馬賽買 李同源 馬燕軍 韓富軍 彭海 孔維寶

（1. 西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蘭州 730070; 2. 甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院林果花卉研究所，蘭州 730070）

隨著農(nóng)作物種植結(jié)構(gòu)和模式的不斷變化，其受到病蟲害威脅的情況也愈發(fā)嚴(yán)重。病蟲害對(duì)農(nóng)作物的品質(zhì)、產(chǎn)量和安全造成了嚴(yán)重影響，進(jìn)而直接影響著我國(guó)的農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和人民的生活物資保障及食品安全。一方面，一些作物害蟲如麥種蠅、草地貪夜蛾等，植物病害如土傳病害、根腐病害等已經(jīng)嚴(yán)重危害農(nóng)作物的生產(chǎn)［1-4］。例如，由煙粉虱通過(guò)傳播病毒引起番茄卷曲病及致病疫霉菌（Phytophthora infestans）引起的番茄晚疫病導(dǎo)致番茄的產(chǎn)量下降了20%-100%［5-6］；植物寄生線蟲已對(duì)全球農(nóng)業(yè)造成嚴(yán)重危害，其通過(guò)破壞種類繁多的農(nóng)作物、水果和蔬菜來(lái)影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)［7-8］；根結(jié)線蟲每年會(huì)導(dǎo)致韓國(guó)番茄產(chǎn)量有30%-40%的損失，已成為該國(guó)番茄生產(chǎn)的主要問(wèn)題［9］。由鐮刀菌屬（Fusarium）和絲囊菌（Aphanomyces euteiches）引起的豌豆土傳病害根腐病，導(dǎo)致豌豆的生產(chǎn)面積下降［10］；干腐病是馬鈴薯貯藏期間最嚴(yán)重的病害，尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）和燕麥鐮刀菌（F. avenaceum）是引起干腐病的主要病原菌，其造成的馬鈴薯減產(chǎn)嚴(yán)重時(shí)可達(dá)60%［11］；鐮孢炭疽菌（Colletotrichum falcatum）引起的紅腐病是影響甘蔗生產(chǎn)的一種嚴(yán)重秸稈病害［12］；土傳真菌Stromatinia cepivora引起的白腐病對(duì)洋蔥和大蒜作物生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害［13］。另一方面，化學(xué)農(nóng)藥一般被認(rèn)為是抑制病蟲害的可靠選擇，但是過(guò)量使用化學(xué)農(nóng)藥會(huì)導(dǎo)致土壤和水體的污染，也會(huì)直接或間接地危害人體健康［14］。研究顯示人體長(zhǎng)期暴露于亞致死量的化學(xué)殺蟲劑下，會(huì)導(dǎo)致一些慢性病的發(fā)生，如癌癥，生殖、腎臟和呼吸系統(tǒng)疾病等［15］。

生物防治是一種直接利用有益微生物或微生物代謝產(chǎn)物來(lái)防治有害生物的方法，因其對(duì)人畜安全、不污染環(huán)境且防治病蟲害效果顯著、持久等優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注［16-18］。生物防治可以利用天敵控制病蟲害，包括以蟲治蟲即利用天敵昆蟲來(lái)防治害蟲，如肉食性瓢蟲捕食蚜蟲；也包括以菌治蟲即利用真菌（如金龜子綠僵菌Metarhizium anisopliae）、細(xì)菌（如蘇云金桿菌Bacillus thuringiensis）和病毒（如核型多角體病毒NPV、顆粒體病毒GV、細(xì)小病毒CPV）及其代謝產(chǎn)物防治害蟲；同時(shí)還可以以菌（拮抗菌）治病，如利用枯草芽孢桿菌（B. subtilis）產(chǎn)生的枯草菌素防治灰霉病。由于對(duì)環(huán)境友好型產(chǎn)品的需求日益增長(zhǎng)，生物源殺蟲劑、殺菌劑以及植物保護(hù)劑等已被廣泛應(yīng)用，以減少對(duì)化學(xué)農(nóng)藥的使用，減輕對(duì)環(huán)境和人畜的直接和潛在危害［19-23］。

幾丁質(zhì)（chitin）是一種僅次于纖維素的第二大多糖，廣泛分布于真菌細(xì)胞壁、節(jié)肢動(dòng)物角質(zhì)層、圍食膜以及軟體動(dòng)物殼中［24］。幾丁質(zhì)酶（chitinase）是一種廣泛分布于古菌、細(xì)菌、真菌、高等植物及動(dòng)物中的糖苷水解酶，對(duì)含有幾丁質(zhì)的真菌、昆蟲及其幼蟲等病原體的生長(zhǎng)和發(fā)育具有抑制作用［14］，同時(shí)也能夠水解天然高聚物，如幾丁質(zhì)、殼聚糖、脂質(zhì)寡糖、肽聚糖、阿拉伯半乳聚糖和含有N?乙酰葡糖胺的糖蛋白［25］。幾丁質(zhì)在多種植物病原體細(xì)胞中的廣泛分布提示我們幾丁質(zhì)酶在病蟲害綜合防控中有可能作為有潛力的生物殺蟲和殺菌劑，而且目前的研究也發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶可同時(shí)防治有害昆蟲、真菌和線蟲［26-28］。本文總結(jié)了幾丁質(zhì)酶的分類、來(lái)源及其應(yīng)用于農(nóng)作物病蟲害防治的生防機(jī)理和策略等，以期為幾丁質(zhì)酶在農(nóng)作物病蟲害生物防治中的研究和應(yīng)用開發(fā)提供有價(jià)值的信息參考。

1 幾丁質(zhì)酶的分類

根據(jù)作用方式不同，幾丁質(zhì)酶可分為內(nèi)切酶（endochiyinases，E.C 3.2.1.14）和外切酶（exochitinases，EC 3.2.1.52），其中幾丁質(zhì)外切酶可以分為幾丁質(zhì)水解酶（E.C 3.2.1.29）和β-1,4?葡萄糖苷酶（E.C 3.2.1.30）。幾丁質(zhì)內(nèi)切酶隨機(jī)裂解幾丁質(zhì)鏈內(nèi)部，生成具有可溶性且分子量低的N?乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）多聚體，如幾丁四糖、幾丁三糖、幾丁二糖；幾丁質(zhì)外切酶催化幾丁質(zhì)鏈的非還原端，可連續(xù)去除GlcNAc單體［29］。

根據(jù)催化結(jié)構(gòu)域的類型，幾丁質(zhì)酶可分為兩大類糖基水解酶（glycosyl hydrolases，GH）家族，即GH18和GH19家族。GH18家族的幾丁質(zhì)酶具有典型的（β/α）8磷酸丙糖異構(gòu)酶桶狀折疊結(jié)構(gòu)，其催化結(jié)構(gòu)域具有［DN］G［LIVMF］［DN］［LIVMF］［DN］xE、Y［DN］和SxGG等高度保守區(qū)域。前兩個(gè)區(qū)域參與底物輔助催化機(jī)制，第3個(gè)區(qū)域參與底物結(jié)合［30-31］。GH19家族的幾丁質(zhì)酶富含α-螺旋結(jié)構(gòu)，采用單置換催化機(jī)制，并以保守區(qū)域［FHY］GRG［AP］xQ［IL］［ST］［FHYW］［HN］［FY］NY和L（x）9LV（x）12W［FY］W為表征，形成底物結(jié)合區(qū)［32］。

根據(jù)幾丁質(zhì)酶在基因序列、氨基酸組成和保守基序分布的差異，可將其分為五類。I類、II類和IV類幾丁質(zhì)酶含有GH19結(jié)構(gòu)域作為催化結(jié)構(gòu)域，GH18結(jié)構(gòu)域存在于III類和V類幾丁質(zhì)酶中［33-34］。I類和IV類幾丁質(zhì)酶在N端幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和催化結(jié)構(gòu)域的存在下結(jié)構(gòu)相似，但I(xiàn)V類幾丁質(zhì)酶由于缺失這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域而導(dǎo)致長(zhǎng)度較短。I類和II類幾丁質(zhì)酶具有序列同源性，但I(xiàn)I類幾丁質(zhì)酶缺乏N端幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，III類和V類幾丁質(zhì)酶中也不存在幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。III類幾丁質(zhì)酶具有溶菌酶活性，其特征是存在C端延伸［35］。III類和V類幾丁質(zhì)酶廣泛分布于真菌、病毒和高等植物中，I類、II類和IV類幾丁質(zhì)酶大多來(lái)自細(xì)菌，有少數(shù)也存在于高等植物中［25］。

2 幾丁質(zhì)酶的來(lái)源

幾丁質(zhì)酶來(lái)源廣泛，主要包括細(xì)菌、真菌、病毒和植物，另外，基于特殊環(huán)境的宏基因組來(lái)源的幾丁質(zhì)酶也受到廣泛關(guān)注。附表1總結(jié)了幾丁質(zhì)酶的來(lái)源、催化特性、生化特征及生防信息。

2.1 細(xì)菌幾丁質(zhì)酶

大多數(shù)細(xì)菌幾丁質(zhì)酶屬于GH18家族，但放線菌（Actinomycetes）和紫細(xì)菌（purple bacteria）中一些幾丁質(zhì)酶屬于GH19家族，隸屬于上述兩個(gè)家族的酶在序列、三維結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制方面有一定的差異［29,31］。細(xì)菌幾丁質(zhì)酶的GH18家族根據(jù)其催化域的結(jié)構(gòu)相似性進(jìn)一步分為A、B、C三個(gè)亞族［31］。B亞族和C亞族僅在少數(shù)細(xì)菌中被發(fā)現(xiàn)，但A亞族的成員在自然界中分布廣泛［36-37］。后者的特征是存在幾丁質(zhì)插入結(jié)構(gòu)域，它是一個(gè)存在于磷酸丙糖異構(gòu)酶桶中的小α+β結(jié)構(gòu)域，有助于結(jié)合長(zhǎng)鏈底物及提高酶的加工能力［31,38］。

迄今為止，大多數(shù)細(xì)菌幾丁質(zhì)酶都來(lái)自于水生和陸生生境中可培養(yǎng)的幾丁質(zhì)降解微生物，這些微生物從含有幾丁質(zhì)底物（膠體幾丁質(zhì)）的固體培養(yǎng)基中分離出來(lái)［39］，然后在同源宿主菌中對(duì)酶基因進(jìn)行克隆、表達(dá)、純化后再做表征［40］，一般優(yōu)選大腸桿菌（Escherichia coli）作為宿主［41］。在革蘭氏陰性菌中，黏質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）被認(rèn)為是降解幾丁質(zhì)的有效菌之一，并被用作研究幾丁質(zhì)酶作用機(jī)理的模式菌株［38］。S. marcescens的幾丁質(zhì)酶降解機(jī)制包括屬于GH18家族的幾丁質(zhì)酶ChiA、ChiB、ChiC和ChiD（圖1）［38］，以及屬于GH20家族的裂解多糖單加氧酶CBP21和β-己糖胺酶［38,42］。在一些細(xì)菌中，如豚鼠氣單胞菌（Aeromonas caviae），其幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生的復(fù)雜性更大，因?yàn)椴煌膸锥≠|(zhì)酶可以通過(guò)不同的轉(zhuǎn)錄模式從同一基因產(chǎn)生［43］。楊紹青團(tuán)隊(duì)克隆了來(lái)自Paenibacillus xylanexedens Z2?4 的幾丁質(zhì)酶基因PxChi52，并在E.coli中進(jìn)行了表達(dá)，該P(yáng)xChi52酶對(duì)灰霉菌（Botrytis cinerea）、核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）及蘋果腐爛病菌（Valsa mali）有很強(qiáng)的抗菌活性，可抑制立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）和六出花鏈格孢（Alternaria alstroemeriae）的菌絲生長(zhǎng)［44］。

圖1 黏質(zhì)沙雷氏菌18家族幾丁質(zhì)酶的結(jié)構(gòu)概述Fig. 1 Structural overview of the family 18 chitinases of S. marcescens

2.2 真菌幾丁質(zhì)酶

真菌幾丁質(zhì)酶大多屬于GH18家族，但來(lái)自家蠶微孢子蟲的幾丁質(zhì)酶NbChiA屬于GH19家族。NbchiA總共包含9個(gè)α螺旋（圖2?A），在其分子表面有一個(gè)深的裂隙，可能在底物結(jié)合中起作用［45］（圖2?B）。GH18家族的真菌幾丁質(zhì)酶根據(jù)其序列相似性、底物結(jié)合裂縫結(jié)構(gòu)和酶活性分為A、B和C亞族［46］。但真菌GH18家族幾丁質(zhì)酶的亞群與細(xì)菌GH18家族幾丁質(zhì)酶的亞族并非對(duì)應(yīng)關(guān)系。與細(xì)菌一樣，真菌幾丁質(zhì)酶也可能具有多種結(jié)構(gòu)域［30］。

圖2 NbchiA的三維模型Fig. 2 Three-dimensional model of NbchiA

幾丁質(zhì)酶在調(diào)節(jié)真菌細(xì)胞分裂、生長(zhǎng)和形態(tài)發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮著主要作用。所有真菌中都具有幾種不同的幾丁質(zhì)酶活性，其中包括絲狀真菌，而酵母細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)含量通常低于絲狀真菌，因此，酵母基因組編碼的幾丁質(zhì)酶的數(shù)量較少［46］。絲狀真菌，如木霉（Trichoderma）、青霉（Penicillium）、脈孢菌（Neurospora）、毛霉（Mucor）、曲霉（Aspergillus）、耳霉屬（Conidiobolus）以及白僵菌屬（Beauveria）菌株可以分泌不同的幾丁質(zhì)酶，其中大多數(shù)酶是真菌寄生所必需的。作為寄生病原真菌的哈茨木霉（T. harzianum）和綠色木霉（T. viride）中的幾丁質(zhì)酶分解機(jī)制是由多個(gè)細(xì)胞外GH18幾丁質(zhì)酶類協(xié)同作用［47］，來(lái)自T. viride中的一種混合物被發(fā)現(xiàn)含有4種不同的幾丁質(zhì)酶，能夠破壞家蠶的圍食膜［26］。值得注意的是，真菌保護(hù)自身免受內(nèi)源性幾丁質(zhì)酶的降解作用機(jī)理還有待深入研究。研究發(fā)現(xiàn)在Trichoderma中，幾丁質(zhì)酶參與真菌寄生、外源幾丁質(zhì)原纖維的分解以及自溶和細(xì)胞壁的再循環(huán)；在健康的菌絲中，幾丁質(zhì)受到細(xì)胞壁中蛋白質(zhì)的保護(hù)，而這種保護(hù)功能在真菌寄生攻擊、菌絲老化和自溶過(guò)程中會(huì)部分喪失［48］。

盡管真菌幾丁質(zhì)酶在真菌生命周期和生物相互作用中具有重要作用，但根據(jù)BRENDA酶數(shù)據(jù)庫(kù)中的信息，沉積的真菌幾丁質(zhì)酶序列數(shù)量約多于細(xì)菌幾丁質(zhì)酶的10%，這表明真菌幾丁質(zhì)酶的分子研究可能遠(yuǎn)落后于對(duì)細(xì)菌幾丁質(zhì)酶的認(rèn)識(shí)。

2.3 病毒幾丁質(zhì)酶

目前已知的幾種病毒幾丁質(zhì)酶均屬于GH18家族，它們的功能是通過(guò)削弱宿主屏障結(jié)構(gòu)，促進(jìn)病毒感染或從受感染細(xì)胞中釋放新生病毒。已知的病毒幾丁質(zhì)酶來(lái)源為Epinotia aporema granulovirus［49］、菜青蟲顆粒體病毒（Pieris rapae granulosisvirus，PrGV）［50］、Autographa californica nucleopolyhedrovirus、Cydia pomonella granulovirus［51］以及思茅松毛蟲的核型多角體病毒［52］，其中來(lái)自于思茅松毛蟲的幾丁質(zhì)酶被證明具有很強(qiáng)的殺蟲活性。在轉(zhuǎn)基因煙草中提取純化出的一種核型多角體病毒幾丁質(zhì)酶（rChiA），可增強(qiáng)幼蟲圍食膜的滲透性，且能抑制鏈格孢菌（A. alternata）的孢子萌發(fā)和生長(zhǎng)，因此rChiA可作為生態(tài)友好的抑制劑應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中［53］。

2.4 植物幾丁質(zhì)酶

植物幾丁質(zhì)酶為內(nèi)切幾丁質(zhì)酶類，屬于GH19家族，分子量在25-36 kD之間，它們根據(jù)來(lái)源有堿性與酸性之分。植物幾丁質(zhì)酶主要存在于單子葉和雙子葉植物中，如水稻、馬鈴薯、胡蘿卜、草莓、番茄等［54］。當(dāng)有病原體攻擊時(shí)，植物幾丁質(zhì)酶作為自衛(wèi)酶釋放病原響應(yīng)蛋白，部分蛋白在鹽濃度增加、寒冷和干旱脅迫條件下才會(huì)表達(dá)。植物容易受到病原真菌和有害昆蟲的侵害，但許多植物因含有幾丁質(zhì)酶而能夠拮抗病原真菌和有害昆蟲。許多幾丁質(zhì)酶已從不同的植物中分離純化出來(lái)，對(duì)植物病原真菌表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗菌活性［55］。

從大麥中提取的35 kD重組幾丁質(zhì)酶對(duì)植物病原真菌番茄早疫病菌（A. solani）、鐮刀菌（Fusarium）、立枯絲核菌（R. solani）和黃萎病菌（Verticillium）有顯著的抑制作用［56］。大麥幾丁質(zhì)酶基因可用于甘蔗抗真菌植株的培育，轉(zhuǎn)基因甘蔗SCT?15和SCT?20在體外生物測(cè)定中對(duì)接種的鐮形刺盤孢菌（C.falcatum）表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗性，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)基因植株依舊可以健康生長(zhǎng)和保持綠色，而對(duì)照組在感染C. falcatum后第3周明顯變黃并最終導(dǎo)致植株死亡［57］。蛾豆來(lái)源的幾丁質(zhì)酶可拮抗病原真菌，從尖葫蘆中分離提取的幾丁質(zhì)酶對(duì)黑曲霉（A. niger）和Trichoderma均有抑菌作用［58-59］。

2.5 宏基因組幾丁質(zhì)酶

21世紀(jì)以來(lái)，研究者從GH18或GH19家族催化結(jié)構(gòu)域的保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，開始對(duì)不同生境的微生物幾丁質(zhì)酶降解群落進(jìn)行了基于序列的多樣性分析，揭示了陸地和生態(tài)系統(tǒng)中幾丁質(zhì)酶編碼基因的群落結(jié)構(gòu)以及未開發(fā)幾丁質(zhì)酶的多樣性［36］。幾丁質(zhì)降解細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)分布及其相對(duì)豐度對(duì)于環(huán)境的變化（如營(yíng)養(yǎng)或pH值）均具有一定響應(yīng)［37,60］。在富含幾丁質(zhì)的土壤中，幾丁質(zhì)酶基因的豐度隨著幾丁質(zhì)的添加而升高，幾丁質(zhì)降解細(xì)菌的活性也顯著增強(qiáng)［61］。抑制性和富集性土壤被第一次用于尋找?guī)锥≠|(zhì)酶的宏基因組研究，因此無(wú)需培養(yǎng)微生物即可獲得整個(gè)群落的環(huán)境DNA［62-63］。

2014年研究人員從瑞典烏普薩拉農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田的抑制卷心菜植物病原體的土壤中分離獲得第一個(gè)宏基因組來(lái)源的幾丁質(zhì)酶［27-28］，該幾丁質(zhì)酶Chi18H8屬于GH18家族，對(duì)植物病原體禾谷鐮刀菌（F. graminearum）、尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）和膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）具有抗菌活性。Dai等［64］使用膠體幾丁質(zhì)作為底物，從青藏高原微生物宏基因組中發(fā)現(xiàn)了一種新的幾丁質(zhì)酶（P1724），并在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)。P1724在系統(tǒng)發(fā)育上與其他用于研究的幾丁質(zhì)酶差異較大，包含兩個(gè)GH18家族的催化結(jié)構(gòu)域。Li等［65］從福建漳州市紅樹林土壤的宏基因組中克隆出一種幾丁質(zhì)酶基因（ChiT?7），該基因編碼一種含有381個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，不僅與GH18家族幾丁質(zhì)酶有一定的序列相似性，且還表現(xiàn)出廣泛的pH和溫度穩(wěn)定性。通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育分析和氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，ChiT?7酶屬于GH18家族。在極端環(huán)境中生存的大多數(shù)微生物，無(wú)法在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行培養(yǎng)，這就降低了發(fā)現(xiàn)新型幾丁質(zhì)酶的概率，但是基于宏基因組的方法無(wú)需經(jīng)過(guò)微生物的純培養(yǎng)便可在基因庫(kù)中進(jìn)行功能篩選。因此，宏基因組方法在未來(lái)生物技術(shù)應(yīng)用上有較大潛力。

3 幾丁質(zhì)酶對(duì)農(nóng)作物病原真菌和昆蟲的生防機(jī)理及防治策略

3.1 病原真菌的生防機(jī)理及防治策略

大多數(shù)農(nóng)作物病害由真菌引起，而幾丁質(zhì)是真菌細(xì)胞壁的重要組成部分，因此產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株能夠通過(guò)降解病原真菌的細(xì)胞壁進(jìn)而抑制其繁殖與生長(zhǎng)，幾丁質(zhì)酶抗病原真菌的潛力取決于真菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)（圖3）［66］?，F(xiàn)有研究主要集中于產(chǎn)酶微生物對(duì)植物病原真菌的抑制作用，試圖用生物殺菌劑替代化學(xué)制劑從而減少化學(xué)農(nóng)藥對(duì)環(huán)境的危害［67］。

圖3 真菌細(xì)胞壁的一般結(jié)構(gòu)Fig. 3 General structure of the fungal cell wall

Yan等［68］從畢赤酵母（Pichia pastoris）中純化出重組表達(dá)的水稻幾丁質(zhì)酶，該酶能有效抑制匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）和B. cinerea的生長(zhǎng)，但對(duì)A. niger和瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）無(wú)明顯抑制作用。水稻幾丁質(zhì)酶之所以表現(xiàn)出不同的抗真菌活性，是由于真菌的微結(jié)構(gòu)表面和細(xì)胞壁中幾丁質(zhì)的比例不同。當(dāng)以鱗片狀結(jié)構(gòu)的排列方式允許幾丁質(zhì)纖維束暴露在真菌細(xì)胞壁表面時(shí)，幾丁質(zhì)酶更有可能與真菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)相互作用。Berini等［27］通過(guò)對(duì)土壤抑菌宏基因組生成的fosmid文庫(kù)進(jìn)行功能篩選時(shí)發(fā)現(xiàn)了一種新型抗真菌幾丁質(zhì)酶Chi18H8，該酶對(duì)F. graminearum和茄絲核菌（Thanatephorus）具有抗菌活性，且具有耐溶劑性和在酸性環(huán)境中能夠長(zhǎng)期穩(wěn)定存在等特點(diǎn)。Moka等［69］從洋蔥種植區(qū)分離出一株Trichoderma，對(duì)該分離株進(jìn)行幾丁質(zhì)酶活性篩選，發(fā)現(xiàn)它能有效抑制洋蔥作物中由F. oxysporum引起的枯萎病。Asif等［70］從巴基斯坦當(dāng)?shù)貪O港收集的樣本中分離出7種可產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的細(xì)菌，通過(guò)菌絲抑制法發(fā)現(xiàn)可有效抑制真菌細(xì)胞壁的生長(zhǎng)。Akram等［71］從存放魚類的土壤中分離、鑒定出一種新的能夠合成高活性幾丁質(zhì)酶的細(xì)菌菌株（Acinetobacter indicus CCS?12），純化后的酶對(duì)一些植物病原菌具有明顯的抗真菌活性。Sarker等［72］從不同農(nóng)業(yè)生態(tài)區(qū)種植的番茄根際土壤中共分離到160株天然熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens），并從中篩選出兩株產(chǎn)酶活性較高的菌株FPK22和FPK4，田間實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這兩株菌對(duì)番茄和辣椒的防治效果分別為69.2%和62%。上述研究表明，不同來(lái)源的幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌主要通過(guò)降解植物病原真菌細(xì)胞中的幾丁質(zhì)來(lái)抑制病原菌的生長(zhǎng)，從而起到一定的靶向防控作用。而且，具有高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的拮抗菌對(duì)不同植物病原真菌表現(xiàn)出一定的廣譜拮抗性。

3.2 蟲害的生防機(jī)理及防治策略

對(duì)于昆蟲來(lái)說(shuō)，圍食膜和外骨骼（圖4）［66］起著理化屏障的作用以防止環(huán)境危害和天敵捕食。圍食膜和外骨骼由幾丁質(zhì)、蛋白質(zhì)、脂類、兒茶酚胺代謝產(chǎn)物和微量礦物質(zhì)組成。昆蟲由于脫皮液中幾丁質(zhì)酶的作用，可周期性地脫去舊的外骨骼和圍食膜并重新合成新的外骨骼，脫皮液積累在舊角質(zhì)層與表皮的中間及腸道組織中，含有GlcNAc的水解產(chǎn)物最終會(huì)被回收用于合成新的角質(zhì)層［73］。

圖4 昆蟲體內(nèi)存在幾丁質(zhì)層（角質(zhì)層和腸道）Fig. 4 Presence of chitin layers（cuticle and gut）in case of insects

Tu等［74］從工蜂腸道中分離出產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的S.marcescens，并對(duì)其防治西方蜜蜂的寄生螨進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室效果評(píng)價(jià)，研究表明細(xì)菌培養(yǎng)上清液和硫酸銨沉淀收集的蛋白質(zhì)對(duì)雌螨有較強(qiáng)的殺滅作用（5 d內(nèi)的死亡率為100%），其中幾丁質(zhì)酶可能直接通過(guò)外骨骼起到殺蟲作用。Zhong等［75］從土壤中分離出Pseudomonas sp. TXG6?1，并純化出52 kD的幾丁質(zhì)酶（PsChiC），僅用PsChiC對(duì)斜紋夜蛾沒有明顯的殺蟲作用，但在斜紋夜蛾核型多角體病毒存在下，PsChiC對(duì)斜紋夜蛾的殺蟲作用明顯增強(qiáng)。Suganthi等［76］從P. fluorescens中純化并制備出一種幾丁質(zhì)酶，將酶噴灑在受控環(huán)境中的新鮮茶樹嫩枝上，然后讓昆蟲在嫩枝上取食，觀察到96 h內(nèi)茶蚊的死亡率為100%。

Berini等［26］研究發(fā)現(xiàn)T. viride幾丁質(zhì)酶混合物對(duì)家蠶圍食膜有顯著影響，降解幾丁質(zhì)的細(xì)菌可降解昆蟲體內(nèi)的幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)，表明它們?cè)诤οx防控方面具有潛在的應(yīng)用前景［77］。S. marcescens SEN的培養(yǎng)液中至少含有兩種在堿性條件下具有活性的幾丁質(zhì)酶，將其添加到斜紋夜蛾幼蟲的飼料中，幼蟲的死亡率很高［78］，從B. subtilis中純化出的幾丁質(zhì)酶也可使斜紋夜蛾幼蟲的發(fā)育變緩［79］。S. marcescens WW4中的3種幾丁質(zhì)酶（ChiA、ChiB和ChiC）對(duì)天幕毛蟲和棉鈴蟲幼蟲也具有殺蟲活性［80］。將來(lái)自于木豆野生品種的CpCHI4基因通過(guò)在煙草中進(jìn)行異源表達(dá)，證實(shí)煙草具有殺棉鈴蟲活性是因?yàn)檎狭薈pCHI4基因［81］。通過(guò)掃描電鏡觀察幾丁質(zhì)酶HaCHT4 對(duì)棉鈴蟲幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中幾丁質(zhì)含量及圍食膜結(jié)構(gòu)的影響，在4-6齡的幼蟲早期，觀察到圍食膜表面結(jié)構(gòu)多呈小孔結(jié)構(gòu)，后期孔隙變多且較大。在4齡幼蟲的后期，經(jīng)過(guò)RNA干擾引起基因HaCHT4的低表達(dá)又導(dǎo)致圍食膜中幾丁質(zhì)含量增加，表面結(jié)構(gòu)呈多層結(jié)構(gòu)并且孔徑變小。該研究認(rèn)為幾丁質(zhì)酶HaCHT4對(duì)棉鈴蟲的幾丁質(zhì)含量及圍食膜結(jié)構(gòu)有顯著的調(diào)節(jié)作用［82］。

綜上所述，依據(jù)害蟲體內(nèi)存在幾丁質(zhì)重要成分的事實(shí)，通過(guò)直接噴施幾丁質(zhì)酶液或在農(nóng)作物中異源表達(dá)幾丁質(zhì)酶基因降解害蟲體壁和圍食膜中的幾丁質(zhì)進(jìn)行害蟲防治，是一種靶向、綠色、有效的生防策略。

3.3 植物寄生線蟲的生防機(jī)理及防治策略

植物寄生線蟲是一種微小的圓形蠕蟲，會(huì)對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［83］。線蟲的生命周期主要包括3個(gè)不同階段，即卵期、幼蟲期和成蟲期［84］。線蟲卵殼的角質(zhì)層在預(yù)防感染方面起著重要作用，其主要成分是膠原蛋白，在線蟲感染期間可被微生物降解［84］。卵殼復(fù)雜的結(jié)構(gòu)可提高被包裹的卵、胚胎或幼蟲的存活率。卵殼是線蟲卵中最堅(jiān)硬的部分，其主要成分是幾丁質(zhì)。目前，主要用化學(xué)殺蟲劑控制線蟲病害，但細(xì)菌和真菌因能產(chǎn)生具有殺線蟲作用的代謝物和水解酶而受到越來(lái)越多的關(guān)注［85］。

PjChi?1是從青霉菌中分離出的一種幾丁質(zhì)酶，通過(guò)使用轉(zhuǎn)基因番茄對(duì)根結(jié)線蟲進(jìn)行了測(cè)試。與從對(duì)照植物中收集的卵相比，在轉(zhuǎn)基因番茄中發(fā)現(xiàn)的卵殼幾丁質(zhì)含量較低，轉(zhuǎn)基因植物中PjCHI?1的過(guò)表達(dá)有效減少了線蟲繁殖并抑制了胚胎發(fā)育［86］。幾丁質(zhì)酶在降解鐵載體和其他次生代謝物控制線蟲方面也有優(yōu)勢(shì)［87］。據(jù)報(bào)道，幾丁質(zhì)酶主要干擾寄生線蟲的卵孵化，Lee和Kim報(bào)道了來(lái)自于短雙歧桿菌（Bifidobacterium breve）L1的蛋白酶和幾丁質(zhì)酶對(duì)沙蠶卵孵化和幼體死亡率的抑制作用顯著增強(qiáng)［88］。幾丁質(zhì)酶和明膠酶在抑制番茄隱孢子蟲感染中也發(fā)揮著重要作用［89］。因此，利用幾丁質(zhì)酶來(lái)防治農(nóng)作物的線蟲危害是一種非常有潛力的生防策略。但是目前這方面的研究報(bào)道相對(duì)較少，后期還需更深入地研究。

4 基于幾丁質(zhì)酶的轉(zhuǎn)基因技術(shù)在作物害蟲防治中的應(yīng)用

利用生物技術(shù)對(duì)具有先天和后天抗生物脅迫能力的農(nóng)作物進(jìn)行基因工程育種，在很大程度上可以減少對(duì)農(nóng)藥的使用，并能保障持續(xù)的作物產(chǎn)量。幾丁質(zhì)酶是一種單基因編碼的蛋白質(zhì)，具有低分子量和存在信號(hào)肽的特點(diǎn)，在轉(zhuǎn)基因作物中具有廣闊的應(yīng)用前景。

植物幾丁質(zhì)酶在植物發(fā)育和非特異性脅迫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，來(lái)自植物的幾丁質(zhì)酶基因已成功地在小麥、西紅柿、土豆等作物中進(jìn)行過(guò)表達(dá)以對(duì)抗真菌病原體［90］。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)將山崳菜防御素基因和來(lái)自灰色鏈霉菌（Streptomyces griseus HUT6037）的幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)化到煙草中，所得轉(zhuǎn)基因煙草可通過(guò)抑制病原菌菌絲體生長(zhǎng)來(lái)抗煙草枯萎病菌［91］。使用來(lái)自深綠木霉（T. atroviride）的工程化基因Chit42和S. marcescens的C端幾丁質(zhì)結(jié)合域可培育抗菌核莖腐病的轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜［92］。利用橄欖鏈霉菌（S. olivaceus）GH19家族的幾丁質(zhì)酶基因可培育抗真菌的轉(zhuǎn)基因大豆［93］。Ahmad Mir等［94］通過(guò)從印度芥菜中克隆幾丁質(zhì)酶IV基因，選育了具有高轉(zhuǎn)錄水平幾丁質(zhì)酶IV基因的獨(dú)立芥菜轉(zhuǎn)基因株系，可用于抗甘藍(lán)型油菜病菌的感染。病理學(xué)研究表明，與非轉(zhuǎn)基因植物相比，芥菜幾丁質(zhì)酶轉(zhuǎn)基因株系的甘藍(lán)型油菜病斑發(fā)育速率和大小顯著降低。Wang等［95］通過(guò)RNA測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，同源四倍體蘋果中Md Chi1基因的表達(dá)水平顯著上調(diào)，由此從該蘋果中克隆出Chi1基因，并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法獲得4個(gè)Md Chi1 OE品種，轉(zhuǎn)基因植株對(duì)炭疽桿菌（B. anthracis）和鏈格孢菌（A. alternata）引起的真菌病害具有較強(qiáng)的抗性。Zhang等［96］報(bào)道了從B. subtilis中克隆出幾丁質(zhì)酶基因chi113并將其通過(guò)載體導(dǎo)入到越南伯克霍爾德菌（Burkholderia vietnamiensis P418）中形成重組體P418?37，檢測(cè)到重組體P418?37有穩(wěn)定的幾丁質(zhì)酶活性，并對(duì)小麥紋枯病、棉花枯萎病和番茄灰霉病的植物病害產(chǎn)生抑制作用。從S. marcescens中克隆幾丁質(zhì)內(nèi)切酶基因SmchiC，將其通過(guò)轉(zhuǎn)化載體導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因煙草中，轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)B. cinerea及草地貪夜蛾的抗性明顯高于野生型植株［97］。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)不僅促進(jìn)了不同來(lái)源幾丁質(zhì)酶基因的功能驗(yàn)證，而且還推動(dòng)了它們?cè)谧魑锔牧贾械某晒?yīng)用［81］。通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)化到相應(yīng)的農(nóng)作物中，可獲得具有高抗病蟲害性能的作物新品種，可在很大程度上減少對(duì)化學(xué)農(nóng)藥的使用。

5 總結(jié)與展望

植物病蟲害問(wèn)題已嚴(yán)重制約農(nóng)作物的生產(chǎn)、品質(zhì)及安全。使用化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行病蟲害防治會(huì)對(duì)種植土壤、農(nóng)作物品質(zhì)及其安全性造成不利影響。而且，隨著長(zhǎng)期、過(guò)量使用化學(xué)農(nóng)藥，病原體會(huì)對(duì)其產(chǎn)生抗性，對(duì)農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)性產(chǎn)生更加嚴(yán)重的危害。隨著綠色、可持續(xù)發(fā)展理念的不斷深入，以蟲治蟲、以菌治蟲、以菌治菌、以微生物（或植物）代謝物治蟲治菌的生物防治與綠色防控技術(shù)越來(lái)越受到農(nóng)科科技人員和農(nóng)戶的重視和認(rèn)可。幾丁質(zhì)酶作為一種有效的生防制劑，主要是基于它能夠特異性降解存在于植物病原真菌細(xì)胞壁、線蟲和有害昆蟲體細(xì)胞內(nèi)的幾丁質(zhì)，在農(nóng)作物病蟲害的生物防治生產(chǎn)實(shí)踐中具有廣闊的應(yīng)用前景。

目前，有關(guān)幾丁質(zhì)酶在農(nóng)作物病蟲害生物防治領(lǐng)域的研究和開發(fā)應(yīng)用工作已較為廣泛和深入。但是，結(jié)合當(dāng)前農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究開發(fā)領(lǐng)域的新進(jìn)展以及生防酶制劑的實(shí)際應(yīng)用形式，建議今后在以下幾個(gè)方面作進(jìn)一步的探索和努力：（1）鑒于實(shí)驗(yàn)室可培養(yǎng)微生物種類和數(shù)量的有限性，可采用宏基因組學(xué)技術(shù)進(jìn)一步挖掘不同生境、不同生物體中幾丁質(zhì)酶基因的多樣性和特異性，以發(fā)現(xiàn)更多更具開發(fā)應(yīng)用潛力的生防幾丁質(zhì)酶；（2）應(yīng)采用生物信息學(xué)技術(shù)全面系統(tǒng)地比較分析不同物種來(lái)源的幾丁質(zhì)酶基因和蛋白質(zhì)序列、氨基酸組成、理化性質(zhì)、疏水性、跨膜區(qū)、信號(hào)肽、亞細(xì)胞定位、結(jié)構(gòu)功能域以及高級(jí)結(jié)構(gòu)，為深入理解幾丁質(zhì)酶的催化機(jī)理、理性設(shè)計(jì)與定向進(jìn)化、催化活性和穩(wěn)定性的提高、化學(xué)模擬酶的制備提供理論依據(jù)；（3）通過(guò)開發(fā)創(chuàng)建基于幾丁質(zhì)酶的轉(zhuǎn)基因和基因編輯耦合技術(shù)體系，可獲得兼具抗病性、抗逆性、特性品質(zhì)、產(chǎn)量潛力和生長(zhǎng)發(fā)育等多個(gè)優(yōu)良性狀的改良農(nóng)作物新品系；（4）基于綠色環(huán)保、多酶聯(lián)產(chǎn)、節(jié)能省時(shí)、混菌多底物的幾丁質(zhì)酶的固態(tài)、半固態(tài)新型發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)亟需創(chuàng)新探索；（5）幾丁質(zhì)酶作為有效、有潛力的綠色生防制劑，目前的研究大多集中于實(shí)驗(yàn)室層面的防治效果評(píng)價(jià)，但是田間試驗(yàn)報(bào)道還相對(duì)較少。因此，基于高活性、高穩(wěn)定性、高效性為特征，以生產(chǎn)實(shí)踐可應(yīng)用為目標(biāo)的幾丁質(zhì)酶生防新型制劑的生產(chǎn)技術(shù)體系和實(shí)際應(yīng)用效果評(píng)估工作亟需攻關(guān)，以期開發(fā)出能在農(nóng)作物病蟲害生物防治生產(chǎn)實(shí)踐中可應(yīng)用推廣的幾丁質(zhì)酶生防產(chǎn)品，為綠色健康、可持續(xù)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展做出積極貢獻(xiàn)。

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