楊 豪，楊圓慧，李為蘭，資璐熙，徐檸檬，郭 磊*

（西南林業(yè)大學 生命科學學院，云南 昆明 650224）

美味牛肝菌（Boletus edulisBull.Fr.）是珍稀的肉質大型真菌，在我國主要分布于西部地區(qū)[1-2]。美味牛肝菌兼具食藥用價值，含有蛋白質、氨基酸、維生素等多種營養(yǎng)成分及多糖、多酚和黃酮等多種活性成分[3-5]，具有抗氧化、增強免疫力、預防腫瘤細胞增殖、調節(jié)腸胃、促消化、清熱解毒、增強機體清除自由基的能力、抑制肥胖等多種生理功能[6-9]。美味牛肝菌的風味成分主要由揮發(fā)性的呈香成分和非揮發(fā)性呈味成分組成。揮發(fā)性呈香成分主要包括醇、酮、酸、酯、醛、烴類化合物等，組成了美味牛肝菌的特征風味，其中苯甲醛呈現出櫻桃和堅果氣味，己醛呈現出果香、花香、木香和葉香等[10-13]。目前，頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜（headspace solid phase microextraction-gas chromatographymass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）已廣泛應用于檢測果蔬中的揮發(fā)性風味物質，具有方便快捷、靈敏度高、選擇性與重復性好的特點[14-15]。非揮發(fā)性呈味成分主要包括呈味核苷酸、有機酸、可溶性糖等，其中呈味核苷酸和有機酸可增添口感層次，可溶性糖可產生甜味[16-17]。

我國美味牛肝菌資源豐富，固體風味基料能夠較好地保持美味牛肝菌特有的天然風味，提高人們對食品的接受度，也符合食品工業(yè)健康營養(yǎng)的要求[18-19]。因此，本研究以料液比、熬制溫度、熬制時間為自變量，以蛋白質溶出率為響應值，在單因素試驗基礎上，采用響應面試驗優(yōu)化美味牛肝菌湯的最佳熬制工藝；以美味牛肝菌湯凍干粉為基料，采用HS-SPME/GC-MS分析其揮發(fā)性風味物質組成，并采用均勻設計優(yōu)化美味牛肝菌湯風味基料的配方，為美味牛肝菌湯及其固體風味基料的工業(yè)化生產提供一定的理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

美味牛肝菌：2022年6月購自云南玉溪易門；牛血清蛋白、考馬斯亮藍G-250、氯化鈉（均為分析純）：上海勵瑞生物技術有限公司；食鹽、白砂糖、味精、檸檬酸：市售。

1.2 儀器與設備

FA1004型電子天平：上海精密科學儀器有限公司；DZF-6020型真空干燥箱：上海博迅實業(yè)有限公司；YB-250A型高速多功能粉碎機：永康市速鋒工貿有限公司；UV-VIS 300紫外分光光度計：美國賽默飛世爾科技有限公司；HH-2數顯電子恒溫水浴鍋：北京康光儀器有限公司；YTLG-12A型真空冷凍干燥機：上海葉拓科技有限公司；7890B氣質聯用儀：美國Agilent公司；57328-U型50/30 μmDVB/CAR/PDMS固相微萃取頭：美國Supelco公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 美味牛肝菌湯的熬制工藝流程

美味牛肝菌→清洗→晾干→切片→真空干燥→粉碎→熬煮→菌湯

操作要點[20]：挑選新鮮美味牛肝菌，洗凈后瀝干水分，切成厚度約為0.5 cm的片狀，70 ℃條件下真空干燥8 h，粉碎后過60目篩后備用。取美味牛肝菌粉1 g，按照料液比1∶70（g∶mL）加入去離子水，密封，70 ℃熬制55 min，待熬制試驗結束后，過濾去渣后得到濾液，即為美味牛肝菌湯。

1.3.2 美味牛肝菌湯熬制工藝優(yōu)化

（1）單因素試驗

設置基礎條件為料液比1∶70（g∶mL）、熬制溫度70 ℃、熬制時間55 min，探究不同料液比（1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80、1∶90（g∶mL））、熬制溫度（40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃）、熬制時間（35 min、45 min、55 min、65 min、75 min、85 min）對美味牛肝菌湯蛋白質溶出率的影響。

（2）響應面試驗

在單因素試驗結果基礎上，以料液比（A）、熬制溫度（B）和熬制時間（C）為自變量，蛋白質溶出率（Y1）為響應值，使用Design-Expert 13軟件進行3因素3水平的響應面優(yōu)化設計，試驗因素與水平見表1。

表1 美味牛肝菌湯熬制工藝優(yōu)化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for cooking process optimization of Boletus edulis soup

1.3.3 蛋白質溶出率的計算

采用凱氏定氮法[21]對美味牛肝菌中的蛋白質總含量進行測定。采用考馬斯亮藍法[22]對菌湯中的可溶性蛋白質含量進行測定，計算蛋白質溶出率，其計算公式如下：

式中：C1為菌湯中蛋白質含量，mg/mL；V1為菌湯體積，mL；M為蛋白質總含量，mg。

1.3.4 美味牛肝菌湯凍干粉揮發(fā)性風味物質分析

將美味牛肝菌湯凍結放入真空冷凍干燥機內，干燥24 h得美味牛肝菌湯凍干粉。參考FENG T等[23]的HS-SPME-GCMS法略微修改，測定美味牛肝菌湯凍干粉揮發(fā)性風味物質。

萃取頭老化：采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭，初次使用時需在GC進樣口以250 ℃老化30 min，之后每次使用前均老化10 min。

HS-SPME條件：稱取美味牛肝菌凍干粉樣品0.500 g于20 mL頂空瓶中，在79 ℃條件下萃取28 min后，將老化好的萃取頭插入頂空瓶吸附23 min，然后迅速將萃取頭插入氣相色譜進樣口進行解吸。

GC條件：HP-5MS毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），載氣為高純氦氣（He），流速1.0 mL/min，不分流模式進樣，進樣口溫度250 ℃。升溫程序為初始溫度40 ℃，保持5 min，以5 ℃/min升溫至260 ℃，保持2 min。

質譜條件：電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV，傳輸線溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，掃描方式為全掃描，30～400 m/z。

定性、定量分析：經美國國家標準技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）Library 14.0譜圖庫檢索，并結合相關文獻報道確定其成分，相對百分含量按峰面積歸一化法計算[24]。

1.3.5 美味牛肝菌湯固體風味基料配方優(yōu)化均勻試驗

以美味牛肝菌凍干粉為基料，參考費英敏等[25]的試驗設計，以食鹽（X1）、白砂糖（X2）、味精（X3）、檸檬酸（X4）為輔料，以感官評分（Y2）為評價指標，采用Excel 2021設計U9（95）均勻試驗優(yōu)化固體風味基料的配方，試驗因素與水平見表2。

表2 美味牛肝菌固體風味基料配方優(yōu)化均勻試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of uniform tests for formula optimization of Boletus edulis solid flavor base material

1.3.6 美味牛肝菌固體風味基料的感官評價

以美味牛肝菌湯凍干粉為原料調配固體風味基料，由10名（男性女性各5名）經過專業(yè)培訓的感官評價人員組成評價小組，從香味、滋味及色澤三個方面對其進行感官評價。在感官評價過程中，對樣品進行隨機編號，使感官評價人員進行獨立客觀的評價，具體感官評分標準見表3[26]。

表3 美味牛肝菌固體風味基料感官評分標準Table 3 Sensory score standards of Boletus edulis solid flavor base material

1.3.7 數據分析

所有數據均平行測定3次，結果以“平均數±標準差”表示。試驗數據處理由Excel 2021完成，作圖由Origin 2017和Design-Expert 13完成，方差分析由SPSS 20.0完成。

2 結果與分析

2.1 美味牛肝菌湯熬制工藝優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 料液比對美味牛肝菌湯蛋白質溶出率的影響

料液比對美味牛肝菌湯蛋白質溶出率的影響見圖1。由圖1可知，美味牛肝菌湯中蛋白質溶出率隨料液比的增加呈現先急劇增加后趨于減小的趨勢，當料液比為1∶70時，蛋白質溶出率達到最高，為18.11%。料液比越小，美味牛肝菌與溶劑混合越充分、均勻，溶質分子更容易分散于溶劑中，有利于蛋白質溶出，但原料中蛋白質含量是一定的，存在溶解平衡，當料液比持續(xù)減小時蛋白質溶出率不會進一步增加，反而會呈現降低的趨勢[27]，故確定最佳料液比為1∶70（g∶mL）。

圖1 料液比對美味牛肝菌湯蛋白質溶出率的影響Fig.1 Effect of solid and liquid ratio on the protein dissolution rate of Boletus edulis soup

2.1.2 熬制溫度對美味牛肝菌湯蛋白質溶出率的影響

熬制溫度對美味牛肝菌湯蛋白質溶出率的影響見圖2。由圖2可知，隨熬制溫度的升高，美味牛肝菌湯中的蛋白質溶出率呈先增大后減小的趨勢，當熬制溫度為70 ℃時，蛋白質溶出率達到最大，為18.34%，分析原因可能是由于高溫條件下蛋白質會變性造成溶解度下降[28]，故確定最佳熬制溫度為70 ℃。

2.1.3 熬制時間對美味牛肝菌湯蛋白質溶出率的影響

熬制時間對美味牛肝菌湯蛋白質溶出率的影響見圖3。由圖3可知，美味牛肝菌湯的蛋白質溶出率隨著熬制時間的延長呈先增大后減小的趨勢，當熬制時間為45 min時，蛋白質溶出率最大，達18.77%，此時菌湯中含氮化合物含量最高。熬制時間＞45 min后，蛋白質溶出率急劇下降，可能是蛋白質在長時間熬制下發(fā)生水解反應，蛋白質的水解速率大于溶出速率[29]，導致蛋白質溶出率降低，因此，確定最佳熬制時間為45 min。

圖3 熬制時間對美味牛肝菌湯蛋白質溶出率的影響Fig.3 Effect of cooking time on the protein dissolution rate of Boletus edulis soup

2.2 美味牛肝菌湯熬制工藝優(yōu)化響應面試驗結果及分析

2.2.1 響應面回歸模型的建立及分析

在單因素試驗結果的基礎上，以料液比（A）、熬制溫度（B）和熬制時間（C）為自變量，蛋白質溶出率（Y1）為響應值，采用Design-Expert 13設計3因素3水平的響應面優(yōu)化試驗，試驗設計及結果見表4，方差分析見表5。

表4 美味牛肝菌湯熬制工藝優(yōu)化響應面試驗設計與結果Table 4 Design and results of response surface tests for cookingprocess optimization of Boletus edulis soup

采用Design-Expert 13軟件對表4結果進行多元回歸擬合，得到回歸方程：Y1=20.58+1.02A-0.0375B+0.02C+0.645AB-0.035AC+0.26BC-2.05A2-1.7B2-0.745 5C2。

由表5可知，該模型顯著（P＜0.05），失擬項不顯著（P＞0.05），說明該模型具有較強的統(tǒng)計學意義。由P值可知，一次項A，二次項A2、B2、C2對蛋白質溶出率的影響極顯著（P＜0.01），交互項AB對蛋白溶出率影響顯著（P＜0.05），其他項對蛋白質溶出率影響不顯著（P＞0.05）。由F值可知，各因素對美味牛肝菌湯蛋白質溶出率影響的大小順序為料液比（A）＞熬制溫度（B）＞熬制時間（C）。

2.2.2 各因素間交互作用分析

采用Design-Expert 13軟件繪制料液比與熬制溫度間交互作用對蛋白質溶出率影響的響應面及等高線圖見圖4。

圖4 料液比與熬制溫度間交互作用對蛋白質溶出率影響的響應曲面及等高線Fig.4 Response surface plot and contour lines of effects of interaction between solid and liquid ratio and cooking temperature on protein dissolution rate

由圖4可知，料液比和熬制溫度間交互作用對美味牛肝菌湯蛋白質溶出率影響的響應面陡峭，等高線呈橢圓形，說明其對菌湯蛋白質溶出率的影響顯著，與方差分析結果一致。

2.2.3 驗證試驗

采用Excel 2021對回歸方程進行求解，得美味牛肝菌湯熬制的最佳工藝條件為料液比1∶73.69（g∶mL）、熬制溫度68.76 ℃、熬制時間53.10 min，此條件下蛋白質溶出率預測值為20.10%?？紤]實際操作，將試驗條件調整為料液比1∶74（g∶mL）、熬制溫度70 ℃、熬制時間50 min，在此條件下蛋白質溶出率實際值為20.12%，與理論值相差0.02%，說明該回歸模型與實際試驗過程匹配度高，可以有效地優(yōu)化美味牛肝菌的熬制工藝。

2.3 美味牛肝菌湯凍干粉揮發(fā)性風味物質分析

采用HS-SPME-GC-MS對美味牛肝菌湯凍干粉的揮發(fā)性風味物質進行分析，結果見表6。

表6 美味牛肝菌湯凍干粉揮發(fā)性風味物質GC-MS分析結果Table 6 Results of volatile flavor components of Boletus edulis soup lyophilized powder analyzed by GC-MS

由表6可知，從美味牛肝菌湯凍干粉中共檢測出29種揮發(fā)性風味物質，其中烴類4種、醇類1中、醛類4種、酮類5種、酸類1種、酯類2種、醚類1種、含硫化合物3種及含氮化合物8種。酮類化合物相對含量（31.66%）最高，其次為含氮化合物（26.46%）和酸類化合物（19.00%）。美味牛肝菌湯凍干粉中揮發(fā)性C8化合物和含硫化合物因含量豐富、識別閾值較低，且對食用菌的風味品質影響較大，被認為是食用菌中的特征揮發(fā)性風味物質[30]。在檢測到的C8化合物中，苯乙醛是具有類似水果的香氣[31]，相對含量為0.93%。含硫化合物主要有2-異丁基5-丙基噻吩（4.58%）、3-甲硫基丙醛（0.45%）和甲硫醇（0.36%）。吡嗪類化合物相對含量為1.67%，是羰基化合物與氨基化合物在一定條件下發(fā)生美拉德反應的產物[32]。

2.4 美味牛肝菌固體風味基料配方優(yōu)化均勻試驗

以美味牛肝菌湯凍干粉為基料，食鹽（X1）、白砂糖（X2）、味精（X3）和檸檬酸（X4）為輔料，感官評分（Y2）為評價指標，通過均勻試驗U9（95）優(yōu)化配方，結果見表7，方差分析見表8。

表7 美味牛肝菌固體風味基料配方優(yōu)化均勻試驗設計及結果Table 7 Design and results of uniform tests for formula optimization of Boletus edulis solid flavor base material

表8 均勻試驗結果的方差分析Table 8 Variance analysis of uniform tests results

采用Excel 2021對表7試驗結果進行線性回歸分析，得到食鹽（X1）、白砂糖（X2）、味精（X3）、檸檬酸（X4）對感官評分（Y2）的線性回歸方程：Y2=92.847+6.672X1-2.193X2+3.127X3-4.934X4。由表8可知，回歸模型極顯著（P＜0.01），表明建立的回歸方程具有統(tǒng)計學意義。決定系數R2=0.996，調整決定系數R2Adj=0.986，說明該數學模型與試驗結果擬合較好[33]。根據t檢驗可知，影響固體風味基料感官評價的因素主次順序為X1＞X4＞X2＞X3。對回歸方程求解得到美味牛肝菌固體風味基料的最優(yōu)配方為：食鹽4.5%、白砂糖3.0%、味精1.8%、檸檬酸0.1%，在此條件下預測得到的感官評分為93.13分。通過驗證試驗得固體風味基料感官評分為93.22分，與理論值相差0.09，制備得到的固體風味基料顏色成淺棕褐色，具有濃郁的美味牛肝菌風味，表明所建立的模型與試驗結果具有較好的一致性，能夠對固體風味基料配方進行優(yōu)化。

3 結論

在單因素試驗基礎上，采用響應面法優(yōu)化得到美味牛肝菌湯的最佳熬制工藝為料液比1∶74（mL∶g）、熬制溫度70 ℃、熬制時間50 min，在此條件下的蛋白質溶出率達20.12%。通過HS-SPME/GC-MS鑒定美味牛肝菌湯凍干粉，共檢出29種揮發(fā)性風味物質，酮類化合物（31.66%）、含氮化合物（26.46%）和酸類（19%）是相對含量最高的三類。以菌湯凍干粉為基料，采用均勻設計研制出美味牛肝菌固體風味基料的最佳配方為食鹽4.5%、白砂糖3.0%、味精1.8%、檸檬酸0.1%，制備得到的固體風味基料顏色成淺棕褐色，具有濃郁的美味牛肝菌風味，感官評分為93.22分。本研究結果為美味牛肝菌深加工及風味調味料的研究奠定一定的理論基礎，有著廣闊的市場發(fā)展前景。