李芳韜,徐 璐,夏應(yīng)菊,趙俊杰,鄒興啟,劉業(yè)兵

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,國家豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室,北京100081)

尼帕病毒(Nipah virus, NiV)是副粘病毒科亨德拉尼帕病毒屬的一種人畜共患的高致病性病毒[1-2]。為單股負(fù)鏈不分節(jié)段RNA病毒,病毒呈圓形或多形性,由囊膜和核衣殼組成[3]。NiV基因組全長約18.2 kb,包含6個(gè)編碼基因,分別編碼融合糖蛋白(F)、附著糖蛋白(G)、基質(zhì)蛋白(M)、核衣殼蛋白(N)、長聚合酶(L)、磷酸蛋白(P)等9種蛋白[4]。NiV的自然宿主是果蝠,豬作為重要的中間宿主,被攜帶NiV的果蝠或其污染物感染后,從而再將NiV直接或間接傳染給人類或狗、貓、馬、羊等其他易感動(dòng)物[5]。因此,豬在NiV的傳播過程中具有重要意義。

NiV自1999年首次在馬來西亞被發(fā)現(xiàn)后,主要在東南亞和南亞地區(qū)流行[6]。人感染NiV后,主要表現(xiàn)為腦炎癥狀,死亡率接近40%;豬群中爆發(fā)NiV疫情后,豬群感染率接近100%,發(fā)病率因年齡而異,仔豬病死率可達(dá)40%,癥狀主要表現(xiàn)為肺炎,部分發(fā)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變[7-8]。以往的研究中在豬的上皮細(xì)胞中檢測到NiV抗原,證明NiV可能在上皮細(xì)胞(如口鼻、上呼吸道和下呼吸道)復(fù)制[8]。除了上皮組織,還在豬體內(nèi)檢測到低水平的病毒血癥[9],可以從人和豬的腦脊液中分離出病毒[8]。小血管和淋巴血管內(nèi)皮細(xì)胞是NiV易感宿主的主要病毒靶點(diǎn),血管系統(tǒng)的感染可通過血管外擴(kuò)散導(dǎo)致NiV侵染多個(gè)器官,例如腦、肺或脾臟[10]。除了血管系統(tǒng)外,淋巴系統(tǒng)也是NiV感染的重要靶點(diǎn),人、豬和貓的淋巴結(jié)、脾臟和胸腺中均可以檢測到NiV抗原,出現(xiàn)淋巴樣壞死和衰竭[11]。同時(shí),大腦也是主要的靶器官,除了在血管末端及周圍平滑肌中檢測到NiV抗原,還有多種類型的腦細(xì)胞被感染,包括脈絡(luò)膜神經(jīng)叢的神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞、室管膜細(xì)胞、上皮細(xì)胞等;肺部是人類和豬的重要靶標(biāo),在心臟、腎臟、肝臟、子宮和胎盤中也檢測到NiV病毒[8]。

通過臨床癥狀,難以鑒別NiV與豬群中長期存在的呼吸道癥狀為主要表征的病毒。雖然目前我國人群及豬群中暫未發(fā)現(xiàn)NiV感染病例,但我國與NiV主要流行國家經(jīng)濟(jì)貿(mào)易往來密切,并且已在我國蝙蝠體內(nèi)也檢測到NiV抗體,所以我國存在NiV流行的潛在風(fēng)險(xiǎn)[12]。NiV的高發(fā)病率和高死亡率,對養(yǎng)殖業(yè)和公共衛(wèi)生安全構(gòu)成了重大威脅。目前,尚無NiV特異性治療藥物和疫苗[13],因此通過實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)持續(xù)監(jiān)測NiV疫情對防控該病的爆發(fā)至關(guān)重要。

NiV的實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要分為血清學(xué)診斷方法和分子學(xué)診斷方法。傳統(tǒng)的血清學(xué)診斷方法主要包括酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immuno-sorbent assay,ELISA)和血清中和試驗(yàn)[14]。分子學(xué)診斷方法主要包括一系列針對病毒核酸的檢測方法,主要包括聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)方法和核酸測序方法。本綜述闡述了近年來在NiV診斷技術(shù)方面的研究進(jìn)展,并討論了新興診斷技術(shù)相較于傳統(tǒng)診斷技術(shù)的進(jìn)步之處,為臨床樣本中NiV的鑒定和監(jiān)測方法的更新?lián)Q代提供參考,對監(jiān)測NiV從國外的輸入情況、防控豬群NiV疫情發(fā)生以及守護(hù)公共衛(wèi)生安全具有重大意義。

1 血清學(xué)診斷方法

NiV血清學(xué)傳統(tǒng)診斷方法主要包括ELISA和血清中和試驗(yàn),常用靶標(biāo)為NiV的F蛋白、G蛋白和N蛋白。其中,血清中和試驗(yàn)需要在生物安全四級實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行,是NiV實(shí)驗(yàn)室診斷的“黃金”標(biāo)準(zhǔn);ELISA是一種安全性好、敏感性高、特異性強(qiáng)和經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的診斷工具,可用于臨床樣本的大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查和持續(xù)監(jiān)測[15]。目前,檢測NiV常用ELISA方法包括捕獲ELISA檢測IgM抗體和間接ELISA檢測IgG抗體[16]。以往研究表明,第一代間接ELISA結(jié)果存在非特異性反應(yīng),須由在生物安全四級實(shí)驗(yàn)室中操作的血清中和試驗(yàn)進(jìn)一步確定ELISA結(jié)果,使NiV陽性樣本的篩選不具有普適性[17]。因此,開發(fā)和評價(jià)用于篩查NiV疑似病例的 ELISA新方法,有助于監(jiān)測豬群NiV疫情以及制定公共衛(wèi)生預(yù)防措施。隨著診斷技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)步,近些年來逐漸研發(fā)出更多適用于NiV疫情監(jiān)測的新方法,對于新技術(shù)的開發(fā)使現(xiàn)有的血清學(xué)分析得以改進(jìn),主要包括以下技術(shù):

1.1 基于重組蛋白的ELISA鑒別方法 由于NiV具有高度危險(xiǎn)性,利用重組蛋白代替全病毒作為ELISA檢測抗原,可適用于臨床樣本的流行病學(xué)調(diào)查。NiV的G蛋白和N蛋白可以用于建立NiV間接ELISA檢測方法,進(jìn)行陽性血清的篩選以及NiV與亨德拉病毒(Hendra Virus,HeV)的鑒別診斷。使用不同的表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)HeV和NiV截短形式的G蛋白以及NiV的全長N蛋白,以這些重組蛋白為基礎(chǔ),采用ELISA檢測豬血清中HeV或NiV特異性抗體[18],以達(dá)到鑒定NIV或HeV目的。因?yàn)镠eV和NiV的交叉反應(yīng)性,可以通過使用基于全長N蛋白的ELISA對血清進(jìn)行初篩,然后再用基于截短G蛋白的ELISA區(qū)分HeV和NiV感染。但是HeV和NiV均屬亨德拉尼帕病毒屬,抗原之間密切相關(guān),為了排除交叉反應(yīng)與假陽性現(xiàn)象,仍需進(jìn)行血清中和試驗(yàn)才能確認(rèn)為NiV陽性。

1.2基于NiV-g蛋白多克隆抗體的抗原捕獲夾心ELISA 采用基于NiV-g蛋白多克隆抗體的抗原捕獲夾心ELISA方法,可以用于檢測咽拭子、鼻拭子、腦脊液、尿液和血液中的NiV感染。經(jīng)研究表明,該方法能夠更快速地診斷常規(guī)PCR方法無法檢測到的新型NiV[19]。雖然PCR是診斷NiV感染最敏感的技術(shù),但當(dāng)病毒變異后,可能會(huì)造成PCR鑒定方法失效。因此,這種基于NiV-g蛋白多克隆抗體的抗原捕獲夾心ELISA方法可以在血清學(xué)層面鑒定到新型NiV感染,補(bǔ)充傳統(tǒng)血清學(xué)方法和PCR方法在檢測過程中可能遺漏的陽性病例。

1.3 Luminex測定抗體法 血清學(xué)診斷方法除了傳統(tǒng)的ELISA和血清中和試驗(yàn)診斷方法,還有一種Luminex測定法已開發(fā)用于NiV的血清學(xué)檢測,包括設(shè)計(jì)用于抗體檢測和鑒別的Luminex結(jié)合測定法,以及設(shè)計(jì)用于病毒中和的Luminex阻斷測定法[20]。該技術(shù)通過在不同熒光編碼的微球上進(jìn)行抗原-抗體結(jié)合反應(yīng),運(yùn)用激光分別檢測微球編碼和報(bào)告熒光來達(dá)到定性和定量的目的,一個(gè)反應(yīng)孔內(nèi)可以完成多種不同的生物學(xué)反應(yīng),可同時(shí)檢測上百種生物靶標(biāo),并且在數(shù)小時(shí)內(nèi)完成檢測。通過對臨床樣本的篩選結(jié)果進(jìn)行比較,結(jié)合測定法和阻斷測定法可以替代傳統(tǒng)的ELISA和血清中和試驗(yàn)[17]。因此,Luminex測定法是一種快速、靈敏、特異的檢測臨床樣本血清中NiV的有效替代方法。并且該方法不需要在活細(xì)胞上培養(yǎng)病毒,無需在生物安全四級實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行,適用于臨床疾病診斷和流行病學(xué)監(jiān)測可能需要的大批量操作條件[7]。

ELISA可以用來準(zhǔn)確測定大批量生物樣品,但傳統(tǒng)ELISA只能分析一個(gè)目標(biāo)分子,不具備同時(shí)分析多種目標(biāo)分子的能力。在ELISA基礎(chǔ)上發(fā)展的Luminex測定法不僅可以替代傳統(tǒng)方法,還可以在一次實(shí)驗(yàn)中完成對多種目標(biāo)分子的分析,從而建立了更加高效、快速的分析平臺(tái)。

1.4 基于假病毒的中和試驗(yàn) 由于NiV中和試驗(yàn)不具有普適性,因此可以通過構(gòu)建NiV假病毒,設(shè)計(jì)基于假病毒的NiV中和試驗(yàn)。已有研究通過基因重組技術(shù)構(gòu)建了單獨(dú)表達(dá)F或G蛋白的重組水泡性口炎病毒作為已知抗原,并在此基礎(chǔ)上建立了檢測NiV抗體的空斑抑制試驗(yàn);或利用基因重組技術(shù)構(gòu)建了共表達(dá)F、G蛋白與綠色熒光蛋白(GFP)的重組水泡性口炎病毒,作為已知病毒抗原檢測NiV血清樣本。上述表達(dá)綠色熒光蛋白或熒光素酶的NiV假病毒被稱為第一代假病毒。在檢測過程中,基于NiV第一代假病毒的中和試驗(yàn)仍需要特定的檢測設(shè)備以檢測熒光蛋白或熒光素酶。所以,在上述假病毒的基礎(chǔ)上,NiV第二代假病毒采用表達(dá)分泌型堿性磷酸酶的水泡性口炎病毒模型重組F和G蛋白,通過使用ELISA酶標(biāo)儀測量上清液中的分泌型堿性磷酸酶活性,從而開發(fā)出一種新型的基于NiV假病毒的血清中和試驗(yàn)檢測方法,其結(jié)果與傳統(tǒng)的活體NiV試驗(yàn)獲得的抗體檢測結(jié)果一致[21]。

2 病原學(xué)診斷方法

分子學(xué)診斷方法主要包括一系列針對病毒核酸的檢測方法,除了傳統(tǒng)PCR方法外,還有實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)、多重PCR、逆轉(zhuǎn)錄PCR和雙重套式RT-PCR等方法,以及多種核酸測序方法[20]。在臨床上,通過采集腦、肺、脾臟或淋巴結(jié)等組織,可用于NiV的初篩及進(jìn)一步鑒定。針對NiV的M、N和P基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物監(jiān)測疑似NiV感染樣本,常用于東南亞地區(qū)爆發(fā)NiV疫情時(shí)的病毒鑒定[13]。其中,qRT-PCR作為目前應(yīng)用最為普遍的分子學(xué)診斷方法[22],已被證明比傳統(tǒng)PCR靈敏1000倍,因此在多次疫情爆發(fā)時(shí)使用[19],其批間和批內(nèi)差異小、重復(fù)性好、操作簡單、安全、快速,已成為病原分子診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[7]。除了PCR方法外,還有更多新興分子學(xué)方法可以用于NiV診斷,主要包括以下技術(shù):

2.1 Luminex測定核酸法 Luminex測定法除了可以應(yīng)用于NiV的血清學(xué)檢測,還可以應(yīng)用于NiV的核酸檢測,對HeV和NiV分離株進(jìn)行檢測和鑒別,并且檢測靈敏度與qPCR相當(dāng)[23]。已有研究通過利用低聚標(biāo)記微球構(gòu)建了用于HeV和NiV檢測和鑒別的多重鑒定方法,針對N蛋白和P蛋白編碼基因的多個(gè)位點(diǎn)構(gòu)建Luminex測定法,使微球懸浮陣列系統(tǒng)能夠在一次反應(yīng)中同時(shí)識(shí)別多個(gè)核苷酸靶標(biāo),其結(jié)果與已有的qPCR相比,Luminex測定法可明確鑒別HeV和NiV感染病例, 并且HeV檢測的敏感性與qPCR相當(dāng),具有較高的分析和診斷特異性和敏感性[23]。

2.2 二代測序 基于PCR結(jié)果的一代測序在過去NiV的發(fā)現(xiàn)和診斷中起關(guān)鍵作用,對NiV擴(kuò)增產(chǎn)物的測序可以進(jìn)一步證實(shí)檢測結(jié)果,并且對研究病毒基因突變和病毒基因演化方面具有重要作用。隨著二代測序的普遍應(yīng)用,相比于一代測序大幅降低了經(jīng)濟(jì)成本,并且在保持測序準(zhǔn)確性的同時(shí),大幅降低了測序時(shí)間。利用二代測序從初篩陽性的樣本中獲取NiV全長基因組,以及鑒定新型NiV毒株,是目前最快捷、有效的診斷與分析流程[24-25]。

隨著技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展,具有巨大測序深度的高通量測序,在排除大量宿主及環(huán)境背景信息的干擾后能夠檢測到較小基因組的病毒,可以不進(jìn)行PCR步驟、直接在臨床和環(huán)境樣本中檢測NiV核酸,為更加直接、精確地從樣本中鑒定NiV基因信息提供了技術(shù)支持。該深度測序診斷方法設(shè)計(jì)了基于生物素化RNA誘餌原理的病毒富集板,能夠特異性捕獲并富集宏基因組中的病毒信號,可顯著提高檢測背景信息復(fù)雜臨床樣品的敏感性,對于感染多種病原的樣本,能夠同時(shí)檢測到不同種病原的遺傳信息[26]。

3 小結(jié)與展望

血清中和試驗(yàn)雖然是NiV實(shí)驗(yàn)室診斷的“黃金”標(biāo)準(zhǔn),但是在臨床采樣檢測和攻毒實(shí)驗(yàn)中,血清中和試驗(yàn)的檢測陽性率低于qRT-PCR和ELISA檢測陽性率[22,27]。ELISA試驗(yàn)作為普遍應(yīng)用的血清學(xué)檢測方法,無需在生物安全四級實(shí)驗(yàn)室中即可進(jìn)行檢測;然而,其敏感性和特異性略低于分子檢測技術(shù),如RT-PCR、qRT-PCR和其他分子生物學(xué)方法,無法快速、敏感和特異性地檢測到NiV[13]。在NiV疫情再次爆發(fā)時(shí),PCR方法和基因組測序結(jié)果對于NiV的遺傳學(xué)分析和分子特征研究是必不可少的,但是由于引物靶向序列的局限性,PCR診斷方法無法適應(yīng)病毒的快速變異,可能會(huì)造成PCR鑒定方法失效。因此,只有將多種檢測方法相結(jié)合,才能更加快速、高效地診斷NiV,對防控豬群NiV疫情發(fā)生、監(jiān)測NiV從國外的傳入情況以及守護(hù)公共衛(wèi)生安全具有重大意義。

在目前的研究中,為了更精確的篩查臨床樣本中的NiV陽性病例,可先采用qRT-PCR方法初步篩選大量臨床樣本中的陽性樣本,再采用ELISA方法對陽性樣本的血清抗體進(jìn)行進(jìn)一步篩選及確認(rèn),最后利用二代測序(NGS)對組織和拭子樣本進(jìn)行NiV的全基因組測序。隨著NiV假病毒相關(guān)研究的進(jìn)一步發(fā)展,NiV的血清中和試驗(yàn)無需在生物安全四級實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行,使血清中和試驗(yàn)作為NiV實(shí)驗(yàn)室診斷的“黃金”標(biāo)準(zhǔn)有望在日后進(jìn)一步推廣;而具有巨大測序深度的高通量測序,能夠排除大量宿主及環(huán)境背景信息的干擾,并且可以不進(jìn)行PCR步驟、直接在臨床和環(huán)境樣本中檢測NiV核酸,為更加直接、精確地從樣本中鑒定NiV基因信息提供了技術(shù)支持,也有利于NiV檢測進(jìn)一步從實(shí)驗(yàn)室推廣到臨床。

NiV的高發(fā)病率和高死亡率,對養(yǎng)殖業(yè)和公共衛(wèi)生安全構(gòu)成了重大威脅。目前,通過臨床癥狀難以鑒別NiV與豬群中長期存在的呼吸道癥狀為主要表征的病毒,為臨床診斷NiV造成了巨大困難。所以,在發(fā)展實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)的同時(shí),應(yīng)進(jìn)一步簡化操作步驟,發(fā)展易于臨床操作的快速診斷分析技術(shù),以降低我國NiV流行的潛在風(fēng)險(xiǎn),防控該病的輸入與爆發(fā)。