CRISPR/Cas系統(tǒng)能夠直接用于基因組編輯、基因調(diào)控和其他各種應(yīng)用。一方面，是由于其效應(yīng)核酸內(nèi)切酶的可編程性;另一方面，是由于具有不同特性的Cas核酸酶的不斷發(fā)現(xiàn)，具體體現(xiàn)在不同的靶向性（DNA或RNA）、不同的PAM識別譜、不同的最佳溫度和能夠降低脫靶傾向等特點的Cas核酸酶的發(fā)現(xiàn)。因此，大量的工作集中在擴大已知的CRISPR-Cas亞型的數(shù)量，以識別具有新特性的核酸酶。然而，新出現(xiàn)的證據(jù)表明，在每個亞型中，也存在著令人難以置信的多樣性。我們卻對它們知之甚少。

Cas12a（也稱為Cpf1）核酸酶是V-A亞型CRISPR/Cas系統(tǒng)的典型代表，與其他已知的Cas核酸酶相比，Cas12a核酸酶具有獨特的性質(zhì)。具體表現(xiàn)在將轉(zhuǎn)錄的CRISPR序列加工形成gRNA的過程中，不需要輔助因子（如：tracrRNA）;識別富含T的PAM序列;利用一個RuvC核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域切割兩條目標DNA鏈;能非特異性的識別位于靶位點上的單鏈DNA。

近日，北卡羅萊納州立大學的Chase L. Beisel研究團隊，在Nucleic Acids Research上在線發(fā)表題為“Characterization of Cas12a nucleases reveals diverse PAM profles between closely-related orthologs ”的研究論文，揭示了選擇壓力促使Cas12a識別的PAM序列的多樣化，即使是同源的CRISPR核酸酶之間和變構(gòu)體之間也具有不同的特性，拓展了可用于CRISPR技術(shù)的核酸酶種類。

本研究系統(tǒng)描述了6個Cas12a核酸酶的特征，包括彼此之間具有高度相似性或具有良好的核酸酶的核酸酶。發(fā)現(xiàn)6個Cas12a核酸酶能夠處理和利用彼此的gRNAs進行DNA靶向，盡管它們在明顯的DNA裂解活動和PAM偏好上存在差異，且與它們的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系無關(guān)。進一步研究來自Prevotella ihumii （PiCas12a）和Prevotella disiens（PdCas12a）的兩個Cas12a核酸酶發(fā)現(xiàn)，盡管它們具有95.7%的同源性，但它們識別的PAM譜卻驚人地不同。此外，將PiCas12a突變?yōu)镻dCas12a，可以發(fā)現(xiàn)PAM的識別譜與PiCas12a或PdCas12a相關(guān)的識別譜之間存在差異。

值得注意的是本研究主要的研究手段是利用無細胞的TXTL檢測系統(tǒng)來進行PAM識別譜的鑒定。該系統(tǒng)利用商業(yè)化的Escherichia coli的裂解液，快速的表達Cas12a蛋白，同時，構(gòu)建N5 PAM的庫與相應(yīng)的靶標gRNA，將其混合在29°C的條件下孵育16小時，后建庫并通過二代測序技術(shù)，確定N5 PAM被切割的情況，最終確定特定物種的Cas12a蛋白的PAM識別譜。