洪 鵬，和 敏，周會明，張焱珍，卯明娟，王 瑞，馬凱云，鄧 云

滇西科技師范學(xué)院生物技術(shù)與工程學(xué)院，云南臨滄 677000

蓋囊菇（Pleurotus cystidiosusO.K. Mill.）又名蓋囊側(cè)耳、泡囊側(cè)耳，是側(cè)耳科、側(cè)耳屬真菌，多分布于中國臺灣、云南、浙江等地，是一種高溫木腐菌，其肉質(zhì)肥嫩可口，菌柄粗壯，含有多種氨基酸和維生素，除包括人體必需的8種氨基酸外，還含有維生素B1、維生素B2、煙酸等[1]，頗受消費者喜愛。因此，蓋囊菇具有重要的經(jīng)濟價值，對該菇進行馴化研究對其開發(fā)利用意義較大。關(guān)于蓋囊菇的相關(guān)文獻報道較少，主要研究在種質(zhì)資源馴化栽培[2-4]、活性化學(xué)成分開發(fā)[5]、原生質(zhì)體融合[6]、系統(tǒng)發(fā)育分析[7-8]、生物活性[9-12]等方面，與其他市場常見人工栽培食用菌相比，該菇具有地域性強、栽培技術(shù)不完善以及生長環(huán)境特殊等特點，導(dǎo)致其大規(guī)模推廣滯后且受到嚴(yán)重的阻礙，培育地域性品種成為該菇商品化的發(fā)展趨勢。

生理特性的研究是大型真菌馴化栽培的前提，本研究以一株采集于云南省臨滄市的覆土栽培蓋囊菇高溫品種為材料，從該菇的可控環(huán)境條件入手，基于單因素試驗的基礎(chǔ)上采用正交優(yōu)化試驗的方法研究不同溫度、瓊脂濃度、酸堿度、氧氣、光照等因素對蓋囊菇菌絲體生長及孢梗束形成的影響，為后續(xù)該菇在本市及其它地域的覆土栽培品種林下推廣提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 覆土栽培蓋囊菇高溫品種菌株由滇西科技師范學(xué)院食用菌課題組提供。

1.1.2 PSA培養(yǎng)基 馬鈴薯20%，蔗糖2%，瓊脂1.5%，水1 L，pH自然。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化與接菌 將蓋囊菇菌絲試管從冰箱中取出放入室溫中培養(yǎng)7 d左右，然后轉(zhuǎn)接至活化培養(yǎng)基中（菌塊直徑為5 mm[13]，下同），在25 ℃下培養(yǎng)。待長滿后轉(zhuǎn)接至PSA平板培養(yǎng)基中，25 ℃下培養(yǎng)觀察并記錄。

1.2.2 生物學(xué)特性 （1）溫度試驗。以PSA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，第一次先設(shè)置0、5、10、15、20、25、30、35、40 ℃的溫度梯度進行試驗，并測定培養(yǎng)基滅菌前后的pH。在第一次溫度梯度的基礎(chǔ)上縮小溫度梯度進行第二次試驗，設(shè)置19、21、23、25、27、29 ℃的溫度梯度。2次試驗中每個溫度梯度均設(shè)置4個重復(fù)，培養(yǎng)皿型號為70 mm。接菌后，記錄菌絲萌發(fā)時間（d）、孢梗束形成時間（d）以及培養(yǎng)時間（d），待菌絲長至培養(yǎng)皿總面積約2/3時，采用十字交叉法測量菌落直徑，計算生長速度（mm/d）[14]，記錄菌落顏色、菌落生長勢（“+++”表示濃密健壯，“++”表示較濃密，“+”表示生長“-”表示不生長）[15-16]、孢梗束形成數(shù)量（個）、下同。

（2）瓊脂濃度試驗。以PSA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通過控制瓊脂濃度來控制含水量，設(shè)置0.2%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的瓊脂濃度梯度進行試驗，每個梯度設(shè)置4個重復(fù)，在最適溫度下培養(yǎng)。

（3）酸堿度試驗。以最適瓊脂濃度PSA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，設(shè)置pH為4.00、4.50、5.00、5.20、5.40、5.60、5.80、6.00、6.20、6.40、6.60、6.80、7.00、7.50、8.00、8.50、9.00、9.50、10.00的梯度進行試驗[17]。用0.1%氫氧化鈉溶液和0.1%氯化氫溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH，每個梯度設(shè)置4個重復(fù)，在最適培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)。

（4）氧氣試驗。以最適瓊脂濃度、酸堿度的PSA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通過控制培養(yǎng)皿的直徑來控制含氧量。試驗中共設(shè)置培養(yǎng)基型號為60、70、90、100 mm的4個梯度，每個梯度設(shè)置4個重復(fù)，在最適溫度和光照下培養(yǎng)。

（5）光照試驗。以最適瓊脂濃度和酸堿度PSA作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，設(shè)置24 h光照、12 h光照、24 h黑暗的梯度進行試驗[18]，使用功率為5 w的白色燈管在37 cm×50 cm×15 cm的空間內(nèi)進行照射，且照射距離為15 cm；每個梯度設(shè)置4個重復(fù)，在最適溫度下培養(yǎng)。

1.2.3 正交優(yōu)化試驗 根據(jù)蓋囊菇菌絲的溫度、瓊脂濃度、酸堿度、氧氣、光照單因素試驗結(jié)果，設(shè)置L16(45)以菌絲體生長速度為指標(biāo)的正交試驗因素與水平（表1），以孢梗束形成數(shù)量為指標(biāo)的正交試驗因素與水平（表2）。

表1 正交試驗因素與水平（菌絲體）Tab. 1 Orthogonal test factor and level (mycelium)

表2 正交試驗因素與水平（孢梗束）Tab. 2 Orthogonal test factor and level (coremium)

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用十字交叉法進行測量，所得結(jié)果均為3次重復(fù)，采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件Duncan’s法進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對蓋囊菇菌絲體生長與孢梗束形成的影響

2.1.1 5 ℃溫度梯度試驗 由表3可知，蓋囊菇在10~30 ℃下菌絲均能生長且顏色均為白色（圖1）。在溫度范圍10~25 ℃，其菌絲生長速度隨溫度的升高而加快，25 ℃時，蓋囊菇的菌絲生長速度最快，為(3.84±0.15)mm/d，且菌絲長勢最好，與其他溫度處理相比在0.05和0.01水平上有極顯著差異。其次是20 ℃和30 ℃溫度處理，而30 ℃時菌絲長勢比20 ℃濃密（圖1）。蓋囊菇孢梗束在15~30 ℃內(nèi)均能形成，在溫度范圍15~25 ℃，其孢梗束形成數(shù)量隨溫度的升高而增多，25 ℃時，形成數(shù)量最多，為(39.50±2.38)個/皿，且與其他溫度處理相比在0.05和0.01水平上有極顯著差異。

圖1 5 ℃溫度梯度下蓋囊菇菌株在PSA平板中的培養(yǎng)情況Fig. 1 Cultivation of P. cystidiosus strains in PSA plate under 5 ℃ temperature gradient

表3 5 ℃溫度梯度下菌絲體生長與孢梗束形成Tab. 3 Mycelium development and coremium formation under 5 ℃ temperature gradient

2.1.2 2 ℃溫度梯度試驗 由表4可知，當(dāng)溫度在25 ℃時，蓋囊菇的生長速度最快，為(3.25± 0.36)mm/d，在25 ℃和27 ℃的菌落直徑和菌絲生長速度與其他溫度處理相比在0.05和0.01水平上有極顯著差異。蓋囊菇孢梗束在27 ℃時，形成數(shù)量最多（圖2），為(11.75±2.08)個/皿，且與其他溫度處理相比在0.05水平上有顯著差異。

圖2 2 ℃溫度梯度下蓋囊菇菌株在PSA平板中的培養(yǎng)情況Fig. 2 Cultivation of P. cystidiosus strains in PSA plate under 2 ℃ temperature gradient

表4 2 ℃溫度梯度下菌絲體生長與孢梗束形成Tab. 4 Mycelium development and coremium formation under 2 ℃ temperature gradient

2.2 瓊脂濃度對蓋囊菇菌絲體生長與孢梗束形成的影響

由表5可知，蓋囊菇菌絲體在瓊脂濃度為0.5%~3.0%的范圍內(nèi)均能生長，在該范圍內(nèi)瓊脂濃度與菌絲生長速度成正比，在3.0%時菌絲生長速度最快，為(2.96±0.16)mm/d，相比于其他瓊脂濃度有極顯著的差異，且菌絲健狀濃密（圖3）；其孢梗束在0.5%~3.0%內(nèi)均能形成，在2.0%時，孢梗束數(shù)量最多，為(29.75±0.96)個/皿，與其他處理相比在0.05和0.01水平上有極顯著差異。

圖3 不同瓊脂濃度下蓋囊菇菌株在PSA平板中的培養(yǎng)情況Fig. 3 Cultivation of P. cystidiosus strains in PSA plate under different agar concentration

表5 不同瓊脂濃度下菌絲體生長與孢梗束形成Tab. 5 Mycelium development and coremium formation under different agar concentration

2.3 酸堿度對蓋囊菇菌絲體生長與孢梗束形成的影響

由表6可知，蓋囊菇在pH為4.00~10.00下菌絲均能生長，在4.00~6.00范圍內(nèi)，其菌絲生長速度隨pH的增加而增加，當(dāng)pH增加到5.40時，菌絲生長速度趨于平緩，當(dāng)pH大于7.00時，菌絲生長速度開始下降。在pH為5.80時菌絲生長速度最快，為(3.50±0.16)mm/d，pH為5.80在0.05和0.01水平上相較于其他pH有顯著差異；其孢梗束在pH范圍為4.00~10.00均能形成，在pH為8.0時，孢梗束數(shù)量最大（圖4），為(20.75±1.71)個/皿，與其他處理相比在0.05和0.01水平上相較于其他pH有極顯著差異。

表6 不同pH下菌絲體生長與孢梗束形成Tab. 6 Mycelium development and coremium formation under different pH

2.4 氧氣對蓋囊菇菌絲體生長與孢梗束形成的影響

由表7可知，蓋囊菇在培養(yǎng)皿直徑為60~100 mm內(nèi)，其菌絲體均能生長且孢梗束均能形成（圖5）。當(dāng)培養(yǎng)皿規(guī)格為100 mm時，菌絲生長速度最快，孢梗束數(shù)量最多，分別達到(3.31±0.40)mm/d、(24.50±2.08)個/皿，與其他處理相比在0.05水平上均有顯著差異，且菌絲健狀濃密。

圖5 不同含氧量下蓋囊菇菌株在PSA平板中的培養(yǎng)情況Fig. 5 Cultivation of P. cystidiosus strains in PSA plate under different oxygen content

表7 不同含氧量下菌絲體生長與孢梗束形成Tab. 7 Mycelium development and coremium formation under different oxygen content

2.5 光照對蓋囊菇菌絲體生長與孢梗束形成的影響

由表8可知，蓋囊菇在光照時間為0~24 h內(nèi)菌絲均能生長，其菌絲生長速度隨光照時長的增加而減小，當(dāng)光照時長為0 h連續(xù)黑暗時，蓋囊菇的菌絲生長速度最快，為(2.79±0.15)mm/d，與其他光照處理相比在0.05和0.01水平上有極顯著差異，且菌絲健壯濃密（圖6）；蓋囊菇孢梗束在0~24 h內(nèi)均能形成，其孢梗束數(shù)量隨光照時長的增加而增加，在24 h連續(xù)光照時，形成數(shù)量最多，為(19.67±1.15)個/皿，且與其他光照處理相比在0.05和0.01水平上有極顯著差異，但菌絲較稀疏。

圖6 不同光照時間下蓋囊菇菌株在PSA平板中的培養(yǎng)情況Fig. 6 Cultivation of P. cystidiosus strains in PSA plate under different light duration

表8 不同光照時間下菌絲體生長與孢梗束形成Tab. 8 Mycelium development and coremium formation under different light duration

2.6 正交試驗結(jié)果

2.6.1 以菌絲體生長速度為指標(biāo)的正交試驗 （1）正交組合對菌絲體生長與孢梗束形成的影響。由表9可知，蓋囊菇在所有的正交組合上菌絲均能生長，在正交組合15上，蓋囊菇的菌絲生長速度最快，為(3.56±0.62)mm/d（表10），與其他處理相比在0.05和0.01水平上有極顯著差異，且菌絲健壯濃密（圖7）。蓋囊菇孢梗束在所有的正交組合上均能形成，在正交組合5上，形成數(shù)量最多，為(21.50±2.08)個/皿（表9），與其他處理相比在0.05和0.01水平上有極顯著差異。

圖7 不同正交組合下蓋囊菇菌株在PSA平板中的菌絲體生長情況Fig. 7 Mycelium growth of P. cystidiosus strains in PSA plate under different orthogonal combinations

表9 正交組合下菌絲體生長與孢梗束形成Tab. 9 Mycelium development and coremium formation under orthogonal combinations

表10 以菌絲體生長速度為指標(biāo)的極差分析Tab. 10 Range analysis table with mycelium growth rate as index

（2）極差分析與驗證試驗。由表10極差R值可知，溫度、瓊脂濃度、酸堿度、氧氣、光照5個因素對蓋囊菇菌絲生長速度的影響順序為：光照>溫度>瓊脂濃度>酸堿度>氧氣，極差分析（A4B3C2D4E1，A4B3C2D2E1）與顯著性分析（A4B3C2D4E1）最優(yōu)組合結(jié)果不一致。經(jīng)驗證試驗，該菌在組合A4B3C2D4E1培養(yǎng)基上其菌絲生長速度最大，達到(4.14±0.51)mm/d，其余參數(shù)結(jié)果均相同。因此，最優(yōu)組合為A4B3C2D4E1，即瓊脂濃度為3.0%、pH為5.80、溫度為25 ℃、培養(yǎng)皿大小為100 mm、光照時長為0 h。

2.6.2 以孢梗束形成數(shù)量為指標(biāo)的正交試驗 （1）正交組合對孢梗束形成數(shù)量的影響。由表11可知，蓋囊菇在瓊脂濃度為1.5%~3.0%、pH為7.50~9.00、溫度為25~31 ℃、培養(yǎng)皿大小為60~100 mm、光照時長為0~24 h時菌絲均能生長，當(dāng)為3.0%、pH為8.50、24 h黑暗、培養(yǎng)皿大小為100 mm時，蓋囊菇的菌絲生長速度最快，為(3.65±0.52)mm/d，與其他處理相比在0.05和0.01水平上有極顯著差異，且菌絲健壯濃密（圖8）。蓋囊菇孢梗束在瓊脂濃度為1.5%~3.0%、pH為7.50~9.00、溫度為25~31 ℃、培養(yǎng)皿大小為60~100 mm、光照時長為0~24 h內(nèi)均能形成，在瓊脂濃度為2.0%、pH為5.4、溫度為25 ℃、24 h光照、培養(yǎng)皿大小為90 mm時，形成數(shù)量最多，為(48.75±8.18)個/皿（表12），與其他處理相比在0.05和0.01水平上有極顯著差異。

圖8 不同正交組合下蓋囊菇菌株在PSA平板中的培養(yǎng)情況Fig. 8 Cultivation of P. cystidiosus strains in PSA plate under different orthogonal combinations

表11 正交組合下菌絲體生長與孢梗束形成Tab. 11 Mycelium development and coremium formation under orthogonal combinations

表12 以孢梗束形成數(shù)量為指標(biāo)的極差分析Tab. 12 Range analysis table with number of coremium formation as index

（2）極差分析與驗證試驗。由表12極差分析可知，溫度、瓊脂濃度、酸堿度、氧氣、光照5個因素對蓋囊菇孢梗束形成的影響順序為：溫度>氧氣>瓊脂濃度>光照>酸堿度，極差分析（A4B2C1D4E2）與顯著性分析最優(yōu)組合6（A2B2C1D4E3）不同，經(jīng)進一步驗證試驗，該菌在組合A4B2C1D4E2培養(yǎng)基上孢梗束形成數(shù)量最大，達到(49.00±3.46)個/皿，但在組合A2B2C1D4E3上其生長速度最大[(3.26±0.45)mm/d]，其余參數(shù)結(jié)果均相同。因此，最優(yōu)組合為A4B2C1D4E2，即瓊脂濃度2.0%、pH為8.00、溫度25 ℃、培養(yǎng)皿直徑為100 mm、光照時長為14 h。

3 討論

本試驗用平板固體培養(yǎng)的方式，采用單因素和正交優(yōu)化試驗來探究5種可控環(huán)境因子對一株臨滄覆土栽培蓋囊菇高溫品種菌絲體生長和發(fā)育及原基分化的影響。

結(jié)果顯示，蓋囊菇菌絲體生長與孢梗束形成的溫度范圍分別為10~30 ℃、15~30 ℃，二者在所有瓊脂濃度、pH、氧氣、光照處理上也均發(fā)育，其中單因素試驗二者最適環(huán)境因子除氧氣（培養(yǎng)皿直徑100 mm）相同外，溫度（25、27 ℃）、瓊脂濃度（3.0%、2.0%）、pH(5.80、8.00)、光照（0、24 h）各不相同，正交優(yōu)化試驗組合除溫度均為25 ℃外、其他環(huán)境因子與單因素結(jié)果完全一致。

上述蓋囊菇菌絲生長的溫度范圍與郭禧淑等[2]、嚴(yán)澤湘[20]、賀新生等[21]研究結(jié)果一致。該菇菌絲生長最適溫度與DAWIDOWICZ等[22]研究結(jié)果相同，但與HOA等[23]（28 ℃）的與李蝶等[3]（27.5 ℃）的不符。該菇菌絲生長pH的范圍與李蝶的研究結(jié)果一致，其最適pH與賀新生研究結(jié)果相同，而與DULAY等[24]（7.00）、郭禧淑等（6.00~6.50）、嚴(yán)澤湘（6.00~6.50）等研究結(jié)果不同。氧氣濃度與蓋囊菇菌絲生長速度成正比，黑暗情況下更有利于菌絲生長，該結(jié)果與賀新生的研究相同。目前，蓋囊菇孢梗束的研究極少且仍處于形態(tài)學(xué)觀察階段，其它方面未見報道，環(huán)境條件對其影響較大。

因此，本試驗結(jié)果與前人的研究存在部分差異，導(dǎo)致出現(xiàn)上述結(jié)果極有可能與菌株的遺傳多樣性有關(guān)，同一品種但不同來源其生物學(xué)特性存在一定的差異，如和耀威等[25]與陳緒濤等[26]分別對不同來源的黑木耳、皺環(huán)球蓋菇菌株均開展了溫度試驗，在不同的溫度梯度下菌株間溫度的變化趨勢與最適溫度均存在不同程度的差異。此外，培養(yǎng)基質(zhì)種類、試驗設(shè)備型號、人員操作技術(shù)等因素均可能引起試驗結(jié)果的差異。

總之，在摸清臨滄覆土栽培蓋囊菇高溫品種可控環(huán)境條件的基礎(chǔ)上，一方面，繼續(xù)采用本試驗的培養(yǎng)方式，有必要對該菇的營養(yǎng)生理[27]、不同生育階段酶活[28]、液體發(fā)酵技術(shù)[29]等進行系統(tǒng)的研究；另一方面，采用培養(yǎng)料培養(yǎng)方式，對該菇進行不可控環(huán)境條件[30]、栽培[31]、產(chǎn)品加工[32]、孢梗束形成機理等方面的研究，為該菇的林下推廣與應(yīng)用鑒定基礎(chǔ)。