謝麗基,鄧顯文,謝芝勛,韋 悠,謝志勤,羅思思,李 孟,黃嬌玲,張民秀,范 晴,王 盛,曾婷婷,張艷芳

(廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所,廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部中國(廣西)-東盟跨境動物疫病防控重點實驗室,南寧 530001)

血清4型禽腺病毒(Fowl adenovirus serotype 4, FAdV-4)是引起高致病性和高傳染性心包積液肝炎綜合征的病原,感染的家禽出現(xiàn)急性死亡,病死率為20%～80%[1]。FAdV-4 感染能夠?qū)е滤拗髅庖咭种?由此導(dǎo)致的免疫失敗、繼發(fā)感染、混合感染進一步加劇了心包積液肝炎綜合征的危害[2]。2015年以前,該病在我國多地零星發(fā)現(xiàn),但自2015年6月起,該病在我國河南、河北、安徽、山東、廣東、廣西和江蘇等多個省份呈暴發(fā)式流行[3-5]。

現(xiàn)有的禽腺病毒檢測方法主要有病毒分離鑒定、血清學(xué)診斷和分子生物學(xué)檢測方法。病毒分離鑒定檢測周期長,不利于大規(guī)模檢測;血清學(xué)方法中比較常用的為ELISA檢測方法,如基于禽腺病毒Hexon、Fiber-1和Fiber-2等基因的原核表達蛋白為包被抗原建立的間接ELISA方法[6-8];禽腺病毒分子生物學(xué)檢測方法有PCR、限制性內(nèi)切酶分析、實時熒光定量PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴增技術(shù)(LAMP)等,可用于禽腺病毒感染早期的診斷[9]。

當(dāng)前,國內(nèi)除FAdV-4外,FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-10及FAdV-11等血清型在我國雞群中也均有流行和感染的報道[10-11],多血清型的流行給該病的檢測和防控帶來很大挑戰(zhàn)。據(jù)報道,研究人員從某些禽用弱毒疫苗中檢測到了FAdV-4[12-13],對養(yǎng)禽業(yè)產(chǎn)生巨大危害。因此,迫切需求建立能快速鑒別診斷FAdV-4的檢測方法。本研究以FAdV-4廣西分離株(FAdV-4-GX2018-005)作為免疫原免疫小鼠,經(jīng)過ELISA篩選,成功研制了能特異性識別FAdV-4的單克隆抗體,為開展FAdV-4污染的檢測及相關(guān)疾病診斷提供儲備。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 SPF級雌性BALB/c小鼠購自廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心;FAdV-4-GX2018-005病毒、骨髓瘤SP2/0細胞、FAdV-4 18個分離株(2015年后分離自不同年份、廣西不同市縣)、血清1～11型禽腺病毒、新城疫病毒(NDV)、禽呼腸孤病毒(ARV)、減蛋綜合癥病毒(EDSV)和傳染性支氣管炎病毒 (IBV)由廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室保存;弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、HAT選擇培養(yǎng)基、滅活劑β-丙內(nèi)酯、PEG4000融合試劑和鼠源MAb亞類鑒定試劑盒均購自Sigma公司;胎牛血清購自Invitrogen公司;DMEM/F12培養(yǎng)基購自Hycon公司;BW-V1160 ViraTrapTMAdenovirus Purification Miniprep Kit購自Biomiga公司;Protein G Resin購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司;HRP 和FITC標記的山羊抗小鼠 IgG 抗體購自深圳晶美生物工程有限公司。

1.2 FAdV-4-GX2018-005的培養(yǎng)及純化濃縮 使用18日齡的SPF雞胚,制備SPF雞胚肝細胞[14]。將SPF雞胚肝細胞在75 cm2細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至90%,接種0.1 mL保存的FAdV-4-GX2018-005病毒,作用1 h后,用PBS 洗滌2～3次,加入含2.5%胎牛血清的DMEM/F-12,培養(yǎng)觀察2～3 d,細胞出現(xiàn)變圓,并有60%的細胞發(fā)生脫落時,將細胞培養(yǎng)瓶置于-80 ℃中反復(fù)凍融3次,通過0.22 μm的過濾器過濾收集病毒上清液,參照BW-V1160 Vira TrapTM Adenovirus Purification Miniprep Kit試劑盒說明書,對FAdV-4-GX2018-005病毒進行純化濃縮,測定TCID50。

1.3 單克隆抗體檢測方法的建立 以FAdV-4-GX2018-005全病毒(TCID50=10-7.125)作為包被抗原,參照劉延珂等[15]的方法,經(jīng)方陣試驗優(yōu)化包被抗原濃度、二抗(HRP 標記的山羊抗小鼠IgG抗體)濃度和顯色時間等,建立FAdV-4-ELISA檢測方法。具體的方法如下:以FAdV-4作為包被抗原,100 μL/孔,4 ℃過夜;PBST(含0.05%吐溫的PBS)洗滌3次;2%牛奶的PBS進行封閉,200 μL/孔,37 ℃孵箱中2 h,用PBST(含0.05%吐溫的PBS)洗滌3次;加入雜交瘤細胞培養(yǎng)上清、陰性對照(其它對照病毒的陽性血清)、空白對照(PBS)、陽性對照(FAdV-4陽性血清)作為一抗,100 μL/孔,37 ℃孵育1 h;用PBST(含0.05%吐溫的PBS)洗滌3次;加入HRP 標記的山羊抗小鼠IgG抗體作為二抗,100 μL/孔,37 ℃孵育1 h;用PBST(含0.05%吐溫的PBS)洗滌3次,加入顯色液顯色10 min,每孔加入50 μL終止液(含2 mol/L硫酸)終止。在波長450 nm下測吸光值。

1.4 單克隆抗體的制備與鑒定

1.4.1 動物免疫及細胞融合 將純化的FAdV-4-GX2018-005病毒(稀釋為107TCID50/mL)用滅活劑β-丙內(nèi)酯滅活后,按1∶1的等體積比例與弗氏完全佐劑混合乳化作為免疫抗原,多點皮下(0.5 mL/只,病毒劑量為2.5×106TCID50)注射免疫6～8周雌性BALB/c小白鼠。首免后21 d和35 d,按1∶1的比例等體積將弗氏不完全佐劑與FAdV-4-GX2018-005病毒混合乳化后進行加強免疫。首免后49 d采血測抗體效價,選抗體效價最高的BALB/c小白鼠,在細胞融合前3 d用滅活FAdV-4-GX2018-005病毒(不加佐劑)經(jīng)腹腔注射加強免疫。

1.4.2 細胞融合 無菌取免疫小鼠脾臟放入細胞篩,做成脾細胞懸液,計算細胞數(shù),按5∶1的比例將脾細胞與骨髓瘤細胞Sp2/0進行混合,使用PEG4000融合試劑(50%的比例)進行細胞融合試驗,具體融合方法參照參考文獻[16]進行。

1.4.3 雜交瘤細胞篩選 用HAT選擇培養(yǎng)基(含次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶脫氧核苷)培養(yǎng)融合細胞,在融合后9 d、12 d、15 d收集細胞培養(yǎng)上清液。使用FAdV-4-ELISA,對融合細胞的上清液進行檢測。將ELISA檢測為陽性的細胞孔,用有限稀釋法連續(xù)進行3次單細胞亞克隆。亞克隆的細胞培養(yǎng)10 d后,收集細胞上清液進行FAdV-4-ELISA檢測。將分泌抗體效價高且效價穩(wěn)定的細胞株進行凍存保種。

1.4.4 單克隆抗體生物學(xué)特性分析 抗體分泌穩(wěn)定性的分析:在液氮中凍存3個月、6個月后,將陽性雜交瘤細胞連續(xù)傳代3次后,收集上清液,用ELISA方法檢測FAdV-4單克隆抗體的效價,測定陽性雜交瘤細胞分泌抗體的能力。

腹水抗體效價檢測:經(jīng)腹腔注射8周齡BALB/c小白鼠1 mL滅菌注射級白油,7～14 d后腹腔注射2×106個對數(shù)生長期的陽性雜交瘤細胞,密切觀察BALB/c小白鼠的健康狀況與腹水征象,接種細胞7～10 d后可產(chǎn)生腹水,收獲的腹水參照Protein G Resin柱說明書進行純化后,進行效價測定。

單克隆抗體亞類鑒定:收集陽性雜交瘤細胞的上清液,按照鼠源MAb亞類鑒定試劑盒說明書的操作步驟,對FAdV-4單克隆抗體進行亞類鑒定。

1.4.5 單克隆抗體特異性檢測 參照劉延珂等[15]的方法,以禽腺病毒其他血清型毒株(FAdV-1～FAdV-11)、NDV、ARV、EDSV和IBV等病毒作為包被抗原,腹水純化后的FAdV4單克隆抗體為一抗,進行ELISA檢測,評價FAdV-4單克隆抗體的特異性。以18株FAdV-4分離株(不同時間不同養(yǎng)殖場分離的病毒)作為包被抗原,腹水純化后的FAdV-4單克隆抗體為一抗,進行ELISA檢測,評價FAdV-4單克隆抗體的廣譜性。

1.4.6 間接免疫熒光試驗(IFA) 將SPF雞胚肝細胞在12孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)至90%,接種104TCID50FAdV-4-GX2018-005病毒,感染1.5 h后,用PBS沖洗2次,用含2.5%胎牛牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h,吸棄培養(yǎng)液,用冰預(yù)冷甲醛固定細胞,以腹水純化后的FAdV-4單克隆抗體作為一抗,37 ℃溫育1 h,以FITC標記的山羊抗小鼠 IgG 抗體作為二抗,同時設(shè)立陰性對照組,37 ℃溫育1 h,洗滌3次,晾干,熒光顯微鏡下觀察和拍照結(jié)果。陰性對照為SPF雞胚肝細胞不接種FAdV-4-GX2018-005,直接用FAdV-4單克隆抗體進行IFA試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 FAdV-4-GX2018-005的純化濃縮 FAdV-4-GX2018-005病毒,經(jīng)BW-V1160 ViraTrapTMAdenovirus Purification Miniprep Kit純化濃縮后,TCID50為107.125/mL。

2.2 單克隆抗體檢測方法的建立 FAdV-4-GX2018-005全病毒包被抗原的濃度為104TCID50(100 μL/孔),4 ℃過夜;封閉條件:2%牛奶的PBS進行封閉,200 μL/孔,37 ℃孵箱中2 h;單抗(雜交瘤細胞上清/腹水)37 ℃孵育1 h;山羊抗小鼠IgG抗體的作用濃度為1∶1000,37 ℃孵育1 h;底物顯色時間為10 min。陽性判斷標準為待檢血清OD450nm大于0.102,小于0.102為陰性。

2.3 雜交瘤細胞的篩選 將FAdV-4-GX2018-005免疫的BALB/c小白鼠脾臟細胞與骨髓瘤細胞Sp2/0進行細胞融合后,用建立的FAdV-4-ELISA檢測方法,對第9天、第12天、第15天融合細胞上清液進行檢測篩選,獲得43個陽性抗體孔,選擇其中24個OD值陽性孔進行亞克隆化,經(jīng)過3次亞克隆化和篩選,共獲得3株陽性雜交瘤細胞見圖1(3A3、13A11和4D5)。

A:3A3雜交瘤細胞;B:13A11雜交瘤細胞;C:4D5雜交瘤細胞圖1 3株雜交瘤細胞Fig 1 Three hybridomas

2.4 單克隆抗體生物學(xué)特性分析 抗體分泌穩(wěn)定性試驗結(jié)果顯示,3A3、13A11和4D5這3株雜交瘤細胞凍存3、6個月后復(fù)蘇傳代,經(jīng)FAdV4-ELISA檢測雜交瘤細胞株培養(yǎng)上清液,3株細胞抗體ELISA效價達28以上,3株雜交瘤細胞株抗體分泌穩(wěn)定性良好。腹水抗體效價檢測結(jié)果顯示,3株雜交瘤細胞均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高效價抗體,效價達到220以上。單克隆抗體亞類的鑒定結(jié)果(表1)顯示,3A3雜交瘤細胞分泌的抗體重鏈為IgG2a亞類,輕鏈為K鏈;13A11和4D5雜交瘤細胞分泌的抗體重鏈為IgG2b亞類,輕鏈為K鏈。

表1 單克隆抗體亞類鑒定結(jié)果Tab 1 Subclass of monoclonal antibody

2.5 單克隆抗體特異性檢測結(jié)果 以不同血清型FAdV及NDV、ARV、EDSV和IBV病毒作為包被抗原,對3株陽性雜交瘤細胞(3A3、13A11和4D5)制備的單克隆抗體進行ELISA檢測,結(jié)果(表2)表明,3A3、13A11和4D5雜交瘤細胞制備的單克隆抗體,只與FAdV-4-GX2018-005毒株產(chǎn)生良好反應(yīng),與其它血清型FAdV及NDV、ARV、EDSV、IBV無交叉反應(yīng),說明3株陽性雜交瘤細胞制備的抗體具有良好的特異性(表2)。

表2 單克隆抗體的特異性檢測Tab 2 The specificity detection of MAbs

以本實驗室保存的18株FAdV-4分離株為包被抗原,對3株陽性雜交瘤細胞(13A3、13A11和4D5)制備的單克隆抗體進行ELISA檢測,結(jié)果(表3)表明,3A3、13A11和4D5雜交瘤細胞制備的抗體,與18株FAdV-4分離株產(chǎn)生陽性反應(yīng),說明本研究制備的單克隆抗體與FAdV-4分離株的反應(yīng)具有廣譜性。

表3 單克隆抗體對18株FAdV-4分離株的檢測結(jié)果Tab 3 The specificity detection of MAbs to 18 FAdV-4 strains

2.6 間接免疫熒光試驗 以3株雜交瘤細胞(3A3、13A11和4D5)制備的單克隆抗體作為一抗,對感染FAdV-4-GX2018-005的細胞進行IFA檢測,熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),FAdV-4-GX2018-005感染的細胞中有明亮的綠色熒光,陰性對照細胞中未見綠色熒光(圖2)。

A:3A3株單抗+FAdV-4-GX2018-005;B:13A11株單抗+FAdV-4-GX2018-005;C:4D5株單抗+FAdV-4-GX2018-005;D:3A3株對照;E:13A11株對照;F:4D5株對照A:MAbs of cell line3A3+FAdV-4-GX2018-005;B:MAbs of cell line 13A11+FAdV-4-GX2018-005;C:MAbs of cell line 4D5+FAdV-4-GX2018-005;D:Negative control of 3A3;E:Negative control of 13A11;F:Negative control of 4D5圖2 FAdV-4單克隆抗體的IFA試驗結(jié)果Fig 2 IFA result of FAdV-4 MAbs

3 討 論

目前對于FAdV-4單克隆抗體的研究,均以penton、Fiber 2和Hexon這三個主要的結(jié)構(gòu)蛋白為免疫原研制的。王萍等以FAdV-4全病毒免疫小鼠后,以Fiber-2原核表達產(chǎn)物為篩選抗原研發(fā)Fiber-2單克隆抗體[17],該單克隆抗體與FAdV-4反應(yīng)為陽性,FAdV-8為陰性,其它血清型的FAdV的反應(yīng)性未確定。劉娜等用Fiber-2和Hexon蛋白篩選單克隆抗體并研制膠體金試紙,該單克隆抗體與FAdV-4反應(yīng)為陽性,其它血清型的FAdV的反應(yīng)性未確定[18]。侯力丹等將penton基因的原核表達蛋白為抗原免疫小鼠,篩選制備了penton單克隆抗體,該單克隆抗體與禽腺病毒的所有血清型均發(fā)生陽性反應(yīng)[19]。

作為常見的垂直傳播性病毒之一,SPF雞胚中一旦攜帶FAdV便會造成生產(chǎn)的禽用弱毒疫苗出現(xiàn)污染,為該病的防控帶來很大風(fēng)險。據(jù)報道,研究人員從某些禽用弱毒疫苗中檢測到了FAdV-4[12-13]。

在本研究中,以FAdV-4-GX2018-005作為免疫原免疫小鼠,經(jīng)過ELISA篩選,成功研制了分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞3株(13A3、13A11和4D5)。這3株雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體,能特異地與FAdV-4 的19個毒株發(fā)生陽性反應(yīng),與禽腺病毒其它血清型(FAdV-1、FAdV-2、FAdV-3、FAdV-5、FAdV-6、FAdV-7、FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-9、FAdV-10和FAdV-11)以及對照毒株的反應(yīng)為陰性,彌補了現(xiàn)有FAdV單克隆抗體不明確與血清1～11型禽腺病毒的反應(yīng)性,或不能特異檢測FAdV-4的不足。同時,該單克隆抗體在IFA 檢測中明確易判FAdV-4的感染。本研究所研發(fā)的特異檢測FAdV-4 的單克隆抗體,彌補了特異檢測FAdV-4的抗體缺失問題,可用于建立特異檢測FAdV-4的ELISA檢測試劑盒及膠體金試紙條,為實現(xiàn)SPF雞胚等疫苗生產(chǎn)原料以及疫苗成品FAdV-4的高效檢測奠定了基礎(chǔ)。