楊婷婷，羅毅皓*，張藝煒，馮聲寶，孫萬成，談婷，李善文，孔令武

（1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海西寧 810016；2.青?；ブ煊拥虑囡乒煞萦邢薰?，青海海東 810500）

青稞是種植在高原缺氧環(huán)境中的一種特色農(nóng)作物，與釀酒常用的高粱相比，青稞的營(yíng)養(yǎng)成分具有一定優(yōu)越性，含有更豐富的β-葡聚糖、多酚和維生素B

等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[1]。目前有研究發(fā)現(xiàn)青稞總多酚含量可達(dá)到414.55 mg/100 g，比燕麥和藜麥中的總多酚含量更高[2]，且不同品種和產(chǎn)地的青稞中總多酚含量存在顯著差異[3]。青稞多酚提取物中主要以結(jié)合酚為主[4]，其次為游離酚。經(jīng)過發(fā)酵處理后的青稞多酚抗氧化能力提高，即在微生物作用下多酚以游離態(tài)溶出，使游離多酚和結(jié)合多酚的含量均顯著增加，且總多酚與抗氧化活性之間存在極強(qiáng)的相關(guān)性，因此總多酚含量增加能提升青稞多酚的抗氧化活性[5]。

青稞酒是以青稞為主要原料，采用“清蒸清燒四次清”的獨(dú)特釀造工藝制成的清香型白酒。與傳統(tǒng)高粱酒相比，青稞酒酸和酯的比例較低，微量風(fēng)味成分的含量更豐富，含有18 種對(duì)人體健康有益的差異萜烯類物質(zhì)[6]。

青稞酒糟（highland barley fermentation spent，HBFS）是青稞酒釀造后剩余的酒渣，別名酒醅糟和粕，是一種純青稞原糧酒糟[7]。濕青稞酒糟產(chǎn)量大，目前青稞酒的年銷量1.13 萬t[8]，釀造1 t 青稞酒會(huì)產(chǎn)生1 t 左右的HBFS。前期研究發(fā)現(xiàn)釀造后的酒糟中含有多酚、維生素、蛋白質(zhì)、γ-氨基丁酸以及β-葡聚糖等物質(zhì)[9]，Gibreel等[10]研究發(fā)現(xiàn)，酒糟中含有豐富的酚類化合物。與傳統(tǒng)高粱酒糟相比，青稞酒糟中單寧含量更低，蛋白質(zhì)和碳水化合物含量更高[11]，同時(shí)青稞酒糟pH 值約為3.5，營(yíng)養(yǎng)豐富的酸性環(huán)境利于微生物生長(zhǎng)，導(dǎo)致酒糟腐敗，從而造成環(huán)境污染和資源浪費(fèi)。因此，以酒糟為原料提取活性成分能有效防止環(huán)境污染，且具有低成本、高效益等優(yōu)點(diǎn)。

目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究成果表明，HBFS 最主要的利用途徑是制成飼料和肥料[12]，但這種簡(jiǎn)單的處理方式會(huì)造成資源浪費(fèi)及產(chǎn)品附加值低。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)微波提取的啤酒麥糟（brewers'spent grain，BSG）的酚類化合物具有良好的抗氧化能力[13]；Landeka Jurˇcevic等[14]研究發(fā)現(xiàn)葡萄酒糟多酚對(duì)抗氧化應(yīng)激有顯著作用。因此，研究青稞酒糟酚類化合物的抗氧化活性，是實(shí)現(xiàn)青稞酒糟高值化利用的有效途徑之一。

目前超聲波輔助提取已應(yīng)用于多種植物化合物的提取[15]，通過提高萃取溫度，提高待萃取植物化合物的溶解度，顯著縮短提取時(shí)間，但易氧化的酚類化合物長(zhǎng)時(shí)間暴露于高溫環(huán)境中會(huì)加速氧化。因此，獲得最佳的提取溫度、提取時(shí)間和料液比對(duì)于最大限度地提高工藝得率和目標(biāo)化合物的穩(wěn)定性非常重要。本研究采用超聲波輔助提取青稞酒糟多酚并對(duì)其進(jìn)行體外抗氧化活性研究，以期為后續(xù)開發(fā)新型抗氧化產(chǎn)品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

青稞酒糟：青?；ブ煊拥虑囡乒煞萦邢薰?；1.1-二苯基-2-苦肼基（1.1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（≥97.0%）（生化試劑）：合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；福林酚試劑（生化試劑）：北京索萊寶科技有限公司；抗壞血酸（VC）（分析純）：天津市福晨化學(xué)試劑有限公司；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98.0%）：北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

潮汐研磨機(jī)（800A）：東莞市華太電器有限公司：電子分析天平（ESJ110-413）：沈陽龍騰電子有限公司；雙光束紫外可見分光光度計(jì)（UV-1780）：島津儀器（蘇州）有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-6）：常州市金壇友聯(lián)儀器研究所；循環(huán)水式多用真空泵（SHB-III）：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理

取一定量干酒糟，潮汐研磨機(jī)打粉。過80 目篩，備用。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

根據(jù)朱俊玲等[16]的方法稍作修改，得到多酚提取液，于4 ℃冰箱中保存，待測(cè)。

固定超聲溫度60 ℃，料液比1 ∶15（g/mL），超聲時(shí)間40 min，考察超聲功率（240、320、400、480、560 W）對(duì)多酚得率的影響。

固定超聲溫度60 ℃，料液比1 ∶15（g/mL），超聲功率400 W，考察超聲時(shí)間（30、35、40、45、50 min）對(duì)多酚得率的影響。

固定料液比1 ∶15（g/mL），超聲功率400 W，超聲時(shí)間40 min，考察超聲溫度（40、45、50、55、60 ℃）對(duì)多酚得率的影響。

固定超聲溫度60 ℃，超聲功率400 W，超聲時(shí)間40 min，考察料液比[1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）]對(duì)多酚得率的影響。

1.2.3 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇超聲溫度、超聲功率、超聲時(shí)間和料液比進(jìn)行四因素四水平的正交試驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。正交試驗(yàn)因素與水平如表1所示。

1.2.4 多酚得率測(cè)定的計(jì)算

參考T/AHFIA 005—2018《植物提取物及其制品中總多酚含量的測(cè)定分光光度法》[17]稍作修改進(jìn)行檢測(cè)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：稱取一定量的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，用水配制成濃度為0、4、8、12、20、30 mg/L 的溶液。取1.0 mL 沒食子酸溶液、2.5 mL 福林酚試劑和2.5 mL 15% Na2CO3溶液加入10 mL 具塞試管中，蒸餾水定容至刻度，振蕩1 min，于40 ℃水浴中反應(yīng)60 min，在750 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

待測(cè)液的配制：將1.0 mL 青稞酒糟多酚提取液加入10 mL 容量瓶中，用9 mL 60%乙醇定容至刻度，超聲處理10 min 后，靜置待測(cè)。

將1.0 mL 待測(cè)液、2.5 mL 福林酚試劑和2.5 mL 15% Na2CO3溶液加入10 mL 具塞試管中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻。40 ℃水浴60 min，靜置冷卻20 min，待測(cè)。

多酚含量計(jì)算公式如下。

X=c×10×n

式中：X表示提取液中的多酚含量，mg/mL；c表示由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出的待測(cè)液中的多酚含量，mg/mL；10 表示稀釋倍數(shù)；n表示樣品稀釋倍數(shù)。

多酚得率計(jì)算公式如下。

式中：A表示多酚得率，mg/g；X表示提取液中多酚的含量，mg/mL；v表示提取液總體積，mL；m表示HBFS的質(zhì)量，g。

1.3 青稞酒糟多酚的體外抗氧化試驗(yàn)

1.3.1 對(duì)DPPH·的清除效果

參考Abeynayake 等[18]的方法稍作修改。向具塞試管內(nèi)加入0.5 mL 樣品液和2 mL 0.04 mg/mL DPPH 溶液（吸光度記為A）i，取無水乙醇代替DPPH 溶液（吸光度記為A）j，取無水乙醇代替其中的樣品溶液（吸光度記為A）0，上述3 種混合液混勻后于室溫下放置30 min，2 000 r/min 離心10 min，取上清液在517 nm 處測(cè)定吸光度。VC做陽性對(duì)照。DPPH·清除率（Y1，%）計(jì)算公式如下。

Y1=[1-（Ai-Aj）/A0]×100

1.3.2 對(duì)羥基自由基（·OH）的清除效果

參考谷睿等[19]的方法進(jìn)行檢測(cè)。取1 mL 8.8 mmol/L過氧化氫溶液、1 mL 9 mmol/L 硫酸鐵溶液、1 mL 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液，不同濃度的樣品溶液1 mL 和去離子水（吸光度記為A）x；用去離子水替代其中的過氧化氫溶液（吸光度記為A）y，用過氧化氫代替其中的樣品溶液（吸光度記為A0），搖勻后于37 ℃水浴15 min，在510 nm 處測(cè)定吸光度。以VC作為陽性對(duì)照?！H 清除率（Y2，%）計(jì)算公式如下。

Y2=[1-（Ax-Ay）/A0]×100

1.3.3 對(duì)超氧自由基（·O2-）的清除效果

參考Kiss 等[20]的方法稍作修改。4 425 μL 50 mmol/L Tris-HCl 緩沖液，加入鄰苯三酚溶液75 μL，迅速混合，每30 s 記錄1 次讀數(shù)，30 s 時(shí)的吸光度記為A30；300 s時(shí)的吸光度記為A300，即ΔA0=A300-A30。

取450 μL 樣品溶液，2 500 μL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH7.4），再加鄰苯三酚溶液50 μL，迅速混合，每30 s 記錄1 次讀數(shù)，30 s 時(shí)的吸光度記為A30；300 s時(shí)的吸光度記為A300，即ΔA樣=A300-A30?？瞻讓?duì)照組以相同體積蒸餾水代替樣品?！2-清除率（Y3，%）計(jì)算公式如下。

Y3=（ΔA0-ΔA樣）/ΔA0×100

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用IBM SPSS statistics 24 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，以P<0.05 表示差異顯著，繪圖選用Origin Pro軟件，所有試驗(yàn)至少重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 青稞酒糟多酚的提取工藝優(yōu)化

2.1.1 青稞酒糟多酚含量的測(cè)定結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve

采用不同濃度沒食子酸制作標(biāo)曲，得到線性方程y=0.010 33x+0.008 4，R2=0.998 1，線性關(guān)系良好。對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算待測(cè)液中青稞酒糟的多酚含量。

2.1.2 單因素試驗(yàn)

2.1.2.1 超聲功率對(duì)多酚得率的影響

超聲功率對(duì)多酚得率的影響見圖2。

由圖2 可知，超聲功率在240～400 W 時(shí)，青稞酒糟多酚得率隨著超聲功率增加而增加，超聲功率在400～560 W 時(shí)，青稞酒糟多酚得率隨著超聲功率增加而減少，在400 W 時(shí)達(dá)到最大值。隨著超聲功率的增加，超聲波的空化效應(yīng)使青稞酒糟中植物細(xì)胞壁被大量破壞，加速多酚進(jìn)入提取溶劑中，但當(dāng)超聲功率過高時(shí)，較高的超聲功率產(chǎn)生熱效應(yīng)使提取溶劑中部分多酚溶解，導(dǎo)致多酚得率降低。因此選擇320、400、480、560 W 進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.2.2 超聲時(shí)間對(duì)多酚得率的影響

超聲時(shí)間對(duì)多酚得率的影響見圖3。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)多酚得率的影響Fig.3 Effect of ultrasound time on yield of polyphenols

由圖3 可知，隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)，青稞酒糟的多酚得率先增大后減小，在超聲40 min 時(shí)達(dá)到峰值。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是超聲時(shí)間越長(zhǎng)越利于多酚溶出，但多酚長(zhǎng)時(shí)間處于高溫環(huán)境和超聲環(huán)境中，超聲波的熱效應(yīng)對(duì)青稞酒糟多酚的穩(wěn)定性產(chǎn)生不利影響，溶液中部分多酚類物質(zhì)降解，導(dǎo)致多酚得率降低。因此選擇35、40、45、50 min 進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.2.3 超聲溫度對(duì)多酚得率的影響

超聲溫度對(duì)多酚得率的影響見圖4。

圖4 超聲溫度對(duì)多酚得率的影響Fig.4 Effect of ultrasound temperature on yield of polyphenols

由圖4 可知，超聲溫度低于55 ℃時(shí)，多酚得率隨著溫度升高而增加，可能是因?yàn)闇囟壬?，分子熱運(yùn)動(dòng)加快，加快多酚浸出的速度。多酚得率在55 ℃時(shí)達(dá)到最大值，當(dāng)超聲溫度從55 ℃升高到60 ℃時(shí)，多酚得率隨溫度升高而減小。出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是因?yàn)橹参锒喾訉?duì)高溫環(huán)境比較敏感，60 ℃的超聲溫度過高，高溫環(huán)境破壞部分青稞酒糟多酚的結(jié)構(gòu)，同時(shí)高溫環(huán)境會(huì)加速提取溶劑揮發(fā)，影響提取的料液比，從而導(dǎo)致青稞酒糟多酚得率降低。因此選擇40、45、50、55 ℃進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.2.4 料液比對(duì)多酚得率的影響

多酚類物質(zhì)為多羥基化合物，這類物質(zhì)能溶于水，易溶于乙醇，但由于水中存在部分溶解氧，容易導(dǎo)致多酚類物質(zhì)的氧化，影響多酚的抗氧化能力，因此選擇乙醇作為提取溶劑。料液比對(duì)多酚得率的影響見圖5。

圖5 料液比對(duì)多酚得率的影響Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on yield of polyphenols

由圖5 可知，當(dāng)溶劑添加量逐漸增加，多酚得率逐漸增大，但料液比1 ∶25（g/mL）時(shí)的多酚得率較1 ∶20（g/mL）增幅較小，提取時(shí)使用的溶劑量過多，提取液中會(huì)溶解更多雜質(zhì)，為避免溶劑浪費(fèi)，提高提取液中多酚類物質(zhì)的純度，所以選擇1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20（g/mL）進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.3 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析正交試驗(yàn)結(jié)果和差異性分析見表2 和表3。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Orthogonal test results and analysis

續(xù)表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Continue table 2 Orthogonal test results and analysis

表3 差異性分析Table 3 Difference analysis

由表2 可知，不同提取因素對(duì)青稞酒糟多酚得率影響程度不同，在4 種因素中料液比對(duì)多酚得率的影響最大。由表3 可知，超聲功率的P值小于顯著水平，說明不同超聲功率在青稞酒糟多酚得率上存在顯著差異，料液比的P值小于極顯著水平（0.01），說明不同料液比提取的青稞酒糟多酚得率差異極顯著。

在最優(yōu)提取工藝A2B2C4D4下，即超聲功率400 W、超聲溫度45℃、超聲時(shí)間50 min、料液比1 ∶20（g/mL），多酚的得率為（3.337 1±0.149 8）mg/g，與朱俊玲等[16]相比多酚的提取率提高了1.8 倍左右，與夏陳等[21]的研究結(jié)果相比提高了2 倍。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是不同品種的青稞以及青稞栽種環(huán)境影響了青稞中的多酚含量，同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)青稞經(jīng)過發(fā)酵處理后，在微生物的代謝產(chǎn)物作用下，游離酚和結(jié)合酚的含量均增加[22]。還有研究表明，不同的釀酒工藝也會(huì)影響青稞酒糟中多酚的含量，導(dǎo)致多酚得率的改變[12]。

2.2 青稞酒糟多酚的體外抗氧化試驗(yàn)

2.2.1 對(duì)DPPH·的清除效果

不同濃度青稞酒糟多酚對(duì)DPPH·的清除效果見圖6。

圖6 不同濃度青稞酒糟多酚對(duì)DPPH·的清除效果Fig.6 DPPH·scavenging effects of polyphenols at different concentrations

由圖6 可知，當(dāng)青稞酒糟濃度為21 μg/mL 時(shí)，對(duì)DPPH·的清除率最高，為（83.76±1.35）%，表明青稞酒糟多酚對(duì)DPPH·有良好的清除效果。與黃酒糟[23]和其他白酒酒糟[24]相比，青稞酒糟多酚對(duì)DPPH·的清除效果更好，但茶酒糟多酚對(duì)DPPH·的清除效果優(yōu)于青稞酒糟多酚[25]。可能是因?yàn)槎喾宇愇镔|(zhì)的來源不同，導(dǎo)致提取液中酚類物質(zhì)種類及含量不同，影響對(duì)DPPH·的清除效果。即所使用的谷物類型可能對(duì)酚類成分和抗氧化特性產(chǎn)生至關(guān)重要的影響[26]。

2.2.2 對(duì)·OH 的清除效果

不同濃度青稞酒糟多酚對(duì)·OH 的清除效果見圖7。

圖7 不同濃度青稞酒糟多酚對(duì)·OH 的清除效果Fig.7 ·OH scavenging effects of polyphenols at different concentrations

由圖7 可知，青稞酒糟多酚表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化性，經(jīng)計(jì)算得出青稞酒糟多酚對(duì)·OH 的IC50為14.79 μg/mL，在相同質(zhì)量濃度下，青稞酒糟多酚對(duì)·OH 的清除率高于青稞多酚[27]，出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是因?yàn)榘l(fā)酵青稞比未發(fā)酵青稞的·OH 的清除效果更好，發(fā)酵過程中受微生物種類的影響，多酚化合物的種類和含量出現(xiàn)了明顯變化，導(dǎo)致抗氧化能力改變。同時(shí)已有試驗(yàn)證明，經(jīng)過微波處理的BSG 會(huì)產(chǎn)生具有高抗氧化活性的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，即羥基肉桂酸的衍生物，對(duì)·OH 的清除具有積極效果[28]。

2.2.3 對(duì)·O2-的清除效果

多酚類化合物中對(duì)·O2-起主要清除作用的是A環(huán)和B 環(huán)上的羥基，其中鄰位羥基具有更好的清除能力[29]。不同濃度青稞酒糟多酚對(duì)·O2-的清除效果見圖8。

圖8 不同濃度青稞酒糟多酚對(duì)·O2-的清除效果Fig.8 ·O2-scavenging effects of polyphenols at different concentrations

由圖8 可知，多酚提取物的抗氧化能力與提取物中的總酚含量呈正相關(guān)。當(dāng)青稞酒糟多酚濃度為21 μg/mL 時(shí)，·O2-清除率為（76.88±1.47）%。對(duì)·O2-的清除效果優(yōu)于甘蔗葉多酚[30]，原因可能是不同結(jié)構(gòu)的多酚化合物對(duì)·O2-的清除能力不同，通過不同方法提取的多酚對(duì)·O2-的清除效果也存在差異。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以青稞酒糟為原料，通過單因素試驗(yàn)結(jié)合正交試驗(yàn)優(yōu)化青稞酒糟多酚超聲波輔助提取工藝，最優(yōu)提取工藝為超聲功率400 W、超聲溫度45 ℃、超聲時(shí)間50 min 和料液比1 ∶20（g/mL），在該條件下青稞酒糟多酚的得率為（3.337 1±0.149 8）mg/g。進(jìn)一步檢測(cè)不同濃度青稞酒糟多酚對(duì)DPPH·、·OH 和·O2-的清除效果，清除效果隨濃度增大而提高，當(dāng)青稞酒糟多酚濃度為21 μg/mL 時(shí)，對(duì)DPPH·的清除率為（83.76±1.35）%，對(duì)·OH 的清除率為（52.05±2.09）%，對(duì)·O2-的清除率為（76.88±1.47）%。

綜上所述，本試驗(yàn)初步探索了青稞酒糟多酚的提取方法及其工藝優(yōu)化，但青稞酒糟多酚的作用機(jī)理和功效仍需進(jìn)一步研究與探索，對(duì)其應(yīng)用潛力進(jìn)行充分地挖掘，將為青稞酒糟多酚應(yīng)用提供新方向，對(duì)新產(chǎn)品的研發(fā)產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響，推動(dòng)實(shí)現(xiàn)青稞酒糟的高值化利用。