劉仕洋，孔祥聰，付彩霞，席 啦，郭 壯，2，王玉榮*

（1.湖北文理學(xué)院 湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北 襄陽 441053；2.湖北土老憨生態(tài)農(nóng)業(yè)科技股份有限公司，湖北 宜都 443302；3.湖北省發(fā)酵調(diào)味品工程技術(shù)研究中心，湖北 宜昌 443302）

生抽是中國傳統(tǒng)的發(fā)酵調(diào)味品，以大豆、小麥和食鹽等為主要原料，經(jīng)微生物發(fā)酵釀造制成[1]。FENG Y Z等[2]的研究表明生抽中含有多達(dá)300種揮發(fā)性物質(zhì)，且這些化合物對醬油的感官品質(zhì)較為重要。WANG S等[3]分析了日本醬油中揮發(fā)性化合物的種類，并評價醬油的感官等級，發(fā)現(xiàn)在解析出的64種揮發(fā)性化合物中，丙酮酸乙酯和3-羥基-2-丁酮等19種化合物與醬油感官品質(zhì)呈正相關(guān)，而4-乙基-2甲氧基苯酚和吡嗪等25種化合物的含量與醬油感官質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)。由此可見，生抽的感官品質(zhì)與其蘊(yùn)含揮發(fā)性化合物的種類與含量密切相關(guān)。

市售醬油在貨架期內(nèi)偶爾會出現(xiàn)漲袋、胖聽或漲瓶的現(xiàn)象，其顏色會變深且pH值會升高[4]，引起生抽漲袋的原因主要包括微生物產(chǎn)氣的生物原因、熱脹冷縮的物理原因和酸堿反應(yīng)的化學(xué)原因[5]，蔣雪薇等[6]研究發(fā)現(xiàn)，漲袋的醬油風(fēng)味會變寡變劣，徐一奇[7]研究表明變質(zhì)醬油中醬香成分明顯減少，出現(xiàn)明顯的酸餿味，其與醬油中總酸及雙乙酰含量的升高有一定關(guān)系。電子鼻技術(shù)具有操作便捷、準(zhǔn)確度高和檢測周期短等優(yōu)點[8]，氣相色譜-離子遷移譜（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）技術(shù)具有靈敏度高、分析速度快和操作簡單等優(yōu)點[9]。相較于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)，GC-IMS無需對樣品進(jìn)行處理且其具有更強(qiáng)的分離能力[10]。目前，關(guān)于漲袋生抽的研究主要集中在解析其變質(zhì)微生物的組成上[6]，而對于漲袋和正常生抽中風(fēng)味物質(zhì)比較分析的研究相對較少。由此可見，使用電子鼻和GC-IMS聯(lián)用技術(shù)比較分析漲袋和正常生抽中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)具有較強(qiáng)的可行性。

某生抽生產(chǎn)廠家生產(chǎn)的兩個批次生抽在儲藏過程中出現(xiàn)了漲袋現(xiàn)象，本研究采集了2個漲袋生抽樣品，并以正常的生抽樣品作為對照，使用電子鼻和GC-IMS聯(lián)用技術(shù)對兩者揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的差異進(jìn)行了比較分析，以期為生抽漲袋問題的解決提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

于2022年7月和8月，從某生抽生產(chǎn)廠家采集生抽樣品3份，其中2份樣品在儲藏過程中出現(xiàn)了漲袋現(xiàn)象，編號為J1和J2，同時采集正常生抽樣品1份，編號為CK，所有樣品的生產(chǎn)時間均為2022年5月。

1.2 儀器與設(shè)備

PEN3電子鼻：德國Airsense公司；FlavourSpecR氣相色譜-離子遷移譜聯(lián)用儀：德國G.A.S.公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 電子鼻對生抽的風(fēng)味評價

參照SHI J等[11]的方法，并稍作修改，取15 mL待測生抽于樣品瓶中，在室溫下靜置2 h后，使用電子鼻探頭進(jìn)行檢測，在60 s的測試時間中取已達(dá)平衡的49 s、50 s和51 s時測試數(shù)據(jù)的平均值作為檢測數(shù)據(jù)，取平均值，每個樣品平行檢測3次。

1.3.2 GC-IMS對生抽中揮發(fā)性化合物的解析

取1 mL樣品置于20 mL頂空瓶中，40 ℃平衡15 min后自動頂空進(jìn)樣，頂空進(jìn)樣條件設(shè)置如下：進(jìn)樣體積為200 μL，進(jìn)樣針溫度為85 ℃，孵化轉(zhuǎn)速為500 r/min。GC和IMS條件均參照張振東等[12]的方法，最后通過美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）和信息管理系統(tǒng)（information management system，IMS）數(shù)據(jù)庫對揮發(fā)性化合物進(jìn)行定性分析，通過峰面積歸一化法確定各物質(zhì)的相對含量。

1.3.3 相對氣味活度值計算

相對氣味活度值（relative odor activity value，ROAV）是評價樣品中各種揮發(fā)性化合物對于總體風(fēng)味的貢獻(xiàn)[13]，其中0.1≤ROAV≤1的化合物對于樣品的總體風(fēng)味有重要的貢獻(xiàn)，ROAV≥1的化合物是關(guān)鍵風(fēng)味化合物，ROAV的計算公式如下：

其中：Ci代表各揮發(fā)性化合物的相對含量，%；Ti代表各揮發(fā)性化合物相應(yīng)的感覺閾值，μg/L，Cmax代表對樣品總體風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的揮發(fā)性化合物的相對含量，%；Tmax代表對樣品總體風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的揮發(fā)性化合物相應(yīng)的感覺閾值，μg/L。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

使用方差分析對不同樣品間的差異性進(jìn)行分析；使用Origin 2018軟件繪制揮發(fā)性化合物的柱狀圖；使用SIMCA 14.1.0軟件進(jìn)行偏最小二乘-判別分析（partial least squaresdiscriminant analysis，PLS-DA）建模。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于電子鼻技術(shù)漲袋和正常生抽揮發(fā)性風(fēng)味品質(zhì)的比較分析

本研究首先使用電子鼻對漲袋和正常生抽風(fēng)味品質(zhì)進(jìn)行了評價，PEN3電子鼻具有10個不同的金屬氧化物傳感器，但其中W1S、W2S、W5S和W6S傳感器分別對甲烷、乙醇、氮氧化物和氫氣敏感，故而本研究僅用剩余6個傳感器對漲袋和正常生抽響應(yīng)值的差異性進(jìn)行了分析，結(jié)果見表1。

表1 電子鼻各傳感器對漲袋和正常生抽響應(yīng)值的比較分析Table 1 Comparative analysis of the response values of each sensor of electronic nose for the light soy sauce in expanded bag and normal bag

由表1可知，傳感器W1C、W3C和W5C對漲袋生抽的響應(yīng)值顯著偏低（P＜0.05），而傳感器W1W、W2W和W3S對漲袋生抽的響應(yīng)值顯著偏高（P＜0.05）。結(jié)合各傳感器的性能發(fā)現(xiàn)，生抽漲袋后芳香類物質(zhì)的含量明顯降低，而有機(jī)硫化物、萜類物質(zhì)和烷烴類物質(zhì)的含量明顯升高。

2.2 基于GC-IMS技術(shù)漲袋和正常生抽中揮發(fā)性化合物的比較分析

為了解析漲袋和正常生抽樣品的風(fēng)味差異，本研究使用GC-IMS技術(shù)對其揮發(fā)性化合物的組成進(jìn)行了比較分析，同時使用Reporter插件構(gòu)建了差異譜圖，正常生抽樣品的二維俯視圖以藍(lán)色為背景，其中漂移時間為1.0 ms處的紅色豎線代表反應(yīng)離子峰（reactive ion peak，RIP），RIP峰兩側(cè)的點均代表生抽樣品中存在的揮發(fā)性化合物，紅色越深，點越大，代表該化合物的濃度越高，相反，白色點越深越大，代表對應(yīng)物質(zhì)的濃度越低。為更清晰地比較漲袋和正常生抽樣品中揮發(fā)性化合物的差異，本研究將正常生抽的二維譜圖作為參比，用漲袋生抽樣譜圖減去參比，而后2個漲袋生抽樣品的差異譜圖以白色為背景，其中紅色代表該有化合物在漲袋生抽中濃度更高，藍(lán)色代表該化合物在正常生抽中濃度更高，結(jié)果見圖1。

圖1 漲袋和正常生抽揮發(fā)性化合物的差異譜圖Fig.1 Differential spectra of volatile compounds in the light soy sauce in expanded bag and normal bag

由圖1可知，生抽樣品中的揮發(fā)性組分在1 600 s內(nèi)完成分離，離子遷移時間處于0.10～1.75 ms之間，漲袋和正常生抽樣品的差異譜圖中紅色點的大小和分布均存在較為明顯的差異，故而可以推測生抽漲袋后揮發(fā)性化合物的組成和含量具有不同程度的變化。

為了進(jìn)一步解析生抽的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，本研究對漲袋和正常生抽樣品中的揮發(fā)性化合物進(jìn)行定性定量分析，發(fā)現(xiàn)鑒定出的30種化合物在所有樣品中均存在，共7類揮發(fā)性化合物，分別為醇類、酮類、酯類、酸類、醛類、含硫類和呋喃類物質(zhì)。統(tǒng)計不同樣品中各類揮發(fā)性化合物的相對含量，結(jié)果見圖2。

圖2 漲袋和正常生抽揮發(fā)性化合物類別的相對含量比較Fig.2 Comparison of the relative contents of volatile compound classes in the light soy sauce in expanded bag and normal bag

由圖2可知，醇類、酮類、酯類、酸類、醛類、含硫類和呋喃類物質(zhì)在漲袋生抽中累計平均相對含量分別為56.78%、13.21%、8.96%、6.23%、2.93%、0.52%和0.21%，在正常生抽中平均相對含量分別為55.72%、15.66%、7.43%、6.91%、5.25%、0.15%和0.07%。經(jīng)方差分析發(fā)現(xiàn)，漲袋和正常生抽樣品中上述物質(zhì)的累計平均含量差異均不顯著（P＞0.05）。楊曉璇等[14]同樣采用GC-IMS技術(shù)從散裝和品牌醬油中共檢測出72種揮發(fā)性組分，其中含量最高的分別是醛類、醇類、酮類和酯類，這與本研究結(jié)果類似，但其亦解析出本研究中未發(fā)現(xiàn)的醚類化合物，造成這種現(xiàn)象的原因可能是原料品質(zhì)、生產(chǎn)地區(qū)和制作方式等存在一定差異。

醛類物質(zhì)是醬油中產(chǎn)生麥芽和堅果香味的主要成分，可在醇脫氫酶的作用下由醇轉(zhuǎn)化而成，或淀粉類物質(zhì)在酶解后生成的葡萄糖經(jīng)醛酸途徑產(chǎn)生[15]，其在漲袋和正常生抽樣品中平均相對含量分別為2.93%和5.25%，可見正常生抽可能具有較好的麥芽香和堅果香氣。酯類物質(zhì)產(chǎn)生了醬油的基本香氣成分，可通過醇和酸的酯化形成，或通過以高級醇和乙酰輔酶A為底物經(jīng)醇乙酰轉(zhuǎn)移酶的生物合成產(chǎn)生[16]，其在漲袋和正常生抽樣品中累計平均相對含量分別為8.96%和7.43%。酮類物質(zhì)是醬油中產(chǎn)生麥芽香味的主要成分，可以通過脂質(zhì)氧化或Strecker反應(yīng)誘導(dǎo)氨基酸降解產(chǎn)生[17]，其在漲袋和正常生抽樣品中累計平均相對含量分別為13.21%和15.66%，可見正常生抽可能具有較好的麥芽香氣。二甲基硫是本研究中唯一被解析出的含硫化合物，其在漲袋和正常生抽樣品中平均相對含量分別為0.52%和0.15%，鄧岳等[18]使用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)工藝釀造醬油中亦含有該物質(zhì)，雖然在醬油中含量僅為3%，但對風(fēng)味品質(zhì)形成的影響較大。作為呋喃環(huán)系最重要的衍生物，糠醛是本研究從生抽中檢測出的唯一呋喃類物質(zhì)，其在漲袋和正常生抽樣品中平均相對含量分別為0.21%和0.07%，MENG Q等[19]研究表明，糠醛具有較高的揮發(fā)性，是戊糖通過美拉德反應(yīng)的主要脫水產(chǎn)物，在制曲時對大豆和小麥的熱處理過程中形成。綜上所述，在漲袋生抽中醇類、酯類、二甲基硫和糠醛的累計含量更高可能是引起其味道刺鼻的主要原因，而正常生抽風(fēng)味相對溫和且具有較好的麥芽和堅果香氣。

2.3 漲袋和正常生抽中關(guān)鍵揮發(fā)性成分的比較分析

由于樣品中揮發(fā)性化合物的相對含量與其總體風(fēng)味特征之間無直接的關(guān)系，故而本研究使用相對氣味活度值（ROAV）對漲袋和正常生抽的總體風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了分析，在解析出的30種揮發(fā)性化合物中異戊醇和丁醇等11種化合物具有單體和二聚體兩種形態(tài)，本研究將一個物質(zhì)中單體和二聚體相對含量總和記為該物質(zhì)的相對含量值，并進(jìn)一步計算了各化合物在漲袋和正常生抽樣品中的ROAV值，ROAV＞0.1的揮發(fā)性化合物測定結(jié)果見表2。

表2 漲袋和正常生抽樣品中ROAV＞0.1的揮發(fā)性化合物Table 2 Volatile compounds in the light soy sauce in expanded bag and normal bag (ROAV＞0.1)

由表2可知，乙酸乙酯在生抽中的閾值為5.00 μg/L，且其在漲袋生抽J2樣品中的相對含量最高，對生抽整體的風(fēng)味貢獻(xiàn)較大，因此本研究將J2樣品中乙酸乙酯的ROAV定義為100，從而得到生抽中所有解析出化合物的ROAV。經(jīng)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，在3個樣品中共存在16種對生抽總體風(fēng)味具有較為重要貢獻(xiàn)的風(fēng)味化合物，包括4種醇類、5種酯類、3種醛類、3種酮類和1種含硫類。通常認(rèn)為0.1≤ROAV＜1的物質(zhì)是修飾樣品整體風(fēng)味的化合物，ROAV＞1的物質(zhì)是樣品中的關(guān)鍵風(fēng)味化合物，且ROAV越大代表該化合物在樣品的風(fēng)味品質(zhì)中貢獻(xiàn)越大[29]。因此，根據(jù)方差分析結(jié)果，在本研究解析出的10種關(guān)鍵風(fēng)味化合物（ROAV＞1）中，異戊醇、乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸-2-甲基丁酯、3-羥基-2-丁酮和二甲基硫6種化合物在漲袋生抽中含量顯著高于正常樣品（P＜0.05），可能是這些化合物的共同作用從而引起漲袋生抽的刺激性氣味；乙酸甲酯、2-甲基丁醛和丙酮等3種化合物在正常生抽中含量顯著高于漲袋樣品（P＜0.05），而2-甲基丙醛僅在J2漲袋生抽樣品中含量顯著高于正常樣品（P＜0.05），J1中顯著低于正常樣品（P＜0.05），故而無法明確生抽漲袋變質(zhì)對于2-甲基丙醛含量的影響。

2.4 漲袋和正常生抽中差異揮發(fā)性化合物分析

為了進(jìn)一步解析漲袋和正常生抽中具有顯著差異的揮發(fā)性化合物，本研究使用PLS-DA對解析出的30種化合物進(jìn)行了投影變量重要性（variable important in projection，VIP）分析，并繪制了差異揮發(fā)性化合物的熱圖，結(jié)果見圖3。

圖3 漲袋和正常生抽中差異揮發(fā)性化合物偏最小二乘回歸分析熱圖Fig.3 Heat map of partial least squares discriminant analysis of differential volatile compounds in expanded and normal light soy sauce

由圖3可知，漲袋和正常生抽中共存在11種差異揮發(fā)性化合物，包括異戊醇、3-羥基-2-丁酮、丙酮、乙酸乙酯、2-丁醇、乙醇、1-丙醇、異丁醇、2-丁酮、苯甲醛和乙酸，其VIP值分別為2.04、2.00、1.62、1.53、1.42、1.35、1.33、1.33、1.18、1.14和1.08。相較于正常生抽，漲袋生抽中異丁醇、1-丙醇、3-羥基-2-丁酮、異戊醇、乙酸乙酯和2-丁醇的含量相對偏高，而乙醇、丙酮、2-丁酮、苯甲醛和乙酸的含量相對偏低，故而可推測漲袋生抽風(fēng)味品質(zhì)變差可能與這些化合物含量的變化有關(guān)。

為了分析生抽樣品中差異揮發(fā)性化合物與其風(fēng)味品質(zhì)的相關(guān)性，本研究結(jié)合電子鼻數(shù)據(jù)繪制熱圖，結(jié)果見圖4。由圖4可知，丙酮和苯甲醛含量與W2W（對有機(jī)硫化物靈敏）和W3S（對烷烴靈敏）均呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），2-丁酮含量與W1C（對芳香類物質(zhì)靈敏）和W5C（對烷烴、芳香類物質(zhì)靈敏）均呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與W3C（對氨氣、芳香類物質(zhì)靈敏）呈極顯著正相關(guān)（P＜0.001），與W1W（對有機(jī)硫化物、萜類物質(zhì)靈敏）呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。綜上所述，漲袋后生抽中腐敗微生物可能對丙酮、2-丁酮和苯甲醛等風(fēng)味化合物進(jìn)行了利用，這可能是引起漲袋生抽中芳香類物質(zhì)的含量明顯降低，而有機(jī)硫化物、萜類物質(zhì)和烷烴類物質(zhì)的含量明顯升高的一個重要原因。

3 結(jié)論

本研究采用電子鼻和GC-IMS技術(shù)對漲袋生抽樣品的風(fēng)味進(jìn)行了解析，電子鼻結(jié)果顯示，生抽漲袋后其風(fēng)味品質(zhì)明顯變差，主要表現(xiàn)出芳香類物質(zhì)含量降低及機(jī)硫化物、萜類物質(zhì)和烷烴類物質(zhì)含量的增加，而GC-IMS結(jié)果顯示生抽漲袋后異丁醇、1-丙醇、3-羥基-2-丁酮、異戊醇、乙酸乙酯和2-丁醇的含量相對增高，而乙醇、丙酮、2-丁酮、苯甲醛和乙酸的含量相對降低，相關(guān)性分析顯示，引起漲袋生抽風(fēng)味品質(zhì)變劣的主要原因可能與丙酮、苯甲醛和2-丁酮含量的降低相關(guān)。