朱應(yīng)飛 康艷 聶翔 唐小葉 蔡玉霞 匡佩琳

GB 4789.2-2022《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》是根據(jù)2016版標(biāo)準(zhǔn)修訂完善而成的，雖然標(biāo)明了相比2016版的主要變化，但具體操作細(xì)節(jié)并沒有過多描述，檢驗(yàn)人員在執(zhí)行過程中容易出現(xiàn)問題。因此，本文將較全面地對(duì)GB 4789.2-2022的范圍、設(shè)備和材料、培養(yǎng)基和試劑、檢驗(yàn)程序、操作步驟、結(jié)果與報(bào)告等章節(jié)逐條進(jìn)行分析和討論，明確標(biāo)準(zhǔn)修訂變化的依據(jù)以及可能存在的問題，并對(duì)食品檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)正確應(yīng)用該標(biāo)準(zhǔn)提出了技術(shù)性建議，以期進(jìn)一步規(guī)范檢驗(yàn)操作，減少實(shí)際工作中的不穩(wěn)定因素。

一、范圍

2022版標(biāo)準(zhǔn)的前言中，沒有對(duì)適用“范圍”進(jìn)行修改。“本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品中菌落總數(shù)的測定”，這一說法意味著標(biāo)準(zhǔn)僅適用于所有的食品，但一些含有較多抑菌成分的食品（洋蔥粉、大蒜粉）、含較多防腐劑以及酸堿度異常等的樣品，可能出現(xiàn)高稀釋倍數(shù)培養(yǎng)皿細(xì)菌數(shù)與低稀釋倍不成比例的情況，甚至成反比例關(guān)系。

二、術(shù)語和定義

2022版標(biāo)準(zhǔn)中菌落總數(shù)的定義表述欠準(zhǔn)確，應(yīng)改為：食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下（如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度和時(shí)間、pH、需氧性等）培養(yǎng)后，所得每g（mL）檢樣中形成的微生物菌落的總數(shù)。

三、設(shè)備和材料

本條中，2022版標(biāo)準(zhǔn)與2016版最大的區(qū)別在于將“恒溫水浴箱”修改為“恒溫裝置”，擴(kuò)大了保溫方式的適用范圍。在實(shí)際應(yīng)用中，部分實(shí)驗(yàn)室在恒溫水浴箱之外可能增加了專用培養(yǎng)基液化保溫裝置等設(shè)備，新版標(biāo)準(zhǔn)賦予了這些補(bǔ)充裝置的合規(guī)性。新版標(biāo)準(zhǔn)還將溫度范圍由“46℃±1℃”改為“48℃±2℃”，增加了保溫效果，避免了瓊脂培養(yǎng)基容量較大時(shí)傾注過程中凝固較快的問題。

值得注意的是，2022版標(biāo)準(zhǔn)和2016版均未對(duì)無菌試管規(guī)格進(jìn)行明確規(guī)定，后續(xù)的樣品稀釋環(huán)節(jié)需要使用規(guī)格為18mm×180mm的試管，有利于樣品稀釋液的混勻，在15mm×150mm甚至更小的試管中很難充分混勻，建議后續(xù)版本對(duì)此加以補(bǔ)充完善。

四、培養(yǎng)基和試劑

本條增加了“菌落總數(shù)測試紙片：應(yīng)符合GB 4789.28中平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基質(zhì)量控制要求”，但是質(zhì)量控制時(shí)按PCA方法難以操作，紙片面積小，按標(biāo)準(zhǔn)需要接種16條線，線與線之間難以保持距離，容易發(fā)生重疊影響結(jié)果判斷，并且冷凝膠形成膠體后較易破裂，質(zhì)控時(shí)需要揭開表面的塑料膜并畫線，冷凝膠很容易在操作之后破碎，影響后續(xù)結(jié)果，期待在修訂GB 4789.28等標(biāo)準(zhǔn)時(shí)予以解決。同時(shí)，測試片中含有指示劑，應(yīng)考慮參照GB 4789.28方法中的選擇性分離和計(jì)數(shù)固體培養(yǎng)基的半定量測試方法進(jìn)行培養(yǎng)基質(zhì)控。

另外，本條中，2022版標(biāo)準(zhǔn)在“磷酸鹽緩沖液”前面也加上了“無菌”二字，與無菌生理鹽水表述一致，更加科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)。

五、檢驗(yàn)程序

2022版標(biāo)準(zhǔn)將“選擇2個(gè)-3個(gè)適宜稀釋度”改為“選擇1個(gè)-3個(gè)適宜稀釋度”，與后續(xù)操作步驟中“樣品的稀釋”的改動(dòng)一致。在“培養(yǎng)”和“計(jì)數(shù)各平板菌落數(shù)”之間增加了“36℃±1℃，48h±2h；水產(chǎn)品30℃±1℃，72h±3h”的文字描述，但卻缺少測試片檢驗(yàn)程序的相關(guān)描述。

六、操作步驟

1.樣品的稀釋。所有樣品取樣前應(yīng)充分混勻后再進(jìn)行取樣，確保取樣均一性。

（1）固體和半固體樣品。①2022版和2016版標(biāo)準(zhǔn)均未對(duì)半固體作詳細(xì)的定義，檢驗(yàn)人員對(duì)此可能出現(xiàn)理解偏差，期待能夠加以完善。標(biāo)準(zhǔn)要求“稱取25g樣品”，但在實(shí)際檢驗(yàn)過程中不可能每個(gè)樣品都能準(zhǔn)確稱量25g，GB 4789系列標(biāo)準(zhǔn)均未對(duì)稱量范圍有明確的規(guī)定。在這方面，美國農(nóng)業(yè)部食品安全檢查局的《微生物實(shí)驗(yàn)室指南》（Microbiology Laboratory Guidebook，MLG）中寫到“重量和容量的波動(dòng)范圍±1%”，在該指南的沙門氏菌檢驗(yàn)中又指出“除特別規(guī)定外，方法中所有指標(biāo)的波動(dòng)范圍是±2%”。英國公共衛(wèi)生署（PHE）公布的《National Infection Service Food Water and Environmental Microbiology Standard Method》中，樣品的制備、稀釋、傾注、培養(yǎng)章節(jié)中關(guān)于樣品稱樣量均允許5%的偏差。因此，對(duì)于稱量的偏差，實(shí)驗(yàn)室可以根據(jù)情況制定相應(yīng)的操作規(guī)范。②2022版標(biāo)準(zhǔn)在磷酸鹽緩沖液和生理鹽水前都加了“無菌”二字，強(qiáng)調(diào)了無菌的重要性，體現(xiàn)了檢驗(yàn)工作的規(guī)范性。③對(duì)于含有容易與細(xì)菌菌落混淆的細(xì)小顆粒的固體樣品，建議使用帶濾網(wǎng)的均質(zhì)袋，均質(zhì)后過濾可以達(dá)到較好的檢驗(yàn)效果。④對(duì)于部分吸水性較強(qiáng)的樣品，25g樣品在225mL稀釋液中不易充分溶解，建議采用擴(kuò)大稀釋度的方式，取25g樣品加入2475mL稀釋液配制成1：100的稀釋度溶液，然后進(jìn)行檢驗(yàn)。

（2）液體樣品。2022版標(biāo)準(zhǔn)在本條中增加了三處內(nèi)容：一是在磷酸鹽緩沖液和生理鹽水前增加了“無菌”二字，使標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)更規(guī)范。二是增加了“或放入盛有225mL稀釋液的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min-2min”，明確了液體樣品允許使用均質(zhì)器進(jìn)行均質(zhì)。三是增加了“當(dāng)結(jié)果要求為每g樣品中菌落總數(shù)時(shí)，按6.1.1操作”的描述，解決了粘稠度較高以及含有固體顆粒的液體樣品不易按照體積取樣的困擾。

（3）梯度稀釋。2022版標(biāo)準(zhǔn)將“振搖試管或用1支無菌移液管反復(fù)吹打使其混合均勻”改為“在振蕩器上振蕩混勻”，明確并統(tǒng)一了樣品稀釋液的混勻方式，避免混勻不充分產(chǎn)生的結(jié)果偏差，同時(shí)有效防止有害氣溶膠的形成，可以避免交叉污染。

（4）稀釋度的選擇。2022版標(biāo)準(zhǔn)將“2個(gè)-3個(gè)適宜稀釋度”改為“1個(gè)-3個(gè)適宜稀釋度”，更靈活，可選稀釋度更廣。允許只做1個(gè)梯度，對(duì)于檢驗(yàn)污染率較低的樣品而言，減少了檢測的工作量，但對(duì)檢驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)和操作水平要求更高，首先要評(píng)估樣品的污染狀況。而且僅有一個(gè)梯度時(shí)，可能出現(xiàn)菌落總數(shù)多不可計(jì)或平行不好的情況，難以保證檢測結(jié)果的可靠性，因此建議盡量采用2-3個(gè)稀釋度以規(guī)避可能的風(fēng)險(xiǎn)。另外，2022版標(biāo)準(zhǔn)還將所有“平皿”改為了“培養(yǎng)皿”，使表述更加規(guī)范。

（5）空白對(duì)照試驗(yàn)。在整個(gè)檢驗(yàn)過程中，為了控制污染，需做空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

（6）傾注培養(yǎng)基。①2022版標(biāo)準(zhǔn)將平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基冷卻溫度由“46℃±1℃”改為“46℃-50℃”，恒溫水浴鍋及其溫度也分別改為“恒溫裝置”和“48℃±2℃”。2022版標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的傾注溫度與其他國家的標(biāo)準(zhǔn)存在細(xì)微差異，如美國FDA BAM規(guī)定PCA適合傾注的溫度為45℃±1℃，ISO 4833-1：2013規(guī)定的溫度為44℃-47℃（將改為47℃-50℃）。2022版標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的傾注溫度最高達(dá)50℃，有研究標(biāo)明PCA冷卻至50℃傾注，樣品的菌落總數(shù)結(jié)果與冷卻至45℃無顯著差異，且50℃的PCA不易出現(xiàn)凝固現(xiàn)象，這為具體檢驗(yàn)工作中培養(yǎng)基溫度的控制提供了較寬的安全范圍。②2016版標(biāo)準(zhǔn)提到的是“及時(shí)傾注培養(yǎng)皿”，但未明確規(guī)定多長時(shí)間完成，2022版標(biāo)準(zhǔn)中也仍未解決這一問題。食品樣品大多營養(yǎng)物質(zhì)比較豐富，當(dāng)與磷酸鹽緩沖液或生理鹽水混合后會(huì)給微生物提供良好的生長環(huán)境。為了防止菌落數(shù)在此過程中發(fā)生顯著變化，美國FDA BAM規(guī)定從樣品原始稀釋到傾注過程應(yīng)在15min內(nèi)完成。也有文獻(xiàn)報(bào)道稱，檢樣從開始稀釋到傾注最后一個(gè)平皿所用時(shí)間不宜超過20min。因此，后續(xù)應(yīng)對(duì)從樣品前處理到瓊脂傾注完成的時(shí)間給出明確規(guī)定。③將培養(yǎng)基用量“15mL-20mL”改為“12mL-20mL”，當(dāng)培養(yǎng)基用量有所調(diào)整，培養(yǎng)基所含水分也相應(yīng)變化，普通的恒溫培養(yǎng)箱對(duì)濕度的控制比較差，當(dāng)使用12mL培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，很容易出現(xiàn)干裂的情況，建議沒有配備恒溫恒濕培養(yǎng)裝置的實(shí)驗(yàn)室仍然將培養(yǎng)基用量控制在15mL-20mL，且培養(yǎng)基厚度不低于3mm。

2.培養(yǎng)。（1）2022版標(biāo)準(zhǔn)在“待瓊脂凝固后”前面增加了“水平放置”，強(qiáng)調(diào)了操作細(xì)節(jié)，并將2016版標(biāo)準(zhǔn)中的6.2.1和6.2.2的內(nèi)容合并為6.2.1，還在6.2.2中增加了“如使用菌落總數(shù)測試片，應(yīng)按照測試片所提供的相關(guān)技術(shù)規(guī)程操作”。（2）2022版標(biāo)準(zhǔn)仍未明確規(guī)定水產(chǎn)品的檢測范圍。不同于水產(chǎn)制品，水產(chǎn)品是指捕撈和養(yǎng)殖生產(chǎn)的魚、蝦、蟹、貝、藻類、海獸等帶有原始菌相的產(chǎn)品，因此建議明確規(guī)定水產(chǎn)品的范圍。（3）使用測試片檢驗(yàn)時(shí)，測試片堆疊不宜過高，以免底部測試片被過度擠壓而影響檢驗(yàn)結(jié)果。

3.菌落計(jì)數(shù)。本條最主要的變化是刪除了2016版標(biāo)準(zhǔn)中“每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個(gè)平板的平均數(shù)”這句話。然而，當(dāng)同一個(gè)稀釋度的兩個(gè)平板僅有一個(gè)平板菌落數(shù)在30CFU-300CFU時(shí)，根據(jù)2022版標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，檢驗(yàn)人員理解的該稀釋度菌落總數(shù)有效結(jié)果應(yīng)該是這一個(gè)平板的菌落數(shù)，但只計(jì)數(shù)一個(gè)平板的結(jié)果很顯然存在一定實(shí)驗(yàn)誤差，所有結(jié)果應(yīng)該是兩個(gè)平板的平均數(shù)，因此建議保留此處表述。

七、結(jié)果與報(bào)告

1.菌落總數(shù)的計(jì)算方式。2022版標(biāo)準(zhǔn)增加了附錄B的示例，明確了菌落總數(shù)的計(jì)算方法。而對(duì)于所有稀釋度的平板菌落數(shù)都不在30CFU-300CFU范圍的情況，一些檢驗(yàn)人員存在理解誤區(qū)，選擇以計(jì)算絕對(duì)差值的方式來判定哪個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)更接近，但卻忽略了一點(diǎn)，應(yīng)將絕對(duì)差值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，換算到同一級(jí)別進(jìn)行比較，因此建議在附錄增加示例分析。

2.菌落總數(shù)的報(bào)告。2022版標(biāo)準(zhǔn)刪除了2016版標(biāo)準(zhǔn)中的“若所有平板上為蔓延菌落而無法計(jì)數(shù)，則報(bào)告菌落蔓延”，這對(duì)檢驗(yàn)人員對(duì)于樣品的預(yù)判和操作提出了更加嚴(yán)格的要求。2022版標(biāo)準(zhǔn)還規(guī)定，當(dāng)菌落總數(shù)小于100CFU時(shí)，按“四舍五入”原則修約，以整數(shù)報(bào)告。

綜上所述，菌落總數(shù)檢驗(yàn)從檢驗(yàn)前的準(zhǔn)備到最后的結(jié)果報(bào)告，每一步都要求檢驗(yàn)人員細(xì)心嚴(yán)謹(jǐn)、精準(zhǔn)操作，只有確保每個(gè)步驟都準(zhǔn)確無誤，整個(gè)檢驗(yàn)才能更加可靠、準(zhǔn)確，數(shù)據(jù)也才更有說服力。食品中的微生物檢驗(yàn)至關(guān)重要，食品安全更是不容馬虎，只有做好每一次檢驗(yàn)，保證每一個(gè)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，才能為食品安全保駕護(hù)航。