楊莉莉 梁呂保 蔡雯雯 黃丹

牛蛙憑借適應(yīng)性強、對養(yǎng)殖條件要求不高、耐運輸、雜食、生長快、個體大、易養(yǎng)殖、利潤較高等特點，養(yǎng)殖規(guī)模和養(yǎng)殖范圍均得到了較快的增長。2021年全國多地引進(jìn)了牛蛙養(yǎng)殖，年產(chǎn)量已超50萬噸，僅在粵東、閩南一帶年產(chǎn)量就可達(dá)到20多萬噸，養(yǎng)殖區(qū)域出現(xiàn)由南向北擴(kuò)散的趨勢。目前牛蛙在中國各地均有大規(guī)模的養(yǎng)殖，已成為我國重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖動物。

牛蛙的皮膚組織重量約占其體量的5%，食用過程中常被丟棄，造成了大量生物資源的浪費。從牛蛙皮膚組織中提取優(yōu)質(zhì)膠原，深入開發(fā)高附加值產(chǎn)品，既能夠解決廢棄物帶來的污染問題，又推動了生物質(zhì)資源的綜合開發(fā)與高值利用，可以創(chuàng)造良好的環(huán)境效益和經(jīng)濟(jì)效益。作為一種生物性高分子物質(zhì)，膠原是動物體內(nèi)含量最多、分布最廣的功能性蛋白，明膠則是膠原部分降解得到的產(chǎn)物，廣泛應(yīng)用于食品、化妝品及醫(yī)藥工業(yè)等領(lǐng)域?；诖?，本實驗對牛蛙皮的主要成分進(jìn)行分析，并對比牛蛙皮經(jīng)過3種預(yù)處理工藝后的提膠得率、膠液在570nm的透過率（%）、膠液b值、粘度、凍力指標(biāo)，以期為工業(yè)化利用牛蛙皮生產(chǎn)明膠提供參考。

一、材料與設(shè)備

1.材料與試劑。牛蛙皮，收集自當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場，置于鋁箔袋中密封，放置在冰箱的-18℃冷凍室內(nèi)凍結(jié)備用。鹽酸、硫酸、氫氧化鈉，均為分析純；食鹽、碳酸鈉，均為食品級。

2.儀器與設(shè)備。101-1電熱恒溫干燥箱，上海博迅實業(yè)有限公司；SX2-4-10N箱式電阻爐，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DDS-307精密電導(dǎo)率儀，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；PHS-3C型精密pH計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；78-1磁力加熱攪拌，天津市歐諾儀器儀表有限公司；UV-1100紫外分光光度計 上海美譜達(dá)儀器有限公司；ZE6000分光測色儀，日本電色工業(yè)株式會社；PAL-1糖度計，ATAGO（愛拓）株式會社；1000mL索式提取器，四川蜀玻（集團(tuán)）有限責(zé)任公司；AR224CN電子分析天平，美國奧豪斯儀器（上海）有限公司；ND-1勃氏粘度測試儀，天津市國銘醫(yī)藥設(shè)備有限公司；JS-2凍力測試儀，天津市國銘醫(yī)藥設(shè)備有限公司。

二、實驗與方法

1.樣品的預(yù)處理。按照1：3的料液比，將牛蛙皮用0.5%（w/w）氫氧化鈉溶液浸泡處理2h，再用三倍樣品量的水沖洗5次，加鹽酸調(diào)節(jié)pH至6.5-8，然后用三倍樣品量的水沖洗3次，自然瀝水后制得樣品1。將牛蛙皮和自來水按照1：3的料液比混合，用硫酸調(diào)節(jié)pH至1左右，浸泡處理3h，再用三倍樣品量的水沖洗5次，自然瀝水后制得樣品2。將牛蛙皮和自來水按照1：3的料液比混合浸泡，然后水洗5次，自然瀝水后制得樣品3。

2.膠原的提取。按照1：2的料液比向樣品中加入自來水，加硫酸調(diào)節(jié)pH至4.0-4.5，在水浴鍋中恒溫60℃提膠，提膠時間為3h。經(jīng)棉過濾得到膠液，再將膠液平攤在不銹鋼托盤上，置于電熱恒溫干燥箱中，在50℃條件下烘干得到干膠片。

3.理化指標(biāo)的測定。（1）牛蛙皮水分測定。采用GB/T 5009.3-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定》中的直接干燥法。

（2）牛蛙皮脂肪測定。采用GB 5009.6-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測定》中的索氏抽提法。

（3）牛蛙皮灰分測定。采用GB 5009.4-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測定》中的馬福爐灰化法。

（4）牛蛙皮粗蛋白含量測定。采用GB 5009.5-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》中的凱氏定氮法。

（5）牛蛙提膠收率測定。牛蛙皮加酸、熱水提膠，手持濃度計測定膠液濃度，按照如下公式計算收率，0.77為手持糖度計的校正系數(shù)。

（6）明膠色度指數(shù)B值的測定。在30℃條件下，測定10%明膠溶液，用分光測色儀對膠液進(jìn)行檢測，然后讀數(shù)記錄結(jié)果。

（7）明膠透過率的測定。在45℃條件下，測定6.67%明膠溶液，用分光光度計于波長570nm處對膠液進(jìn)行檢測，然后讀數(shù)記錄結(jié)果。

（8）透視度的測定。將牛蛙皮水洗后的清洗液體裝入底部帶有十字標(biāo)識、側(cè)面有高度標(biāo)識的量筒中，從上至下目視量筒底部的十字標(biāo)識，通過排放管調(diào)整液位，當(dāng)視線透過液體量筒底部的十字標(biāo)識清晰可見時，讀取量筒的高度，將其記錄為透視度。

（9）明膠粘度的測定。在60℃條件下，測定100mL的6.67%明膠溶液流過標(biāo)準(zhǔn)毛細(xì)管所需要的時間。

（10）明膠凍力的測定。將待測定的6.67%明膠溶液放入（10±0.1）℃低溫恒槽內(nèi)冷卻16-18h，然后將直徑為12.7mm的圓柱壓入6.67%明膠的膠凍表面以下4mm時所施加的力記為凍力，以B1oom g為單位。

三、結(jié)果與分析

1.牛蛙皮的主要成分含量。對自然瀝水后的牛蛙皮進(jìn)行水分、粗脂肪、灰分、粗蛋白含量測定，結(jié)果詳見表1。

由表1可知，牛蛙皮的水分含量為68.50%、粗脂肪含量為1.93%、灰分含量為5.58%、粗蛋白含量為20.87%，與楊遠(yuǎn)帆等人的測定結(jié)果接近。與羅非魚皮相比，牛蛙皮的粗蛋白含量偏低，灰分含量較高，水分、脂肪含量較為接近，其脫脂預(yù)處理工藝可以參考羅非魚皮的預(yù)處理工藝，因此后期工業(yè)化生產(chǎn)時所使用的脫脂清洗設(shè)備也可能比較接近。牛蛙皮的脂肪含量為1.93%，遠(yuǎn)低于牛皮和豬皮的脂肪量（3%-30%），表明牛蛙皮更易于脫脂和浸提。另外，牛蛙皮的膠原蛋白含量約為13.8%，占總蛋白的74.39%，說明牛蛙皮是提取和利用明膠的理想原料。

2.不同預(yù)處理方法后牛蛙皮的理化指標(biāo)比較。根據(jù)采用不同預(yù)處理方法后牛蛙皮的理化指標(biāo)（表2）可以看出，樣品1的灰分最高，與預(yù)處理前的5.58%相比，灰分含量反而更高，可能是因為使用鹽酸調(diào)整pH時，鹽酸與氫氧化鈉發(fā)生了酸堿反應(yīng)生成了氯化鈉和水，然后由于水洗不夠充分，殘留的氯化鈉沒有被徹底洗出，反而使得灰分含量增加。樣品1經(jīng)過預(yù)處理后，電導(dǎo)率最低，可能是由于酸堿中和后溶液中的離子量減少而造成的。樣品1經(jīng)過預(yù)處理后，清洗溶液的透視度最低、收率也最低，可能與牛蛙皮進(jìn)行堿洗時，部分雜蛋白、脂類等被去除有關(guān)，另外水洗不夠充分，殘留的氯化鈉也會影響透視度。

樣品2預(yù)處理后水分最高，收率最高，這是因為稀酸溶液可以有效作用于膠原蛋白分子間的氫鍵，使膠原纖維膨脹展開，泡酸后牛蛙皮吸水發(fā)脹。經(jīng)泡酸預(yù)處理后，牛蛙皮的灰分最低，說明樣品2預(yù)處理方法脫灰的效果最好，這與牛蛙皮內(nèi)的磷、鈣等無機成分與酸反應(yīng)產(chǎn)生可溶性的鹽，再經(jīng)水洗被去除有關(guān)。樣品2預(yù)處理后的電導(dǎo)率最高，可能是由于水洗不夠徹底，溶液中離子含量高所造成的，增加弱堿（例如碳酸鈉）進(jìn)行中和，再經(jīng)水洗就可解決這個問題。

樣品3只經(jīng)過3次水洗，預(yù)處理后的水分含量為79.61%，處理前則為68.50%，高了11.11%，這與自然瀝水的方法有很大關(guān)系，因為牛蛙皮自然瀝水時堆放過厚不容易瀝出水，水分含量就比較高。

對比3個樣品可以看出，預(yù)處理后樣品2的灰分最低，與羅非魚皮的灰分接近。3個樣品經(jīng)過處理后，水分均較原始牛蛙皮的水分有所上升，因此原料采購時需要在合同內(nèi)約定好原料的水分范圍，不能只以“自然瀝水至不滴水”為驗收標(biāo)準(zhǔn)。

3.不同預(yù)處理方法的牛蛙皮制得明膠理化指標(biāo)的比較。根據(jù)不同預(yù)處理方法的牛蛙皮制得明膠的理化指標(biāo)（表3）可以看出，經(jīng)過泡酸預(yù)處理的樣品2提取得到的膠液透過率最高，b值最低，顏色最淺。樣品3提取出的膠液透過率最低，b值最高，顏色最深，這是因為樣品3的牛蛙皮只進(jìn)行了水洗，沒有經(jīng)過酸或堿除雜的處理，其中的脂肪極易氧化產(chǎn)生臭味，使膠原蛋白溶液變渾濁，此外也與雜蛋白、粘多糖、礦物質(zhì)等含量高有著直接的關(guān)系。樣品1的牛蛙皮在預(yù)處理時使用氫氧化鈉浸泡，水洗很難將其清洗干凈，殘留的氫氧化鈉在提取時又與硫酸反應(yīng)生成硫酸鈉，也會影響膠液的透過率與b值。

經(jīng)過堿處理后，樣品1膠液的粘度與凍力最高；經(jīng)過酸處理后，樣品2膠液的粘度最低；只經(jīng)過水洗處理的樣品3收率最高，這一結(jié)果與牛蛙皮沒有經(jīng)過酸或堿除雜的處理，其中雜蛋白、粘多糖、礦物質(zhì)等含量高有關(guān)。

對比3個樣品，從經(jīng)過堿洗預(yù)處理的牛蛙皮中提取得到的明膠凍力最高，但在工業(yè)化生產(chǎn)時，不宜使用氫氧化鈉進(jìn)行堿洗，因為殘留的氫氧化鈉很難清洗干凈，最終會影響到產(chǎn)品的品質(zhì)。從經(jīng)過酸洗預(yù)處理的牛蛙皮中提取得到的明膠感官指標(biāo)最好，但是凍力低，收率也最低。在酸法預(yù)處理中，泡酸會使牛蛙皮吸酸溶脹，明膠能夠更好地釋放出來，但如果酸的濃度過低或處理時間不充足，牛蛙皮溶脹不完全，明膠析出量較少，產(chǎn)量就會較低。

綜上所述，牛蛙肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美、營養(yǎng)豐富，但食用時會產(chǎn)生大量的蛙皮副產(chǎn)物，因此有必要設(shè)計蛙皮明膠生產(chǎn)工藝，既可制備高品質(zhì)明膠，又可增加蛙皮附加值。2021年全國牛蛙年產(chǎn)量為50萬噸，牛蛙皮比重按5%進(jìn)行計算，每年約可產(chǎn)出2.5萬噸的牛蛙皮，約可產(chǎn)出0.25萬噸明膠。隨著牛蛙逐漸形成產(chǎn)業(yè)化的養(yǎng)殖、加工、銷售規(guī)模，牛蛙皮在未來極有可能用于工業(yè)化生產(chǎn)明膠，作為水產(chǎn)動物來源明膠的有力補充。