吳永超,張?zhí)煊?孫 悅,齊六衛(wèi),閆 琰*

(1.沈陽偉嘉生物技術(shù)有限公司,沈陽 110027;2.沈陽藥科大學(xué),沈陽 110016)

苦豆子SophoraalopecuroidesL.是一種廣泛分布在新疆、內(nèi)蒙古、寧夏等地的多年生荒漠植物[1],具有耐旱[2]、耐鹽堿[3-4]、適應(yīng)性強(qiáng)的特點(diǎn)?？喽棺铀幉臑槎箍浦参锟喽棺覵ophoraalopecuroidesL. 的種子,其中含有生物堿、多糖、黃酮類、揮發(fā)油、有機(jī)酸等多種活性成分[5-6],具有清熱燥濕,抗病毒[7-8]、抗菌[9-11]、止痛、抗炎[12]、殺蟲[13]、抗腫瘤[14-15]、抗腹瀉的作用。其中國內(nèi)外學(xué)者研究比較多的成分為生物堿,已經(jīng)鑒定出三十多種[16-17],主要含有金雀花堿[18]、槐定堿[19]、氧化苦參堿[20]、氧化槐果堿[21]、N-甲基野靛堿、苦參堿[22-23]、槐果堿[24]等多種生物堿成分,其種子中總生物堿含量為8.11%[25]。參考多篇文獻(xiàn)整理發(fā)現(xiàn)苦豆子生物堿提取工藝一般采用酸水提取和乙醇超聲提取,很少有報(bào)道研究直接水提工藝的生物堿成分變化規(guī)律[26-28]。

研究采用以水作為提取溶媒,系統(tǒng)研究不同浸泡時(shí)間、提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)苦豆子藥材7種生物堿成分的提取效率的影響,通過HPLC法測(cè)定不同提取液的7種生物堿成分(金雀花堿、槐定堿、氧化苦參堿、氧化槐果堿、N-甲基野靛堿、苦參堿、槐果堿)[29-31],揭示隨浸泡時(shí)間、提取時(shí)間和提取次數(shù)變化苦豆子提取液中7種生物堿成分的量變規(guī)律,為更加有效的利用苦豆子提供數(shù)據(jù)支撐。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 1260型高效液相色譜儀、DAD檢測(cè)器(美國Agilent公司);PS-40AD型數(shù)控超聲波清洗器(深圳市科潔超聲科技有限公司);HH-4B數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州榮華儀器制造有限公司);ME55型電子天平(METTLER TOLEDO公司)。

1.2 試藥 對(duì)照品分別為苦參堿(110805-202010,純度為98.7%)、氧化苦參堿(110780-202210,純度為92.8%)、槐果堿(112052-202001,純度為91.8%)和氧化槐果堿(111652-202202,純度為93.1%)購自中國藥品生物制品檢定所,金雀花堿(wkq22062209,純度≥98%)和N-甲基野靛堿(wkq23013007,純度≥98%)購自四川省維克奇生物科技有限公司,槐定堿(21061703,純度98.56%)購自成都格利普生物科技有限公司;乙腈、乙酸銨為色譜純;水為超純水;其他試劑均為分析純;苦豆子購于亳州星嘉中藥原料有限公司,經(jīng)鑒定為苦豆子(SophoraalopecuroidesL.)的干燥種子。

2 方法和結(jié)果

2.1 高效液相色譜法

2.1.1 色譜條件 色譜柱納譜分析ChromCore BRC18(150 mm×4.6 mm,3 μm);以乙腈(A)-0.1%乙酸銨(B)為流動(dòng)相,洗脫梯度(0～5 min,95%B;5～20 min,70%B);檢測(cè)波長220 nm;流速為0.8 mL/min;進(jìn)樣量10 μL;柱溫30 ℃;理論塔板數(shù)按氧化槐果堿計(jì),應(yīng)不低于4000。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取對(duì)照品金雀花堿0.00628 g、槐定堿0.00730 g、氧化苦參堿0.00617 g、氧化槐果堿0.00553 g、N-甲基野靛堿0.00712 g、苦參堿0.00690 g、槐果堿0.00565 g,置于25 mL容量瓶中,用70%乙醇溶解并定容至刻度,制備成濃度為金雀花堿0.2512 mg/mL、槐定堿0.2920 mg/mL、氧化苦參堿0.2468 mg/mL、氧化槐果堿0.2212 mg/mL、N-甲基野靛堿0.2848 mg/mL、苦參堿0.2760 mg/mL、槐果堿0.2260 mg/mL的混合對(duì)照品溶液,備用。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密量取苦豆子提取液20 mL,置于蒸發(fā)皿中水浴蒸干,殘?jiān)?0%乙醇溶解,定容到2 mL量瓶中,搖勻,過濾,即得。

2.1.4 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.1.2”項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液200 μL、300 μL、500 μL、1 mL、2 mL、5 mL、7.5 mL,置于10 mL容量瓶中,加70%乙醇稀釋至刻度,搖勻,用0.22 μm微孔濾膜過濾,即得。按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定,以每種生物堿對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)(X)、峰面積為縱坐標(biāo)(Y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到7種生物堿的線性回歸方程、r值以及線性范圍,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 7種生物堿的線性方程、相關(guān)系數(shù)(r)和線性范圍Tab 1 Linear equations,correlation coefficients(r)and linear ranges of seven kinds of alkaloids

2.1.5 精密度試驗(yàn) 按“2. 1.1” 項(xiàng)下色譜條件,進(jìn)樣10 μL,重復(fù)進(jìn)樣6次,分別計(jì)算7種生物堿的峰面積的RSD值,結(jié)果見表2。

表2 7種生物堿精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab 2 Experimental result of precision,repeatability,stability and average recovery of 7 alkaloids. (n=6)

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取6份同一批樣品,按照“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,用0.22 μm的有機(jī)系微孔濾膜過濾至進(jìn)樣瓶中,進(jìn)樣10 μL,分別計(jì)算7種生物堿的峰面積的RSD值,結(jié)果見表2。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.1.6重復(fù)性試驗(yàn)”項(xiàng)下供試品①,按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件分別在 0、2、4、6、8、10、12、24 h進(jìn)樣10 μL,分別計(jì)算7種生物堿峰面積的RSD值,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

2.1.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 分別精密量取已知7種生物堿含量的樣品溶液6份,每份10 ml,每份樣品溶液分別加入金雀花堿、槐定堿、氧化苦參堿、氧化槐果堿、N-甲基野靛堿、苦參堿、槐果堿,精密稱定,加入的量與已知樣品溶液中所含成分比例約為1∶1,混合均勻,按“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備供試液,0.22 μm微孔濾膜過濾,按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,分別記錄峰面積,并計(jì)算回收率,加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

2.2 水提工藝研究

2.2.1 不同浸泡時(shí)間考察 精密稱取100 g苦豆子藥材7份,每份加入8倍量的水,分別浸泡1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h,取樣,300目濾布過濾,得到不同浸泡時(shí)間的提取液,平行制備3份,分別量取并記錄提取液體積。

2.2.2 不同提取時(shí)間考察 取苦豆子200 g,精密稱定,加入8倍量水,浸泡4小時(shí),分別提取1、2、3、4 h,300目濾布過濾,得到不同提取時(shí)間的苦豆子藥材提取液,平行制備3份,分別量取并記錄提取液體積。

2.2.3 不同提取次數(shù)考察 取苦豆子200 g,精密稱定,加入8倍量水,浸泡4小時(shí),分別提取1、2、3、4次,每次提取2小時(shí),300目濾布過濾,得不同提取次數(shù)的苦豆子提取液,平行制備3份,分別量取并記錄提取液體積。

2.3 結(jié)果 參照“3.1.3供試品溶液的制備”“3.1.1色譜條件”方法制備“3.2提取條件研究”項(xiàng)下所有提取液供試品溶液并檢測(cè)提取液中的金雀花堿、槐定堿、氧化苦參堿、氧化槐果堿、N-甲基野靛堿、苦參堿、槐果堿的含量,苦豆子提取液供試品溶液高效液相色譜圖如圖1所示,不同浸泡時(shí)間、提取時(shí)間、提取次數(shù)的7種生物堿的結(jié)果如圖2所示。

注:1.金雀花堿;2.槐定堿;3.氧化苦參堿;4.氧化槐果堿;5.N-甲基野靛堿;6.苦參堿;7.槐果堿。圖1 苦豆子混合對(duì)照品溶液(A)和供試品溶液(B)的高效液相色譜圖Fig 1 HPLC Chromatograms of mix standard solution(A)and test solution(B)of Sophora alopecuroides L

圖2 不同浸泡時(shí)間(A)、提取時(shí)間(B)和提取次數(shù)(C)苦豆子藥材水提的7種生物堿成分趨勢(shì)圖Fig 2 Trend of 7 alkaloid components in water extraction of Sophora alopecuroides with different soaking time (A), extraction time (B) and extraction times (C)

如圖2A所示,浸泡時(shí)間為1～6 h,隨著浸泡時(shí)間的增加,水提液中金雀花堿、槐定堿、氧化苦參堿、氧化槐果堿、N-甲基野靛堿、苦參堿只有少量增加,氧化槐果堿、氧化苦參堿、槐定堿增加明顯,且在浸泡3 h達(dá)到最高點(diǎn),3 h之后,隨著時(shí)間的增加,氧化槐果堿、氧化苦參堿、槐定堿均開始下降明顯,說明浸泡時(shí)間不能超過3 h;如圖2B 所示,苦豆子藥材提取時(shí)間為1～4 h,隨著提取時(shí)間延長,金雀花堿基本保持不變,除金雀花堿外其他6種生物堿成分均逐步增加,在提取3 h到達(dá)頂點(diǎn),3 h之后開始下降,說明每次提取時(shí)間不能超過3 h;如圖2C所示,提取次數(shù)為 1～4次時(shí),隨著提取次數(shù)增加,苦豆子中被提出的7種生物堿的量越多,但增長的趨勢(shì)在逐步減緩。

3 討 論

我國的苦豆子總產(chǎn)量占世界的62%[32],廣泛分布于我國的沙漠地區(qū),是生長于沙土上耐鹽的多年生草本根莖地下芽植物,具有較強(qiáng)的生命力與繁殖力,植株特別是果實(shí)味極苦,青綠狀態(tài)下野生動(dòng)物及畜禽均不采食,因而自然環(huán)境中儲(chǔ)備量較大,經(jīng)適口性改良后,可用于畜禽預(yù)防、治療使用[33]。文中檢測(cè)的苦豆子中7種生物堿成分,屬于喹諾里西啶生物堿類成分,具有抗病毒、抗炎、抗?jié)?、抗腹瀉等功效[33-34],文獻(xiàn)報(bào)道,可明顯改善畜禽養(yǎng)殖過程中的仔豬、羔羊腹瀉。

研究采用高效液相色譜法,以水作為提取溶媒,研究不同浸泡時(shí)間、不同提取時(shí)間、不同提取次數(shù)對(duì)苦豆子藥材水提液中7種生物堿成分的量變規(guī)律,發(fā)現(xiàn)浸泡時(shí)間對(duì)氧化槐果堿、氧化苦參堿、槐定堿影響明顯,且浸泡時(shí)間不宜超過3 h;提取時(shí)間對(duì)除金雀花堿外的其他6種生物堿的量有增加,且提取超過3 h后開始下降;隨著提取次數(shù)的增加,提取出的7種生物堿的量也在逐步增加。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,苦豆子中生物堿類成分的含量,對(duì)提取工藝的各個(gè)因素比較敏感,需精確控制提取條件,可為苦豆子生物堿成分的利用和實(shí)際生產(chǎn)中的苦豆子水提工藝提供科學(xué)依據(jù),同時(shí)對(duì)于其他含有生物堿類成分的藥材,也具備一定參考價(jià)值。在實(shí)際應(yīng)用當(dāng)中,需綜合考慮生物堿類成分含量、能耗損失等因素,確定具體生產(chǎn)條件。