李秀秀，汪 琦

（1.德州市德城區(qū)疾病預(yù)防控制中心，山東德州 253000；2.樂陵市疾病預(yù)防控制中心，山東德州 253600）

沙門氏菌（Salmonella）是一類常見的食源性病原菌，為革蘭氏陰性桿菌，被認(rèn)為是食品和水源中最主要的致病菌之一[1]。全球每年有數(shù)百萬人因攝入受污染的食物或水而感染沙門氏菌，導(dǎo)致食物中毒，對公共衛(wèi)生構(gòu)成嚴(yán)重威脅[2]。因此，對食品、水源的生產(chǎn)、運(yùn)輸、銷售過程中的沙門氏菌進(jìn)行檢測至關(guān)重要。

隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（Polymerase Chain Reaction，PCR）、酶聯(lián)免疫法、恒溫?zé)晒夂怂釞z測法等各種快速檢測技術(shù)被應(yīng)用于沙門氏菌的檢測中。其中，PCR技術(shù)是最常用的方法之一[3]。但PCR技術(shù)也存在一定的局限性，其需要專門的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備和技術(shù)人員進(jìn)行操作，且對樣品預(yù)處理和提取DNA的要求較高[4]。選擇性培養(yǎng)基通過優(yōu)化培養(yǎng)條件，使目標(biāo)微生物得以生長和繁殖，同時(shí)限制其他微生物的生長，從而實(shí)現(xiàn)高特異性的檢測，被廣泛應(yīng)用于分離、鑒定和定量目標(biāo)微生物[5]。

本研究通過比較不同選擇性培養(yǎng)基對沙門氏菌檢測效果的影響，篩選適用于沙門氏菌檢測的培養(yǎng)基，為沙門氏菌的快速檢測提供科學(xué)依據(jù)，為食品安全監(jiān)管和公共衛(wèi)生管理提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

目標(biāo)菌株：鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028、甲型副傷寒沙門氏菌CMCC（B）50093。干擾菌株：糞腸球菌ATCC29212、奇異變形桿菌CMCC（B）49005、大腸埃希氏菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853。亞硫酸鉍瓊脂培養(yǎng)基；沙門氏菌顯色培養(yǎng)基；HE瓊脂培養(yǎng)基；木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽培養(yǎng)基；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（復(fù)蘇培養(yǎng)基）；即用型胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（參比培養(yǎng)基）；恒溫培養(yǎng)箱；酒精燈；無菌培養(yǎng)皿；純化水。

1.2 待測菌株的檢測

先進(jìn)行平板制備，分別取47.3 g亞硫酸鉍瓊脂培養(yǎng)基干粉、34.9 g沙門氏菌顯色培養(yǎng)基干粉、90.8 g HE瓊脂培養(yǎng)基產(chǎn)品干粉、57.0 g木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽培養(yǎng)基產(chǎn)品顆粒制備培養(yǎng)基和32.0 g營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，將稱量好的樣品與1000 mL純化水混合加熱，不斷攪拌至完全溶解，冷卻至50 ℃后倒入無菌培養(yǎng)皿中（至少3 mm厚），置于平臺上半開蓋至瓊脂凝固后蓋蓋備用。

將不同菌株接種在營養(yǎng)培養(yǎng)基上置于恒溫培養(yǎng)箱中36 ℃培養(yǎng)1 d進(jìn)行菌株復(fù)蘇，再將不同菌株分別接種在亞硫酸鉍瓊脂培養(yǎng)基、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基、HE瓊脂培養(yǎng)基、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基上，目標(biāo)菌株采用平均涂布，干擾菌株采用平板劃線（圖1），再次置于恒溫培養(yǎng)箱中36 ℃培養(yǎng)2 d后進(jìn)行鑒定。

圖1 干擾菌株平板劃線示意圖（GB 4789.28—2013）

1.3 鑒定原理

亞硫酸鉍瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的亞硫酸鹽可被沙門氏菌還原成硫化物，生成的硫化物與硫酸亞鐵反應(yīng)后可使菌落呈現(xiàn)黑色。

沙門氏菌顯色培養(yǎng)基中混合色素與沙門氏菌內(nèi)部特異性酶進(jìn)行反應(yīng)，使沙門氏菌群落呈紫紅色。

HE瓊脂培養(yǎng)基中的硫代硫酸鈉和檸檬酸鐵銨可與部分可發(fā)酵糖類的沙門氏菌產(chǎn)生的硫化氫反應(yīng)，該反應(yīng)可使菌落中心部位呈黑色，從而實(shí)現(xiàn)對沙門氏菌的檢測；同時(shí)培養(yǎng)基中的麝香草酚藍(lán)等酸堿指示劑也可將群落顯色為橘黃色群落和藍(lán)綠色群落，用于鑒定菌種。

木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽培養(yǎng)基中的木糖經(jīng)沙門氏菌發(fā)酵后產(chǎn)生酸，酸性環(huán)境促進(jìn)沙門氏菌產(chǎn)生脫羧酶使XLD瓊脂培養(yǎng)基中的賴氨酸脫羧，導(dǎo)致培養(yǎng)基內(nèi)pH值不斷升高形成堿性環(huán)境，在堿性環(huán)境下硫代硫酸鈉和硫酸亞鐵銨與沙門氏菌產(chǎn)生的硫化氫反應(yīng)使群落呈黑色。

1.4 生長率和選擇性測定

采用生長率評價(jià)目標(biāo)菌的檢測結(jié)果，生長率的計(jì)算公式為

式中：Pr為生長率；Ns為待測培養(yǎng)基平板上的菌落總數(shù)，CFU；N0為和參比培養(yǎng)基平板上的菌落總數(shù)，CFU。

采用生長指數(shù)（G）作為干擾菌檢測結(jié)果的評價(jià)指標(biāo)，根據(jù)每條劃線上菌落的生長情況計(jì)算生長指數(shù)（0≤G≤6），其評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

表1 生長指數(shù)（G）的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基上目標(biāo)菌的生長情況

如表2所示，在亞硫酸鉍瓊脂培養(yǎng)基中，鼠傷寒沙門氏菌易于被檢出，菌落顏色呈黑色并帶金屬光澤，而甲型副傷寒沙門氏菌相對較難檢出，其菌落顏色呈現(xiàn)暗綠色，易與其他綠色系菌落混淆（如銅綠假單胞菌），這與甲型副傷寒沙門氏菌不發(fā)酵糖類產(chǎn)生硫化氫有關(guān)。沙門氏菌顯色培養(yǎng)基中鼠傷寒沙門氏菌和甲型副傷寒沙門氏菌均有特異性反應(yīng)。HE瓊脂培養(yǎng)基中鼠傷寒沙門氏菌菌落中心呈黑色，相較于甲型副傷寒沙門氏菌更易被檢出。木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽培養(yǎng)基中鼠傷寒沙門氏菌和甲型副傷寒沙門氏菌均呈淺紅色菌落且中心呈黑色，檢測效果較好。

表2 目標(biāo)菌的菌落生長情況

2.2 不同培養(yǎng)基上干擾菌的生長情況

如表3所示，4種培養(yǎng)基中，糞腸球菌均受到明顯的抑制，奇異變形桿菌在沙門氏菌顯色培養(yǎng)基被抑制。除木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽培養(yǎng)基中的奇異變形桿菌難與鼠傷寒沙門氏菌相區(qū)分外，其他條件下均可與沙門氏菌區(qū)分。

表3 干擾菌的菌落生長情況

2.3 不同培養(yǎng)基目標(biāo)菌的生長率

如表4所示，4種培養(yǎng)基中，鼠傷寒沙門氏菌和甲型副傷寒沙門氏菌的生長率均較高（＞0.70）。其中，亞硫酸鉍瓊脂培養(yǎng)基中的2種沙門氏菌生長率最高；沙門氏菌顯色培養(yǎng)基中的2種沙門氏菌生長率最低。

表4 不同培養(yǎng)基目標(biāo)菌的生長率

2.4 不同培養(yǎng)基干擾菌的選擇性

如表5所示，糞腸球菌在4個(gè)培養(yǎng)基中的生長指數(shù)均小于3，說明4個(gè)培養(yǎng)基對以糞腸球菌為代表的革蘭氏陽性菌有明顯的抑制作用；而由于培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)不同，沙門氏菌顯色培養(yǎng)基對奇異變形桿菌、亞硫酸鉍瓊脂培養(yǎng)基對大腸埃希氏菌也表現(xiàn)出了明顯的抑制作用。奇異變形桿菌和大腸埃希氏菌在HE瓊脂培養(yǎng)基以及銅綠假單胞菌在4種培養(yǎng)基中均表現(xiàn)出了一定程度的生長，但其菌落特點(diǎn)與沙門氏菌存在一定差異，故這些培養(yǎng)基也可作為這些干擾菌的選擇性培養(yǎng)基。

表5 不同培養(yǎng)基干擾菌的生長指數(shù)

3 結(jié)論

本研究通過比較4種不同選擇性培養(yǎng)基對沙門氏菌的檢測效果發(fā)現(xiàn)，鼠傷寒沙門氏菌在亞硫酸鉍瓊脂培養(yǎng)基、沙門氏菌顯色培養(yǎng)、HE瓊脂培養(yǎng)基和木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽培養(yǎng)基中較易分辨；而甲型副傷寒沙門氏菌因不產(chǎn)硫化氫，在亞硫酸鉍瓊脂培養(yǎng)基和HE瓊脂培養(yǎng)基中較難區(qū)分。4種干擾菌中，除木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽培養(yǎng)基中的奇異變形桿菌，其他條件下均可與沙門氏菌區(qū)分；4種培養(yǎng)基中，鼠傷寒沙門氏菌和甲型副傷寒沙門氏菌的生長率均較高（＞0.70）；4種培養(yǎng)基對革蘭氏陽性菌有明顯的抑制作用。