；Bsa I內(nèi)切酶、2× EasyClone Mix和pBWA（V）HS?ccdB載體購自武漢伯遠(yuǎn)生物科技有限公司；pNC?GADT7、pNC?BiFC?Ecn、pNC?BiFC?Enn、pNC?Cam33FN和pNC?Cam33HN載體由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所言普研究員饋贈；P1?18T、ShPR10?18T、GFP?18T、pGBKT7?P1和pCam3304?35S?GFP質(zhì)粒為課題組構(gòu)建并保存。

1.1.3 主要儀器 Biometra TAdvanced PCR儀購自德國Analytikjena公司；瓊脂糖凝膠電泳儀購自美國Bio?Rad公司；凝膠成像分析儀器購自上海天能科技有限公司；LSM800激光共聚焦顯微鏡購自德國卡爾蔡司光學(xué)有限公司；長波紫外燈購自上海路陽儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取和cDNA第一鏈合成 稱取 0.1 g ROC22葉片，用液氮研磨成粉末，按照EZNA Plant RNA Kit說明書的步驟提取甘蔗總RNA。cDNA第一鏈合成用RevertAid First?Strand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行，產(chǎn)物置于?20℃保存。

1.2.2 ShPR10基因的克隆及生物信息學(xué)分析 以酵母雙雜交文庫篩選獲得的ShPR10基因序列和NCBI數(shù)據(jù)庫中玉米（Zea mays, EU976710.1）、野生二粒小麥（Triticum dicoccoides, XM_037558368）及一粒小麥（Triticum monococcum, JX424309.1）的PR10序列為參考，設(shè)計(jì)ShPR10基因ORF序列的特異擴(kuò)增引物ShPR10?F和ShPR10?R（表1）。以ROC22葉片cDNA為模板，參照馮小艷等［16］的方法克隆ShPR10基因，并送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

表1 本研究使用的引物Table 1 Primers used in this study

利用ProtParam（http://expasy.org/tools/protparam.html）預(yù)測ShPR10編碼蛋白的理化性質(zhì)；利用NP?SA?PRABI（https://www.so.com/s?ie=utf?8&src=360se7_addr&q=NPSA?PRABI）、TMHMM 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）和 SignalP 5.0（http://www.cbs.dtu.dk /services /Signal P/）分別預(yù)測ShPR10的二級結(jié)構(gòu)、跨膜特性和信號肽；利用Blastp在線工具查找ShPR10的同源氨基酸序列，使用DNAMAN軟件進(jìn)行同源氨基酸序列比對分析，并使用MEGA 11.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.2.3 ShPR10的亞細(xì)胞定位 以GFP?18T質(zhì)粒為模板，GFP?p?F和GFP?p?R（表1）為引物擴(kuò)增綠色熒光蛋白GFP基因。以ShPR10?18T質(zhì)粒為模板，ShPR10?p?F和ShPR10?p?R（表1）為引物擴(kuò)增ShPR10基因。兩個基因擴(kuò)增產(chǎn)物分別通過瓊脂糖凝膠電泳后，切下目的條帶置于同一EP管中進(jìn)行回收?；厥债a(chǎn)物與經(jīng)Bsa I酶切線性化的pBWA（V）HS?ccdB載體進(jìn)行重組，重組體系：線性化的pBWA（V）HS?ccdB載體5 μL，回收產(chǎn)物5 μL，2× EasyClone Mix 10 μL，37℃反應(yīng)30 h獲得重組質(zhì)粒pBWA（V）HS?GFP?ShPR10。將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，參考尹夢瑩等［17］的方法進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染實(shí)驗(yàn)，將帶有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌注入本氏煙草葉片，48 h后在激光共聚焦顯微鏡下觀察葉片中熒光蛋白的位置。

1.2.4 Y2H驗(yàn)證ShPR10與SCSMV P1的互作 以ShPR10?18T質(zhì)粒為模板，ShPR10?JT?F和ShPR10?JT?R（表1）為引物擴(kuò)增ShPR10基因。按照Nimble Cloning試劑盒說明將ShPR10基因連接到pNC?GADT7載體上，獲得獵物質(zhì)粒pNC?GADT7?ShPR10。將獵物質(zhì)粒pNC?GADT7?ShPR10與課題組保存的誘餌質(zhì)粒pGBKT7?P1共同轉(zhuǎn)化Y2H Gold酵母菌株，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于SD/?Trp/?Leu平板上，28℃培養(yǎng)至長出單菌落。挑取單菌落于SD/?Trp/?Leu液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600值為1.0，用ddH2O將菌液進(jìn)行10倍系列稀釋，取4 μL分別點(diǎn)到SD/?Trp/?Leu和SD/?Trp/?Leu/?His/?Ade/X-α-Gal平板上，3-5 d后觀察菌落生長情況。以pGBKT7?53 和 pGADT7?T 組合為陽性對照，pGBKT7?Lam 和pGADT7?T 組合為陰性對照，pGBKT7 和pNC?GADT7?ShPR10組合、pGBKT7?P1和pNC?GADT7 組合為自激活驗(yàn)證。

1.2.5 BiFC驗(yàn)證ShPR10與SCSMV P1的互作 以P1?18T質(zhì)粒為模板，P1?JT?F和P1?JT?R（表1）為引物擴(kuò)增P1基因。以ShPR10?18T質(zhì)粒為模板，ShPR10?JT?F和ShPR10?JT?R1（表1）為引物擴(kuò)增ShPR10基因。參照Nimble Cloning試劑盒說明將ShPR10和P1基因分別連接到pNC?BiFC?Ecn和pNC?BiFC?Enn載體上，獲得重組質(zhì)粒pNC?BiFC?Ecn?ShPR10和pNC?BiFC?Enn?P1。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入GV3101農(nóng)桿菌，參照朱海龍等［18］的方法將含有pNC?BiFC?Ecn?ShPR10和pNC?BiFC?Enn?P1的農(nóng)桿菌等比例混合后注射本氏煙草葉片，48 h后在激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。以pNC?BiFC?Ecn和pNC?BiFC?Enn?P1組合、pNC?BiFC?Ecn?ShPR10和pNC?BiFC?Enn組合為對照。

1.2.6 ShPR10對SCSMV P1沉默抑制子活性的影響 以P1?18T質(zhì)粒為模板，P1?JT?F和P1?JT?R1（表1）為引物擴(kuò)增P1基因。以ShPR10?18T質(zhì)粒為模板，ShPR10?JT?F和ShPR10?JT?R（表1）為引物擴(kuò)增ShPR10基因。按照Nimble Cloning試劑盒說明將P1和ShPR10基因分別連接到植物表達(dá)載體pNC?Cam33FN（帶Flag標(biāo)簽）和pNC?Cam33HN（帶HA標(biāo)簽），獲得重組質(zhì)粒pNC?Cam33FN?P1和pNC?Cam33HN?ShPR10。將pNC?Cam33FN?P1、pNC?Cam33HN?ShPR10和課題組保存的pCam3304?35S?GFP質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化GV3101農(nóng)桿菌。參考Chen等［19］方法將攜帶pCam3304?35S?GFP、pNC?Cam33FN?P1和pNC?Cam33HN?ShPR10質(zhì)粒的3種農(nóng)桿菌等比例混合后注射本氏煙草葉片，以攜帶pCam3304?35S?GFP、pNC?Cam33FN?P1和pNC?Cam33HN空質(zhì)粒的3種農(nóng)桿菌混合注射為對照。此外，為了說明ShPR10本身不具有沉默抑制子的活性，將攜帶pCam3304?35S?GFP、pNC?Cam33HN?ShPR10和pNC?Cam33FN空質(zhì)粒的3種農(nóng)桿菌混合注射煙草葉片。注射4 d后，在長波紫外燈下觀察注射區(qū)域GFP的熒光強(qiáng)度并采用數(shù)碼相機(jī)拍照記錄。在紫外燈下剪下注射區(qū)域的煙草葉片，參考Chen等［19］方法進(jìn)行總蛋白提取和Western blot檢測GFP、P1和ShPR10蛋白的表達(dá)水平，使用Image J軟件對蛋白條帶進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果

2.1 ShPR10基因的克隆

以甘蔗ROC22葉片cDNA為模板，ShPR10?F和ShPR10?R為引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得一條600 bp左右的條帶（圖1?A），與預(yù)期大小相符?；厥赵摋l帶將其連接至T載體并送測序。結(jié)果（圖1?B）顯示，克隆獲得甘蔗ShPR10基因的完整ORF，其長度為570 bp，編碼189個氨基酸，其氨基酸序列中含有以“GxGGxG”為特征的P?loop基序。

2.2 ShPR10序列分析

ProtParam分析表明，ShPR10的分子量為21.17 kD，等電點(diǎn)為4.77，為酸性蛋白；不穩(wěn)定系數(shù)為70.86，為不穩(wěn)定蛋白；脂溶指數(shù)為48.47，總平均親水性是?0.93，可能是親水性蛋白。NPSA?PRABI預(yù)測表明（圖2），ShPR10中無規(guī)則卷曲占比為51.85%，α-螺旋占比為35.98%，延伸鏈占比為7.41%，β-轉(zhuǎn)角占比為4.76%。TMHMM 2.0分析表明（圖3），ShPR10蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)域。SignalP 5.0分析表明（圖4），ShPR10蛋白不含信號肽，是非分泌蛋白。

圖2 ShPR10蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig. 2 Secondary structure prediction of ShPR10 protein

圖3 ShPR10蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig. 3 Transmembrane structure prediction of ShPR10 protein

圖4 ShPR10蛋白信號肽預(yù)測Fig. 4 Signal peptide prediction of ShPR10 protein

氨基酸序列同源比對分析結(jié)果（圖5）顯示，甘蔗ShPR10與玉米ZmPR10、柳枝稷（Panicum virgatum）PvPR10、普通小麥（Triticum aestivum）TaPR10、光稃稻（Oryza glaberrima）OgPR10、短花稻（Oryza brachyantha）ObPR10、多年生黑麥草（Lolium perenne）LpPR10、烏拉爾圖小麥（Triti?cum urartu）TuPR10、硬直黑麥草（Lolium rigidum）LrPR10和野生二粒小麥TdPR10的氨基酸序列具有較高相似度，分別為91.53%、82.01%、76.56%、76.50%、76.17%、75.92%、75.52%、75.13%和72.40%。為進(jìn)一步分析甘蔗ShPR10蛋白與其他物種PR10蛋白的進(jìn)化關(guān)系，使用MEGA 11.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果（圖6）表明，甘蔗ShPR10蛋白與玉米ZmPR10的親緣關(guān)系最近。

圖5 甘蔗ShPR10與其他物種PR10的氨基酸序列比對Fig. 5 Amino acid sequence alignment between ShPR10 protein from sugarcane and PR10 from other species

圖6 甘蔗ShPR10與其他物種PR10蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig. 6 Phylogenetic tree analysis of ShPR10 protein from sugarcane and PR10 proteins from other species

2.3 ShPR10的亞細(xì)胞定位

將GFP基因融合在ShPR10基因的5′端，成功構(gòu)建亞細(xì)胞定位載體pBWA（V）HS?GFP?ShPR10。將該載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)侵染煙草表皮細(xì)胞，在激光共聚焦顯微鏡下觀察GFP?ShPR10融合蛋白的綠色熒光在煙草細(xì)胞內(nèi)的分布情況。結(jié)果（圖7）顯示，綠色熒光主要分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，表明ShPR10主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。

圖7 ShPR10在本氏煙草表皮細(xì)胞中的定位Fig. 7 Localization of ShPR10 in N. benthamiana epidermal cells

2.4 ShPR10與SCSMV P1的互作驗(yàn)證

Y2H試驗(yàn)結(jié)果顯示（圖8），所有組合在SD/?Trp/?Leu培養(yǎng)基上正常生長，表明所有組合均成功轉(zhuǎn)化酵母菌。轉(zhuǎn)入pGBKT7和pNC?GADT7?ShPR10組合、pGBKT7?P1 和pNC?GADT7組合的酵母菌與陰性對照組（pGBKT7?Lam和 pGADT7?T組合）一樣，在SD/?Trp/?Leu/?His/?Ade/X-α-Gal培養(yǎng)基上不生長，表明pNC?GADT7?ShPR10和pGBKT7?P1質(zhì)粒無自激活活性。轉(zhuǎn)入pGBKT7?P1和pNC?GADT7?ShPR10組合的酵母菌和陽性對照（pGBKT7?53和 pGADT7?T組合）一樣在SD/?Trp/?Leu/?His/?Ade/X-α-Gal培養(yǎng)基上長出藍(lán)色菌落，表明ShPR10在酵母細(xì)胞中與P1互作。

圖8 Y2H驗(yàn)證ShPR10與SCSMV P1的互作Fig. 8 Verification of the interaction between ShPR10 and SCSMV P1 by Y2H assay

BiFC試驗(yàn)結(jié)果顯示（圖9），含pNC?BiFC?Ecn?ShPR10和pNC?BiFC?Enn?P1質(zhì)粒的農(nóng)桿菌共注射煙草，在煙草細(xì)胞中產(chǎn)生綠色熒光信號，而陰性對照組（pNC?BiFC?Ecn和pNC?BiFC?Enn?P1組合、pNC?BiFC?Ecn?ShPR10和pNC?BiFC?Enn組合）無熒光信號。以上結(jié)果表明ShPR10和P1在煙草細(xì)胞中互作。

圖9 BiFC驗(yàn)證ShPR10與SCSMV P1的互作Fig. 9 Verification of the interaction between ShPR10 and SCSMV P1 by BiFC assay

2.5 ShPR10對SCSMV P1沉默抑制子活性的影響

為了分析ShPR10對P1沉默抑制子活性的影響，將攜帶pCam3304?35S?GFP、pNC?Cam33FN?P1和pNC?Cam33HN?ShPR10質(zhì)粒的3種農(nóng)桿菌混合后共注射本氏煙草葉片，以攜帶pCam3304?35S?GFP、pNC?Cam33FN?P1和pNC?Cam33HN空質(zhì)粒的3種農(nóng)桿菌共注射為對照，注射4 d后在紫外燈下觀察GFP熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示，對照組注射區(qū)域表現(xiàn)出很強(qiáng)的GFP熒光（圖10?A，右下），證明P1具有沉默抑制子活性，而pCam3304?35S?GFP、pNC?Cam33FN?P1和pNC?Cam33HN?ShPR10共注射區(qū)域的GFP熒光強(qiáng)度明顯減弱（圖10?A，左下），表明ShPR10削弱了P1的沉默抑制子活性。此外，為了說明ShPR10本身不具有沉默抑制子活性，將攜帶pCam3304?35S?GFP、pNC?Cam33HN?ShPR10和pNC?Cam33FN空質(zhì)粒的3種農(nóng)桿菌共注射煙草葉片，結(jié)果觀察到非常微弱的GFP熒光（圖10?A，上中），說明ShPR10不具有沉默抑制子活性。

圖10 ShPR10對SCSMV P1沉默抑制子活性的影響Fig. 10 Effect of ShPR10 on the activity of SCSMV P1 silencing suppressor

Western blot檢測注射區(qū)域的蛋白水平（圖10?B）顯示，pCam3304?35S?GFP、pNC?Cam33FN?P1和pNC?Cam33HN?ShPR10共注射區(qū)域的GFP蛋白水平低于對照組，這與圖10?A中該區(qū)域的GFP熒光強(qiáng)度弱于對照組的結(jié)果相一致。Flag抗體檢測P1蛋白水平，結(jié)果顯示該區(qū)域中P1的蛋白水平與對照組相比無明顯差異。HA抗體檢測ShPR10蛋白水平，結(jié)果顯示該區(qū)域ShPR10正常表達(dá)。以上結(jié)果說明，ShPR10的表達(dá)削弱了P1的沉默抑制子活性，但對P1蛋白的含量無明顯影響。

3 討論

3.1 ShPR10具有PR10的基本特征和P?loop基序

PR10蛋白具有分子量在17-22 kD、等電點(diǎn)呈酸性、不含信號肽、定位于胞內(nèi)等特征［3,20］。本研究克隆獲得的甘蔗ShPR10基因，其編碼蛋白分子量為21.17 kD，等電點(diǎn)為4.77，無信號肽，定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，符合PR10的基本特征。大部分PR10蛋白含有一個以“GxGGxG”為序列特征的P?loop基序，該基序與核酸酶活性密切相關(guān)［1］。從草莓（Fragaria ananassa）［21］、辣椒［4］、葡萄（Vitis vini?fera L.）［22］、玉米［23］、花生（Arachis hypogaea L.）［24］、牛茄子（Solanum surattense）［25］、麻風(fēng)樹（Jatropha curcas）［26］和可可樹（Theobroma cacao）［27］中分離到的PR10蛋白都具有一個P?loop基序，體外實(shí)驗(yàn)也都證實(shí)這些PR10蛋白具有核酸酶活性。PR10的核酸酶活性對于植物抵御病原微生物入侵至關(guān)重要。辣椒CaPR10具有核酸酶活性，能對入侵的病毒RNA進(jìn)行切割，從而起到抗病毒的作用［4］。可可樹利用其編碼蛋白TcPR10的核酸酶活性降解可可叢枝病菌（Moniliophthora perniciosa）的RNA，從而發(fā)揮抗菌作用［27］?；ㄉ鶤hPR10具有核酸酶活性，能抑制尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）和立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）的生長，將AhPR10的第54位氨基酸由賴氨酸突變成天冬酰胺后，AhPR10的核酸酶活性和抗菌作用均消失，表明AhPR10的核酸酶活性對其抗菌作用至關(guān)重要［24］。本研究從甘蔗中克隆獲得的ShPR10基因，其編碼蛋白含有一個P?loop基序，推測該蛋白具有核酸酶活性，可能在甘蔗抵抗病原微生物入侵過程中發(fā)揮作用。

3.2 ShPR10定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核

PR10蛋白家族成員眾多，在亞細(xì)胞水平的分布也多種多樣［3］。例如，辣椒［28］、玉米［23］和大豆（Glycine max）［29］編碼的PR10蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)中；楊樹（Populus simonii×P. nigra）［30］和剛毛檉柳（Tamarix hispida）［31］編碼的PR10蛋白定位在細(xì)胞核上；人參（Panax ginseng C. A. Meyer）編碼的PgPR10?1蛋白在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有分布［32］；葡萄編碼的VpPR10.2蛋白主要分布在細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)和葉綠體，在細(xì)胞核中也有少量分布［22］；花旗松（Pseudotsuga menziesii）編碼的DF?PR10蛋白定位在細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)中［33］；罌粟（Papaver somniferum）編碼的PR10蛋白Ps?NCS2定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上［34］。本研究對甘蔗ShPR10蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，結(jié)果顯示ShPR10定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，與人參PgPR10?1蛋白的亞細(xì)胞定位相同。蛋白的功能與其所在的亞細(xì)胞位置密切相關(guān)，相同亞細(xì)胞定位的PR10蛋白可能行使相似的生物學(xué)功能。人參PgPR10?1蛋白能增強(qiáng)植株對假單胞菌（Pseudomonas syringae）、尖孢鐮刀菌和貴腐霉菌（Botrytis cinerea）的抗性［32］，由此推測甘蔗ShPR10蛋白可能也具有抗菌活性。

3.3 ShPR10與SCSMV P1互作并削弱P1的沉默抑制活性

RNA沉默是植物抵抗病毒侵染的重要機(jī)制［35］。為了對抗這一機(jī)制，病毒進(jìn)化出RNA沉默抑制子來干擾植物的RNA沉默［36］。而植物又可通過其編碼蛋白與病毒RNA沉默抑制子相互作用，削弱抑制子的沉默抑制活性，進(jìn)而增強(qiáng)植株對病毒的抗性［19,37-38］。例如，玉米編碼的紫黃質(zhì)脫環(huán)氧化酶ZmVDE與甘蔗花葉病毒（Sugarcane mosaic virus,SCMV）編碼的HC?Pro抑制子互作并削弱HC?Pro的抑制子活性，從而減少SCMV在植物體內(nèi)的積累［19］；煙草編碼的鈣調(diào)素樣蛋白rgs?CaM與多種病毒編碼的RNA沉默抑制子的dsRNA結(jié)合區(qū)域結(jié)合，并通過自噬樣蛋白降解途徑降解RNA沉默抑制子，從而削弱RNA沉默抑制子的活性，增強(qiáng)寄主對病毒的抗性［37］；甜橙（Citrus sinensis）編碼的脫水素蛋白CtCOR15與柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus,CTV）編碼的p20抑制子互作，CtCOR15蛋白的表達(dá)削弱了p20的沉默抑制活性［38］。本課題組前期以SCSMV編碼的RNA沉默抑制子P1為誘餌，從甘蔗cDNA文庫中篩選獲得一個與P1互作的甘蔗ShPR10蛋白［15］。本研究利用Y2H和BiFC技術(shù)進(jìn)一步證實(shí)了P1和ShPR10的互作關(guān)系。此外，本研究還分析了ShPR10對P1沉默抑制活性的影響，結(jié)果顯示ShPR10的表達(dá)削弱了P1的沉默抑制活性，但對P1蛋白的含量無明顯影響，表明ShPR10不是通過改變P1蛋白的含量來影響P1的沉默抑制活性。RNA沉默抑制子可以通過結(jié)合siRNA、dsRNA和RNA沉默通路上的關(guān)鍵蛋白來發(fā)揮其抑制作用，ShPR10與P1的互作可能阻礙了P1與siRNA、dsRNA和RNA沉默通路蛋白的結(jié)合，從而削弱P1的沉默抑制活性［39］。

4 結(jié)論

從甘蔗葉片中克隆獲得ShPR10基因的完整ORF，其編碼蛋白含有一個P?loop基序，分子量為21.17 kD，等電點(diǎn)為4.77，無信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域，定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。ShPR10與SCSMV編碼的P1蛋白互作，ShPR10的表達(dá)削弱了P1的沉默抑制子活性，但對P1蛋白的含量無明顯影響。