謝夢婷　解一凡　朱夢婷　南穎　方晨輝　江白慧　齊行東　趙宗勝

摘要：目的 篩選、鑒定綿羊卵巢差異MicroRNA（miRNA）并研究其調(diào)控機(jī)制，為綿羊非繁殖季節(jié)發(fā)情的研究奠定基礎(chǔ)。方法 使用Solexa測序技術(shù)進(jìn)行篩選和分析，對發(fā)情和乏情綿羊卵巢，差異miRNA的數(shù)量和特征進(jìn)行鑒定，通過實時熒光定量PCR進(jìn)行檢測。還進(jìn)行了對miR-200c靶基因檢測、GO注釋和KEGG信號通路富集等的研究工作。并通過TargetScan技術(shù)、RNAhybrid技術(shù)等，成功找到了MAPK8-3′端非翻譯區(qū)（3′UTR）與miR-200c的潛在互補(bǔ)結(jié)合位點，PCR擴(kuò)增MAPK8（絲裂原活化蛋白激酶8）基因的3′UTR序列，并成功實現(xiàn)了在psiCHECK2的克隆，成功建立了MAPK8野生型/突變型重組的雙熒光素酶報告質(zhì)粒。接著把野生型psiheck2-MAPK8-3′UTR/突變型psiheck2-MAPK8-mut3′UTR的質(zhì)粒，與miR-200c mimics/mimics－NC，轉(zhuǎn)染至HEK 293T細(xì)胞中，從而通過雙熒光素酶的系統(tǒng)，測定雙熒光素酶的生物活性。結(jié)果 建立了OAN（乏情）和OEN（發(fā)情）非繁殖季節(jié)綿羊卵巢文庫。鑒定出113個差異miRNA，9個為已知miRNA，104個為未知miRNA。在已知miRNA中有6個miRNA顯著（P<0.05）上調(diào)、3個下調(diào)，其中上調(diào)倍數(shù)最高的為miR-200c。在104個未知的miRNA中，有52個miRNA顯著（P<0.05）上調(diào)，52個顯著（P<0.05）下調(diào)。獲得候選新miRNA的長度分布主要集中在21～23 nt之間。熒光定量證實，miRNA表達(dá)的趨勢與測序結(jié)果一致。用軟件預(yù)測到miR-200c的27個靶基因。GO注釋發(fā)現(xiàn)miR-200c在卵巢組織中介導(dǎo)細(xì)胞增殖、遷移、凋亡等過程。KEGG分析表明，miR-200c的靶基因涉及發(fā)情相關(guān)途徑（MAPK信號途徑、胰島素信號通路和GnRH信號途徑）以及與卵泡/黃體發(fā)育相關(guān)的途徑，MAPK通路是富集基因最多的通路，共有25個基因被富集。干擾miR-200cmimics，會引起MAPK8基因的Wt型質(zhì)粒的熒光表達(dá)明顯減少（P<0.05），而Mut型則沒有明顯改變。結(jié)論 篩選出非繁殖季節(jié)發(fā)情差異顯著（P<0.05）的miRNA有6個。試驗研究初步證實了miR-200c與MAPK8的靶向關(guān)系，開展了miRNA家族調(diào)節(jié)綿羊非繁殖季節(jié)發(fā)情的試驗，為深入研究其調(diào)控綿羊繁殖及卵泡發(fā)育機(jī)制提供了試驗基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：綿羊；卵巢；非繁殖季節(jié)發(fā)情；miR-200c；MAPK8

中圖分類號：中圖分類號S813文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文獻(xiàn)標(biāo)識碼

Screening and preliminary verification of miRNA related to estrus in sheep

during the non－breeding season

XIE Mengting，XIE Yifan，ZHU Mengting，NAN Ying，F(xiàn)ANG Chenhui，JIANG Baihui，QI Xingdong，

ZHAO Zongsheng*

（College of Animal Science and Technology， Shihezi University， Shihezi，Xinjiang 832000，China）

Abstract：? Objective Screening and identification of microRNAs （miRNAs） in sheep ovaries and studying their regulatory mechanisms laid the foundation for the study of sheep estrus in the non－breeding season.Methods Screening and analysis using Solexa sequencing technology to identify the number and characterisation of differential miRNAs， by real－time fluorescence quantitative PCR， in oestrus and estrus sheep ovaries. Work was also carried out on miR-200c target gene detection， GO annotation and enrichment of the KEGG signalling pathway. The potential complementary binding site of MAPK8-3′-end untranslated region （3′UTR） and miR-200c was successfully found by TargetScan technology and RNAhybrid technology， and the 3′UTR sequence of MAPK8 （mitogen－activated protein kinase 8） gene was PCR amplified and cloning in psiCHECK2 was successfully achieved， and a dual luciferase reporter plasmid for MAPK8 wild－type/mutant recombination was successfully established. The plasmid of wild－type psiheck2-MAPK8-3′UTR/mutant psiheck2-MAPK8-mut3′UTR， with miR-200c mimics/mimics－NC， was then transfected into HEK 293T cells， thereby measuring the biological activity of the dual luciferase by a dual luciferase system. Results A library of OAN （absence） and OEN （estrus） non－breeding season sheep ovaries was established. 113 differential miRNAs were identified， 9 were known miRNAs and 104 were unknown miRNAs. Six of the known miRNAs were significantly （P<0.05） up－regulated and three were down－regulated， with the highest up－regulation fold being miR-200c. Of the 104 unknown miRNAs， 52 were significantly （P<0.05） up－regulated and 52 were significantly （P<0.05） down－regulated. The length distribution of the obtained candidate new miRNAs was mainly concentrated in the range of 21～23 nt. Fluorescence quantification confirmed that the trend of miRNA expression was consistent with the sequencing results. The software was used to predict the 27 target genes of miR-200c. GO annotation revealed that miR-200c mediates cell proliferation， migration， and apoptosis in ovarian tissue. KEGG analysis showed that the target genes of miR-200c were involved in estrus－related pathways （MAPK signalling pathway， insulin signalling pathway and GnRH signalling pathway） and pathways associated with follicular/luteal development， with the MAPK pathway being the most enriched pathway with a total of 25 genes enriched. Interfering with miR-200cmimics caused a significant decrease in fluorescent expression of the Wt－type plasmid of the MAPK8 gene （P<0.05）， while the Mut－type was not significantly altered. Conclusion Six miRNAs were screened for significant （P<0.05） differences in non－breeding season estrus. The experimental study initially confirmed the targeting relationship between miR-200c and MAPK8， and carried out experiments on the miRNA family regulating estrus in sheep during the non－breeding season， providing an experimental basis for an in－depth study on its mechanism of regulating reproduction and follicle development in sheep.

Key words： sheep;ovary;non－breeding season estrus;miR-200c;MAPK8

綿羊的生殖功能受到光周期的強(qiáng)烈影響，從乏情到發(fā)情的轉(zhuǎn)變通常發(fā)生在夏末或初秋，而發(fā)情周期在冬末或初春停止［1］。隨著繁殖季節(jié)開始，綿羊卵巢上卵泡的發(fā)育也呈現(xiàn)周期性變化［2］。綿羊的季節(jié)性發(fā)情直接影響生產(chǎn)效率和經(jīng)濟(jì)成本，對養(yǎng)羊業(yè)及羊肉的產(chǎn)量有重大的影響［3］。季節(jié)性發(fā)情是動物繁殖力的關(guān)鍵限制因素，它涉及卵巢生物學(xué)和激素分泌在不同季節(jié)的變化。因此，對卵巢周期性變化相關(guān)機(jī)制的研究來提高發(fā)情率在養(yǎng)羊業(yè)中是非常重要的。

以往的研究表明，miRNAs在卵巢生物學(xué)中起著重要的調(diào)節(jié)作用。為了解miRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控在綿羊季節(jié)性發(fā)情中的作用，利用Solexa測序技術(shù)分析了綿羊發(fā)情間期和繁殖季節(jié)卵巢miRNA表達(dá)模式的變化。

MicroRNA（miRNA）是長度為22～24 nt的短RNA序列，通過在轉(zhuǎn)錄后水平抑制轉(zhuǎn)錄或下調(diào)mRNA來調(diào)節(jié)基因表達(dá)，可以由單獨的基因編碼或嵌入蛋白質(zhì)編碼基因的內(nèi)含子或外顯子區(qū)域，然后轉(zhuǎn)錄為單基因或多順反子簇形成莖環(huán)二級結(jié)構(gòu)［4］。成熟的miRNA通過與mRNA 3或5UTR的種子序列（7～8 nt）互補(bǔ)堿基對結(jié)合，抑制了mRNA的翻譯，從而導(dǎo)致了mRNA的降解［5］。miRNA也可以通過增強(qiáng)基因表達(dá)，在機(jī)體內(nèi)針對細(xì)胞增殖分化、激素分泌和腫瘤細(xì)胞遷移等過程進(jìn)行有針對性的調(diào)控［6］。此外，最新研究表明，miRNA對于生殖細(xì)胞分化和生殖系統(tǒng)的發(fā)育是必不可少的［7］。

近年來大量研究證實卵巢組織富含的多種穩(wěn)定miRNA可直接調(diào)控卵泡發(fā)生、排卵、黃體發(fā)育、黃體退化、激素分泌等過程［8］。蘇倩等［9］發(fā)現(xiàn)hsa－miR-200c-3p廣泛的參與人類生命活動和疾病過程，與癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。研究表明，miR-200c在原始生殖細(xì)胞分化過程中表達(dá)逐漸降低［10］。絲裂原活化蛋白激酶8（Mitogen－activated protein kinase 8，MAPK8）表達(dá)異常，與多種常見腫瘤（如肝癌、口腔癌等）的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［11-12］。Wang等［13］在研究抑制MAPK8后，生殖相關(guān)基因的表達(dá)受到明顯抑制，MAPK8的敲除/過表達(dá)可以通過抑制/激活JNK信號影響胚胎干細(xì)胞（Embryonic stem cell，ESC）的分化。Nan等［14］研究發(fā)現(xiàn)，miR-200c的表達(dá)，明顯地減少了卵巢顆粒細(xì)胞中，MAPK8的表達(dá)量，但同時也間接調(diào)控了其他與卵泡成熟相關(guān)基因的過表達(dá)，從而更有效地控制了卵泡成熟。Cheng等［15］研究結(jié)果表明Mapk8基因能提高卵母細(xì)胞的成熟。

本試驗在乏情季節(jié)中，利用Solexa的檢測方法，研究了發(fā)情及不發(fā)情綿羊卵巢中，miRNA家族的表達(dá)量。通過篩選綿羊卵巢中的關(guān)鍵差異miRNA、GO注釋、KEGG信號通路分析等，注釋到了MAPK通路等關(guān)鍵通路，通過使用預(yù)測程序，檢測到了miR-200c的靶基因MAPK8基因，通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證miR-200c和MAPK8之間的互相作用，對于明確卵巢中差異miRNA家族，以及調(diào)控綿羊季節(jié)性繁殖的分子機(jī)理，都有著重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物及樣品采集

于非繁殖季節(jié)（5—6月）在石河子大學(xué)動物實驗站選擇年齡2～3歲、體重相近、健康狀況良好的經(jīng)產(chǎn)哈薩克母羊。

每日08∶30和16∶00進(jìn)行公羊試情，將公羊引入綿羊圈中，監(jiān)測發(fā)情率。發(fā)情特征：綿羊首次接受公羊爬跨、陰道泛紅和生殖器腫脹。選擇3只處于發(fā)情后期的綿羊，人工宰殺采集卵巢。同時選3只未發(fā)情綿羊，屠宰收集卵巢。卵巢樣本立即冷凍在液氮中，分別提取總RNA。

1.1.2 主要試劑及儀器

Trizol購自賽默飛公司，Agilent BioAnalyzer 2100購自美國Agilent公司，NotI和XhoI及Lipofectamine 2000購自美國Thermo Fisher Scientific公司，連接酶T4、miRcute miRNA熒光定量試劑盒均購自上海TIANGEN生物有限公司，HEK 293T細(xì)胞購自Shanghai Cell Bank，大腸桿菌DH5α購自Sangon Biotech公司，質(zhì)粒psiCHECK2購自Promega公司，Opti－MEM購自Gibco Life Technologies公司，miR-200c mimics及相應(yīng)的陰性對照物內(nèi)參mimics－NC購自Ribobio公司。

實時熒光定量PCR儀（Roche LightCycler 96）購自Roche公司；紫外分光光度計購自NanoDrop公司；酶標(biāo)儀購自美國Tecan公司；凝膠成像系統(tǒng)購自上海培清科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取

先提取綿羊卵巢總RNA，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以檢測其完整性。再利用Nanodrop ND-2000分析儀，測定綿羊卵巢RNA的濃度、D260和D280 nm值。最后，使用Agilent BioAnalyzer 2100，對樣品進(jìn)行質(zhì)量檢測。

1.2.2 高通量測序及文庫構(gòu)建

使用6個經(jīng)過合格檢測的綿羊卵巢樣品，進(jìn)行miRNA文庫構(gòu)建和高通量測序，該過程由中國北京基因組研究所完成。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳法（PAGE），從綿羊卵巢RNA中分離出15～30 nt RNA，并將其進(jìn)行純化，最后將其連接到3′和5′接頭上，以獲得更準(zhǔn)確的結(jié)果。經(jīng)純化后送進(jìn)行Illumina Solexa測序，使用HiSeq2000平臺測序構(gòu)建OAN和OEN文庫。每個樣品需要使用3 μg的總RNA。第一步，利用SRNA的特殊構(gòu)造，在SRNA的3′和5′末端添加剪接。第二步，再以總RNA作為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到目標(biāo)cDNA。第三步，再利用PCR擴(kuò)增技術(shù)和PAGE凝膠電泳技術(shù)，分離出目標(biāo)DNA片段，并通過凝膠切除方法，來建立cDNA文庫。最后一步，在得到有效濃度和目標(biāo)數(shù)據(jù)數(shù)量后，將不同樣品的Raw Data合并，用于下一步的RNA－Seq分析。

1.2.3 測序數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析

原始數(shù)據(jù)移除重復(fù)序列、rRNA、scRNA、snoRNA、snRNA和tRNA等，然后對得到的miRNA進(jìn)行分類、注釋。miRNA與miRNA前體完全匹配或與miRBase 21.0中的成熟miRNA一致，且至少有16個核苷酸重疊的RNA分子就是新的miRNA。利用預(yù)測軟件mireap（適用于動物和植物）和mirDeep（適用于動物），就能夠預(yù)測未經(jīng)注釋過的新miRNA家族的，二級結(jié)構(gòu)、DICER裂解位點和最小自由能，以便尋找在外顯子、內(nèi)含子或基因間隔區(qū)中，都不能與基因組匹配的，新發(fā)現(xiàn)的miRNA。繪制已知和未知miRNA的log2（倍數(shù)變化）散點圖，來確定差異表達(dá)的miRNA。

1.2.4 實時熒光定量PCR驗證

在miRNA文庫中，選擇前6個差異顯著（P<0.05）的miRNA，通過反轉(zhuǎn)錄合成cDNA并進(jìn)RT－PCR。miRNA擴(kuò)增及內(nèi)參引物由?；锟萍脊驹O(shè)計合成（表1）。

20 μL體系，含2× miRcute miRNA Premix SYBR 10 μL、上下游引物各0.4 μL、ddH2O 8.2 μL和1 μL （500 ng·μL-1） cDNA。擴(kuò)增程序：94 ℃ 2 min；40個循環(huán)，每個循環(huán)94 ℃ 20 s和60 ℃ 34 s。

1.2.5 靶基因預(yù)測及功能分析

利用Ensembl網(wǎng)站的BioMart對靶基因進(jìn)行GO功能注釋，獲取靶基因的GO Term Accession，并利用BGI WEGO系統(tǒng)對其GO注釋結(jié)果進(jìn)行可視化。使用KEGG（http：//www.genome.jp/kegg/）進(jìn)行靶基因注釋，誤差≤0.05表示顯著富集。使用TargetScan和RNAhybrid預(yù)測miRNA靶基因，利用R的merge函數(shù)合并兩種預(yù)測方法的結(jié)果，獲取交集。通過miRBase 21.0和NCBI獲得miR-200c參考序列和綿羊MAPK8基因3′UTR序列，并使用TargetScan對它們的結(jié)合位點進(jìn)行預(yù)測（圖1）。

1.2.6 構(gòu)建野生型/突變型MAPK8基因雙熒光素酶報告質(zhì)粒

利用Primer 6.0，設(shè)計MAPK8-3′UTR區(qū)，在擴(kuò)增引物中，還包括miR-200c的結(jié)合位點（表2）。

以試驗綿羊卵巢cDNA為模板，設(shè)計合成了MAPK8-3′UTR序列片段，PCR擴(kuò)增體系為25 μL：95℃ 5 min；95℃ 30 s；56℃ 30 s；72℃ 30 s；35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。采用百分之一凝膠電泳，檢測與純化。使用XhoI和NotI雙酶切，利用T4連接酶連接PCR膠回收產(chǎn)物和psiCHECK2載體，構(gòu)建野生型psiCHECK2-3′UTR載體（psiCHECK2-MAPK8-wt3′UTR）和突變型psiCHECK2-MAPK8-3′UTR載體（psiCHECK2-MAPK8-mut3′UTR）。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到100 μL感受態(tài)大腸桿菌DH5α細(xì)胞中。在涂板中挑出5個陽性菌落，以1 μL發(fā)、大腸桿菌菌液PCR技術(shù)擴(kuò)增，并結(jié)合百分之一點五凝膠電泳鑒別產(chǎn)物，再篩選為陽性的克隆質(zhì)粒，并送至上海銳賽生物有限公司進(jìn)行檢測。

1.2.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及雙熒光素酶報告系統(tǒng)測定

先將對數(shù)生長的HEK 293T細(xì)胞，以每孔1.5×104個細(xì)胞，播種在24孔板中，并于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直到細(xì)胞密度達(dá)到八九成，再進(jìn)行轉(zhuǎn)染試驗。取2.5 μL miR-200c模擬物，或用上述miR-200c NC，與1 μL psiCHECK-MAPK8-3′UTR野生型/突變型質(zhì)粒混勻，然后根據(jù)不同組別，在約60 μL無血清Opti－MEM培養(yǎng)基中，稀釋后室溫孵育5 min。每組取2 μL Lipofectamine 2000，與50 μL無血清的，Opti－MEM培養(yǎng)基混合，室溫培養(yǎng)5 min。取50 μL無血清Opti－MEM培養(yǎng)基，顛倒混合均勻，室溫培養(yǎng)5 min。滴加Lipofectamine 2000 DNA稀釋液，混合均勻，靜置20 min，緩慢滴加到細(xì)胞表面，37℃ 5% CO2培養(yǎng)6 h，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。加入50μl LARII，搖晃后混合均勻。Dual－Reporter Assay System多功能酶標(biāo)儀，檢測螢火蟲熒光酶的熒光數(shù)值。每孔內(nèi)加入50 μL Stop&Glo試劑，搖動后混合，3 min后，用酶標(biāo)儀檢測海腎熒光酶熒光值。

1.3 統(tǒng)計分析

利用SPSS19.0和GraphPad Prism 9進(jìn)行處理和分析結(jié)果。采用2-ΔΔct法來表示miRNA的相對表達(dá)量，并將其與P<0.05相比較，以確定其統(tǒng)計學(xué)意義；根據(jù)測序結(jié)果，當(dāng)Fold－Change<1，P<0.01時，可以確定存在顯著的下調(diào)miRNA；而當(dāng)Fold－Change>1，P<0.05時，則可以確定存在顯著的上調(diào)miRNA。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計后，采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用GraphPad Prism 9和SPSS19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)結(jié)果處理分析；miRNA的相對表達(dá)量用2-ΔΔct法表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。差異表達(dá)顯著miRNA：測序結(jié)果中差異表達(dá)倍數(shù)Fold－Change<1，P<0.01，為已知或新增的下調(diào)miRNA；測序結(jié)果中Fold－Change＞1，P<0.05，為已知或新增的上調(diào)miRNA。

2 結(jié)果

2.1 高通量測序及miRNA文庫構(gòu)建

本研究利用6個哈薩克母羊卵巢樣本，成功構(gòu)建了兩個文庫，分別是OAN和OEN文庫。Unique reads去除接頭、低質(zhì)量、污染序列后OEN和OAN分別獲得了8 665 978及9 071 102個 clean reads。候選新miRNA長度分布主要集中在21～23 nt之間，OAN 22 nt讀數(shù)的百分比為54.60%，OEN為53.50%（圖2），新miRNA前體都具有典型的頸環(huán)結(jié)構(gòu)（圖3）。

通過與Rfam數(shù)據(jù)庫14.1重復(fù)相關(guān)RNA、外顯子和內(nèi)含子相關(guān)RNA，對miRBase 21.0中的非編碼sRNA進(jìn)行比對，并去除其中的rRNA、snRNA、snoRNA、tRNA和scRNA。對各類sRNA在Rfam數(shù)據(jù)庫的種類和總數(shù)進(jìn)行比對，表明兩個文庫大多數(shù)sRNA序列都為miRNA。除了高度保守的miRNA序列外，其他非編碼sRNAs的表達(dá)較少但可變序列較多（如scRNAs、srpRNAs、和其他sRNAs），顯示了Solexa測序的效率。Scatter plot圖顯示，OAN和OEN文庫中，共檢測到113個miRNA，其中9個為已知miRNA（6個miRNA上調(diào)、3個下調(diào)），104個為未知miRNA（52個miRNA上調(diào)、52個下調(diào)）（圖4，圖5）。

差異表達(dá)顯著（P<0.05）的前6個miRNA如表3所示，其中差異倍數(shù)最高的為miR-200c且僅在乏情綿羊卵巢中差異表達(dá)。其余表達(dá)豐富的miRNA有miR-20a、miR-133、miR-181a等。

2.2 測序結(jié)果的驗證

RT－qPCR結(jié)果顯示，miR-200c表達(dá)量差異極顯著（P<0.01），同時miR-200b和novel－miR-101的表達(dá)水平也達(dá)到了顯著水平（P<0.05）。另外，統(tǒng)計表明，miRNA的相對熒光表達(dá)量變化，與之前的Solexa測序結(jié)果相同，由此證明了miRNA高通量測序的可靠性（圖6）。

2.3 預(yù)測靶基因、注釋GO信息和分析KEGG通路

根據(jù)已有數(shù)據(jù)，共獲得了6個miRNA的靶基因，分別是miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-10a、novel－miR-101和miR-148a。預(yù)測到的靶基因個數(shù)分別為：115、87、27、75、147和31個。對下調(diào)的miRNA miR-200c的靶基因進(jìn)行GO和KEGG分析。經(jīng)過GO分析和富集后，主要涉及繁殖活動、代謝過程、生物調(diào)節(jié)、細(xì)胞過程等過程。

圖7表明，GO分析發(fā)現(xiàn)富集的包括繁殖活動、代謝過程、生物調(diào)節(jié)、細(xì)胞過程等。在生物過程方面，單組織——占87.18%、生物正向調(diào)節(jié)——占80.19%、多細(xì)胞生物——占83.88%；細(xì)胞組分分類中，與細(xì)胞相關(guān)的條目占——63.55%，細(xì)胞突觸占——72.92%、大分子化合物——占82.57%；分子功能方面，催化活性占——79.27%、抗氧化活性占——72.92%、受體活性——占76.22%。同時有63.55%和72.89%的靶基因參與了繁殖和生殖過程這些基因為：MAPK8、PAK2、SLC26A2、IGFBP1和DARS等。miR-200c共預(yù)測到27個靶基因。KEGG結(jié)果如圖8所示：富集到的靶基因與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝物、疾病有關(guān)。研究結(jié)果顯示，靶基因所注釋的通路數(shù)量為34個，靶基因在多個重要通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用，MAPK信號通路（MAPK signaling pathway，ID：ko04010）——占12.95%，胰島素信號通路（Insulin signaling pathway，ID： ko00564）——占10.88%，酮體的合成和降解通路占——10.36%。MAPK信號通路、甘油磷脂代謝信號通路（Glycerophospholipid metabolism，ID：ko04630）、GnRH信號通路（GnRH signaling pathway，ID：ko04912）、胰島素信號通路等與卵巢細(xì)胞的分裂、增殖等過程有關(guān)。MAPK通路共富集了25個靶基因，為基因富集最多的通路。

2.4 野生型/突變型的psiCHECK2載體構(gòu)建與鑒定

利用已提取的miR-200c靶向序列，通過選擇目標(biāo)引物，并擴(kuò)增MAPK8基因，檢測PCR產(chǎn)物序列，與預(yù)期設(shè)計相符，從而篩選出具有高特異性的目的基因，將該基因插入至psiCHECK2載體中，進(jìn)而利用菌液PCR檢測陽性菌。試驗結(jié)果表明，PCR產(chǎn)物大小為548 bp，與預(yù)期設(shè)計產(chǎn)物大小一致。（圖9）。

2.5 miR-200c對MAPK8表達(dá)的影響

按照分組（mimics+Wt、mimics+Mut、mimics+Wt NC+psiCHECK2、mimics+Mut NC+psiCHECK2），將mimics轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，檢測熒光值。結(jié)果顯示，mimics+Wt組的質(zhì)粒熒光顯著（P<0.05）低于mimics+Wt NC+psiCHECK2組。說明miR-200c和MAPK8 3UTR存在靶向關(guān)系（圖10）。

3 討論

3.1 高通量測序及候選miRNA預(yù)測

高通量測序技術(shù)目前廣泛用于動物miRNA組學(xué)研究。利用高通量測序，可以發(fā)現(xiàn)新miRNA，也可以鑒別已知的miRNA。本試驗使用了對哈薩克母羊卵巢組織，2種不同階段miRNA的表達(dá)情況，豐富了綿羊miRNA數(shù)據(jù)庫的資源。OAN和OEN共鑒定出113個差異miRNA，其中9個為已知miRNA，104個為未知miRNA，在9個已知的miRNA中有6個miRNA顯著（P<0.05）上調(diào)、3個下調(diào)。統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，104個候選miRNA序列的長度，都在21-23 nt的范圍內(nèi)。這個范圍與哺乳動物成熟miRNA的典型長度范圍相符，這一結(jié)論也得到了之前研究的支持［6］。因此，這些候選miRNA序列的長度特征，符合哺乳動物miRNA的一般規(guī)律。候選miRNA具有成熟miRNA的典型結(jié)構(gòu)特征。綿羊卵巢miRNA熒光定量結(jié)果與測序結(jié)果一致，進(jìn)一步證實了測序數(shù)據(jù)可靠。常衛(wèi)華等［16］研究了單一性別羔羊的綿羊卵巢miRNA表達(dá)，預(yù)測到104條候選新miRNA，且sRNA主要集中在22、23及24 nt上。綜上所述，不同物種篩選的miRNA類型和數(shù)量，可能因物種、品系、組織及發(fā)育階段不同而異。

3.2 miRNA在生殖過程中的作用

綿羊卵巢中不同數(shù)量的miRNA可直接或間接調(diào)節(jié)發(fā)情行為，使綿羊在發(fā)情末期開始發(fā)情。非繁殖季節(jié)發(fā)情中表達(dá)量最多的miRNA為miR-10a、novel－miR-101、miR-148a、miR-200c等。這些結(jié)果提示miR-200家族可能參與了卵泡期顆粒細(xì)胞增殖的抑制。在綿羊繁殖季節(jié)，卵巢處于發(fā)情周期，包括卵泡期和黃體期，顆粒細(xì)胞miR-200水平可能較高。但在發(fā)情期，卵巢的生理活性相對降低，不存在卵泡期。因此，顆粒細(xì)胞的增殖明顯減弱。除此之外一些表達(dá)豐富的miRNA如miR-20a、miR-133、miR-181a在牛、豬［17］、綿羊［18］的卵巢內(nèi)表達(dá)也是非常豐富的。miR-20a通過抑制BMPR2表達(dá)，并加速卵丘細(xì)胞黃體酮合成，從而調(diào)控卵母細(xì)胞成熟［19］。miR-181a過表達(dá)下調(diào)Smad3的磷酸化并阻斷TGF-β信號的激活miR-181a的表達(dá)上調(diào)TGFBR1和p－Smad3蛋白水平來調(diào)節(jié)豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡［17］。林嘉鵬等［20］利用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)miR-21與PIK3RI基因的3′UTR區(qū)域特異性結(jié)合，轉(zhuǎn)染miR-21至綿羊卵巢顆粒細(xì)胞后，細(xì)胞增殖得到促進(jìn)，同時PIK3R1的mRNA、蛋白質(zhì)表達(dá)顯著降低（P<0.05）。本研究表明，發(fā)情和乏情卵巢差異表達(dá)的miRNA（miR-200a、miR-200b、miR-200c）均屬于miR-200家族。先前的文獻(xiàn)中，對miR-200家族功能的研究主要集中在癌癥方向［21］，其對動物繁殖、發(fā)情、及卵巢發(fā)育方面的研究較少。研究表明miR-200s對于GnRH轉(zhuǎn)換啟動成年生育是必不可少的，研究敲除miR-200家族可導(dǎo)致雌性斑馬魚不育［22］。還有研究表明miR-200s通過調(diào)節(jié)垂體-性腺軸來促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟和卵子排出［23］。實驗室的前期研究也證明，miR-200a/b/c在下丘腦、垂體、子宮、卵巢和輸卵管中的表達(dá)有所不同。此外，由于miR-200b對GNAQ基因的干擾效應(yīng)，對綿羊發(fā)情調(diào)控機(jī)理也，產(chǎn)生了一定的影響［16］。

3.3 miR-200c-MAPK8與綿羊繁殖的關(guān)系

本試驗結(jié)果顯示，通過干擾miR-200c mimics，能另MAPK8基因Wt型質(zhì)粒的，熒光作用受到miR-200c的調(diào)控，表達(dá)量顯著下降（P<0.05），表明miR-200c對動物發(fā)情的調(diào)控機(jī)制，其中包括MAPK8基因的調(diào)控。段新崇等［24］的試驗結(jié)果表明，oar－miR-200c、oar－miR-200b和oar－miR-200a，在小尾寒羊間情期和發(fā)情期，miRNA表達(dá)量，具有顯著差異（P<0.05），這也與本試驗的研究結(jié)果相一致。本研究發(fā)現(xiàn)miR-200c下調(diào)倍數(shù)最高，且僅在乏情綿羊卵巢中差異表達(dá)，這些結(jié)果提示miR－n-145可能參與了卵泡期顆粒細(xì)胞增殖的抑制。使用TargetScan和RNAhybrid軟件預(yù)測找到了miR-200c在卵巢組織中的27個靶點基因。GO注釋發(fā)現(xiàn)miR-200c的靶基因有63.55%和72.89%的靶基因參與了卵巢組織中的繁殖和生殖過程，如MAPK8、PAK2、SLC26A2、IGFBP1和DARS等。KEGG信號通路富集表明這些靶基因在不同的通路中對卵巢活動起著調(diào)控作用。其中富集基因最多的通路為MAPK通路（12.95%），分析發(fā)現(xiàn)MAPK通路調(diào)節(jié)生物機(jī)體的生長、發(fā)育及細(xì)胞分化等相關(guān)生理過程。據(jù)郭永娟等［25］的研究，激活了MAPK通路后，會導(dǎo)致生發(fā)卵泡破裂（GVBD）和組蛋白Hl激酶的活化，進(jìn)而刺激卵母細(xì)胞進(jìn)行減數(shù)分裂，同樣表明了MAPK通路在動物繁殖中的作用。卵泡發(fā)育的另一個重要途徑是MAPK信號通路，miR－n-783、miR－n-791和miR－n-77的靶基因在該通路中得很豐富。MAPK通路的激活可以促進(jìn)瘦素刺激的卵母細(xì)胞成熟，反之，當(dāng)瘦素誘導(dǎo)的MAPK磷酸化被特定的MAPK激活抑制劑抑制時，成熟可以被阻斷。此外，孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟途徑與卵母細(xì)胞的成熟有關(guān)，在該途徑中，OAR－miR-200a-3p的靶基因很豐富。

分析發(fā)現(xiàn)在所有的把基因中，富集到通路最多的基因為MAPK8基因。MAPK8基因在GNAQ基因的下游，顯著（P<0.05）地富集在催產(chǎn)素信號、卵巢類固醇合成和促性腺激素釋放激素通路。姚曉磊等［26］的研究結(jié)果指出，相對于牛的次級卵泡，MAPK8是優(yōu)勢卵泡的下調(diào)基因，通過影響顆粒細(xì)胞當(dāng)中，相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的數(shù)量，來調(diào)控基因的表達(dá)。Nan等［14］的試驗結(jié)果表明，miR-200c過表達(dá)后，PRKCB和MAPK8基因的表達(dá)顯著下調(diào)，MAPK8的下調(diào)導(dǎo)致GnRH合成途徑和Wnt信號通路中對卵泡發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)起到反饋和調(diào)控作用，由此推測MAPK8是促進(jìn)卵泡發(fā)育的重要基因。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)miR-200c-MAPK8參與MAPK通路中靶基因的富集，可作為綿羊非繁殖季節(jié)發(fā)情關(guān)鍵miRNA－mRNA靶基因?qū)?。通過靶基因預(yù)測軟件分析發(fā)現(xiàn)miR-200c可能調(diào)控MAPK8基因的表達(dá)，雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測進(jìn)一步驗證表明：miR-200c能明顯抑制MAPK8基因3′UTR熒光素酶活性。這為進(jìn)一步研究miR-200c－MAPK8在綿羊非繁殖期發(fā)情中的作用及其功能驗證提供了試驗基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本試驗成功建立了非繁殖季節(jié)發(fā)情&乏情綿羊卵巢miRNA文庫。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)共有113個miRNA差異表達(dá)，其中有9個已知miRNA和104個未知的miRNA；在篩選的表達(dá)量較高且差異顯著（P<0.05）的miRNA中，miR-200c下調(diào)倍數(shù)最高且僅在乏情綿羊卵巢中差異表達(dá)；試驗初步證實了miR-200c能使靶基因MAPK8表達(dá)下調(diào)，具體調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯：編輯唐慧）

收稿日期：中文收稿日期2023-02-05

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（32160770）

作者簡介：謝夢婷（1997—），女，碩士研究生，專業(yè)方向為動物遺傳育種與繁殖研究。

*通信作者：趙宗勝（1969—），男，教授，博士生導(dǎo)師，從事動物遺傳育種與繁殖研究，e－mail：zhaozongsh@shzu.edu.cn。