王杰，劉延照，李潔，2，3，嚴守雷，2，3*，胡中立

（1.華中農業(yè)大學食品科學技術學院，湖北武漢 430070；2.湖北省水生蔬菜保鮮加工工程技術研究中心，湖北武漢 430070；3.長江經濟帶大宗水生生物產業(yè)綠色發(fā)展教育部工程研究中心，湖北武漢 430070；4.武漢大學生命科學學院，湖北武漢 430070）

蓮藕（Nelumbo nuciferaG.）是我國種植的一種重要的水生蔬菜，主要分布于湖北、湖南、江蘇等地區(qū)[1]。蓮藕具有很高的營養(yǎng)價值，富含碳水化合物、礦物質、蛋白質、多酚等[2-3]。近年來天然植物多酚因其顯著的抗氧化活性以及抑菌作用，成為國內外學者的研究熱點。有研究表明，在常見的數(shù)十種蔬菜中，蓮藕中的酚類物質含量較高[4]。孫杰等[5]研究發(fā)現(xiàn)蓮藕中的多酚主要為沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、沒食子兒茶素、多巴、咖啡酸等。蓮藕在加工和食用中可被分為去皮藕段、藕皮和藕節(jié)3 個部位，其中藕節(jié)的多酚含量高于藕皮和去皮藕段，具有更強的抗氧化活性[6]，但藕節(jié)通常被作為下腳料或廢棄物。

蓮藕淀粉是蓮藕的重要傳統(tǒng)加工產品之一，具有調理脾胃、補充氣血、滋陰等功效，深受廣大消費者青睞[7]。在蓮藕淀粉的制作過程中需要經過勻漿的步驟，這其中涉及到細胞和組織的破壞，引起細胞內外酚類物質的釋放。蓮藕中的內源性酚類與蓮藕淀粉相互接觸并附著在其表面或者內部，形成結合態(tài)多酚[8]。目前結合酚的提取主要分為堿法提取（氫氧化鈉溶液）和酸法提?。蛩?、鹽酸）[9]。在淀粉中，酸法涉及高溫會造成一部分酚類物質的損失，強酸則具有較大的腐蝕性使多酚發(fā)生水解；強堿會使淀粉嚴重糊化，無法正常提取淀粉中的結合酚[10]。馮芝英等[11]以糙米為原料，通過堿提法得到結合態(tài)酚粗提物。淀粉中的多酚研究目前較少，并只存在對游離酚的探究，牛鵬飛等[12]用乙醇浸提法和高效液相色譜法分析了橡子淀粉中的多酚組成，但是對于淀粉結合酚還未有研究報道。

目前人們對于蓮藕淀粉的形態(tài)、生理功能研究較多[13]，但是對其多酚的存在形式、組分含量研究較少。本文以鄂蓮5 號自制蓮藕淀粉為試驗材料，首次使用乙醇保護的堿提法對其多酚的存在形式、多酚組成以及影響多酚含量的因素進行研究，旨在揭示蓮藕淀粉酚類物質的存在形式以及影響蓮藕淀粉多酚含量的因素，為蓮藕淀粉的工藝優(yōu)化和蓮藕淀粉功能活性的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鄂蓮5 號鮮藕，2021年10月份采收于湖北武漢。

氫氧化鈉、鹽酸、乙酸乙酯、乙醚、無水乙醇（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；甲醇、乙腈、甲酸（均為色譜純）：美國Fisher 公司；沒食子兒茶素、兒茶素、表兒茶素標準品（純度均≥98.0%）：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

MX-101SG1 攪拌機：日本Panasonic 公司；101-2B電熱鼓風干燥箱：長葛市明途機械設備有限公司；ST 16R 高速冷凍離心機、Q ExactiveTMPlus 液相色譜質譜聯(lián)用儀：美國Thermo Fisher 公司；KQ-600DB 數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；R-215 旋轉蒸發(fā)儀：瑞士Büchi 有限公司；E2695 高效液相色譜儀：美國Waters 公司；EX30 生物顯微鏡：舜宇光學科技（集團）有限公司；LGJ-18 真空冷凍干燥機：北京松源華興科技發(fā)展有限公司；FV3000 激光掃描共聚焦顯微鏡：日本Olympus 公司。

1.3 方法

1.3.1 蓮藕淀粉以及藕節(jié)蓮藕淀粉制備

將整支新鮮蓮藕洗凈切塊，使用攪拌機以1 ∶3（g/mL）的料液比用水勻漿，過100 目紗布去渣，反復加水過濾，直至將藕渣內的漿液洗凈為止。漿液加水沉淀3 次，棄上清液，4 500 r/min 離心15 min，得到離心杯底部白色的固體，刮去表層深色雜質。在電熱鼓風干燥箱45 ℃恒溫干燥，樣品粉碎后，過100 目標準篩，篩下的淀粉為蓮藕淀粉。

藕節(jié)蓮藕淀粉制備時，材料為相同質量的整支蓮藕與藕節(jié)，其余步驟同上述蓮藕淀粉制備方法。

1.3.2 蓮藕不同部位藕汁多酚制備

分別將藕節(jié)、藕皮、去皮藕段洗凈切塊，在攪拌機中以1 ∶3（g/mL）的料液比用水勻漿，過100 目紗布去渣，將濾渣反復加水過濾后合并濾液，10 000 r/min 離心10 min 取上清液，真空旋蒸濃縮至50 mL，用等體積乙酸乙酯和乙醚混合液萃取5 次，合并萃取液。于40 ℃旋蒸濃縮至干，將殘渣溶于色譜甲醇中，超聲使其完全溶解，并定容至5 mL，再用0.22 μm 有機微孔濾膜過濾，-20 ℃保存?zhèn)溆?，即得到蓮藕不同部位藕汁多酚?/p>

1.3.3 激光掃描共聚焦顯微鏡

參考文獻[14]的方法，樣品在激光掃描共聚焦顯微鏡下進行觀察，激發(fā)光源為488 nm 光柵處觀察酚類物質的綠色熒光。

1.3.4 蓮藕淀粉酚類化合物的提取

蓮藕淀粉不同形態(tài)酚類化合物提取工藝參考文獻[15]并進行優(yōu)化，得到提取游離酚和結合酚的方法：

游離酚的提?。悍Q取5.00 g 蓮藕淀粉于離心管中，按1 ∶20（g/mL）的料液比，加入100 mL 70%乙醇溶液，室溫下360 W 超聲提取40 min，4 200 r/min 離心10 min后收集上清液，重復提取3 次，合并乙醇提取液，于40 ℃下旋蒸濃縮至干，將殘渣溶于色譜甲醇中，超聲使其完全溶解，并定容至10 mL，再用0.22 μm 有機微孔濾膜過濾，-20 ℃保存?zhèn)溆?，此部分為游離酚。提取過游離酚的蓮藕淀粉于電熱鼓風干燥箱45 ℃恒溫干燥，樣品粉碎后，過100 目標準篩，以供結合酚的提取。

結合酚的提取：稱取提取完游離酚的殘渣5.00 g，加入200 mL 2 mol/L NaOH（溶劑為50%乙醇溶液），同時充入氮氣，密封避光消化75 min。4 000 r/min 離心10 min 后收集上清液，用6 mol/L HCl 調節(jié)pH 值至2，于45 ℃條件下旋轉蒸發(fā)去除乙醇，用等體積乙酸乙酯和乙醚混合液萃取5 次。將萃取所得有機相合并，于35 ℃旋轉蒸發(fā)至干。超聲使其完全溶解，并定容至5 mL，再用0.22 μm 有機微孔濾膜過濾，-20 ℃保存?zhèn)溆?，該部分即為堿水解結合酚提取物。按照相同的方法處理標準品。

1.3.5 酚類物質分析方法

采用高效液相色譜-串聯(lián)質譜法（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLCMS/MS）和高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）對多酚進行定性定量分析。色譜條件：XDB-C18 液相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A：0.4%甲酸；流動相B：乙腈；流速：1 mL/min；檢測波長：280 nm；進樣量：10 μL；柱溫：25 ℃。0～40 min（95%～75% A），40～50 min（75%～50% A），50～55 min（50%～30% A），55～56 min（30%～10% A），56～62 min（10% A），62～70 min（10%～95% A），70～75 min（95%A）。質譜條件參考文獻[16]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗所得數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2016 進行基礎統(tǒng)計處理，數(shù)據(jù)以平均值±標準差（n=3）表示，用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件中的Duncan 檢驗進行數(shù)據(jù)顯著性分析（P<0.05），使用Origin2018 繪圖導出。

2 結果與分析

2.1 激光共聚焦顯微鏡分析

酚類物質的自體熒光特性使其在淀粉上的分布可以使用激光掃描共聚焦顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM）觀察[17]，結果如圖1所示。

圖1 蓮藕淀粉CLSM 顯微鏡圖Fig.1 CLSM images of lotus rhizome starch

由圖1 可知，蓮藕淀粉中可以觀察到微弱的熒光，說明其含有酚類物質。藕節(jié)蓮藕淀粉出現(xiàn)了明顯的綠色熒光，并且多酚均勻地附著在淀粉的表面，說明在制作蓮藕淀粉時藕節(jié)可以提高蓮藕淀粉的多酚含量。

2.2 蓮藕淀粉游離酚分析

多酚標準品HPLC 色譜圖見圖2，3 種標準品的回歸方程見表1。

圖2 多酚標準品HPLC 色譜圖Fig.2 Chromatogram of polyphenol standard mixture

表1 3 種標準品的回歸方程Table 1 Regression equations for three standard substances

由圖2 和表1 可知，3 種標準品的出峰順序為沒食子兒茶素（10.05 min）、兒茶素（17.58 min）以及表兒茶素（22.63 min）?；衔锏淖畲笪詹ㄩL與物質的結構有關，所以可以作為化合物紫外吸收特征之一，沒食子兒茶素的λmax為269.8 nm，兒茶素和表兒茶素的λmax均為271.0 nm，因為兒茶素和表兒茶素是同分異構體，具有相同的官能團和共軛雙鍵，有相同的能級結構，所以會表現(xiàn)出相同的最大吸收波長。通過保留時間以及最大吸收波長可以進行酚類物質的定性分析。3 種多酚的標準曲線相關系數(shù)R2均在0.999 以上，可以進行定量分析。

多酚標準品色譜圖和回歸方程如表2所示。

表2 蓮藕淀粉游離酚含量Table 2 Content of free polyphenols in lotus rhizome starch μg/g

應用超聲波技術輔助提取植物活性成分，可以縮短提取時間及有效提高效率[18]，但本次試驗將蓮藕淀粉用超聲波輔助法無法提取出酚類物質，之前研究報道酚類物質與多糖可以通過共價鍵、氫鍵等形式結合[19]，結合比較緊密，可能是無法提出游離酚的原因。由表2可知，當提取淀粉時加入大量藕節(jié)后，蓮藕淀粉中的酚類物質含量增加，可以提取出沒食子兒茶素和兒茶素，但是含量很低，僅為7.22 μg/g 和3.76 μg/g。

2.3 蓮藕淀粉結合酚分析

NaOH 溶液可以破壞淀粉分子內氫鍵，而且能夠滲透到淀粉微晶結構內部促進淀粉顆粒中微晶束的解體[20]，所以在提取結合酚時添加NaOH 會破壞淀粉的結構，加快淀粉的糊化。在堿法提取結合酚中使用2 mol/L 的NaOH 溶液使淀粉懸濁液的黏度急劇增大，無法正常提取淀粉中的酚類物質。使用乙醇保護的堿提法提取蓮藕淀粉中的結合酚時，蓮藕淀粉的形態(tài)如圖3所示。

圖3 蓮藕淀粉顯微圖（640×）Fig.3 Micrographs of lotus rhizome starch before and after alkali treatment（640×）

由圖3 可知，堿處理前蓮藕淀粉呈典型的橢圓形，堿處理后，蓮藕淀粉仍然可以保持顆粒完整，不會發(fā)生明顯的糊化。所以本試驗中使用乙醇作為保護劑時，蓮藕淀粉并未發(fā)生黏度急劇增大的現(xiàn)象，說明乙醇不僅可以作為酚類物質的溶劑，還可以保護淀粉不發(fā)生糊化。

在各種植物資源中，結合多酚的含量遠高于游離多酚[21]，堿提法已經成為提取植物結合酚的主要方法。使用堿法提取多酚的方法處理沒食子兒茶素標準品、兒茶素、蓮藕淀粉以及藕節(jié)蓮藕淀粉得到的色譜圖見圖4。

圖4 堿提結合酚色譜圖Fig.4 Chromatograms of polyphenols in different samples

由圖4 A 可知，當沒食子兒茶素標準品用堿提結合酚的方法水解后，沒食子兒茶素水解為4 個特征峰，其中10.09 min 的出峰時間和正常沒食子兒茶素的時間相似（圖2），但是最大吸收波長變成了291.2 nm，說明堿性環(huán)境使沒食子兒茶素的結構發(fā)生了變化[22]。由圖4 B 可知，兒茶素經過堿回收后水解的碎片更多，其中有3 個峰（9.69、10.42 min 和22.60 min）的響應值和峰面積較大，將這3 個峰設定為兒茶素堿水解的特征峰。其中10.42 min 的出峰時間與沒食子兒茶素相似以及最大吸收波長相同（圖4A），說明兒茶素在堿的作用下生成和沒食子兒茶素相同的物質。

由圖4 C、D 可知，在蓮藕淀粉的堿提結合酚中，均出現(xiàn)了與沒食子兒茶素特征峰相同的峰，說明結合在蓮藕淀粉上的酚類物質有沒食子兒茶素。雖然無法絕對定量，但是從色譜圖中峰的響應值和峰面積可以得到，藕節(jié)蓮藕淀粉所含沒食子兒茶素的量要明顯高于普通蓮藕淀粉，說明藕節(jié)對蓮藕淀粉的多酚含量有很大的影響，與圖1 熒光結果一致。同時在色譜圖中均發(fā)現(xiàn)了與兒茶素峰相同的峰，說明結合在蓮藕淀粉上的酚類物質還有兒茶素。在前期試驗中發(fā)現(xiàn)酸法無法提出蓮藕淀粉中的多酚，而堿法可以破壞酚類物質與細胞壁等其他物質的酯鍵和醚鍵[23]，說明蓮藕淀粉中的多酚主要存在形式為酯鍵或醚鍵。

2.4 藕節(jié)汁酚類物質的定性分析

為了探究蓮藕不同部位對蓮藕淀粉多酚含量的影響，首先用HPLC-MS/MS 對制備蓮藕淀粉時藕汁的酚類物質進行分析。藕汁酚類物質HPLC 色譜圖以及LC-MS 總離子流色譜圖見圖5。

圖5 藕汁酚類物質HPLC 色譜圖和LC-MS 總離子流色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram and total ion chromatogram of polyphenols in lotus rhizome juice

使用提取的離子色譜圖對酚類物質進行了定性分析，通過離子碎片以及查閱相關文獻[24]，7 種多酚單體和7 種多酚低聚體，酚類物質鑒定結果見表3。

表3 負離子模式下LC-MS 對藕汁中主要多酚類質譜峰的鑒定結果Table 3 Main polyphenols in lotus rhizome juice identified by LC-MS in the negative ionization mode

由表3 可知，通過質譜鑒定出的酚類物質分別為沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素、兒茶素、咖啡酸、表兒茶素、二氫楊梅素、槲皮素以及可能的原花青素低聚體。這些原花青素低聚體是以兒茶素或表兒茶素為單體構成，其中主要為B 型連接（C4-C8 或C4-C6）和A型連接（C4→C8、C4→C6 或C2→O7）混合構成[25]。原花青素是最有效的天然抗氧化劑之一，且與淀粉的相互作用也強于單體酚[26]。之前研究報道在蓮藕中還檢測到沒食子酸、香豆酸，本研究結果與之略有差異。物候期是影響酚類總酚含量的因素之一[27]，所以結果的不同可能與蓮藕的品種以及酚類物質提取方法的不同有關。

2.5 藕汁酚類物質定量分析

通過高效液相色譜定量檢測了蓮藕不同部位藕汁中沒食子兒茶素、兒茶素和表兒茶素的含量，檢測結果如圖6 和圖7，3 種酚類物質的出峰時間分別為10.3、18.1 min 以及23.1 min。

圖6 蓮藕不同部位藕汁的酚類物質色譜圖Fig.6 Chromatograms of polyphenols in the juice samples prepared from different parts of lotus rhizome

圖7 蓮藕不同部位藕汁的酚類物質含量Fig.7 Content of polyphenols in the juice samples prepared from different parts of lotus rhizome

由圖6 和圖7 可知，藕節(jié)、藕皮和去皮藕段中均含有沒食子兒茶素、兒茶素和表兒茶素3 種酚類，沒食子兒茶素的含量明顯高于其它兩種。相對于蓮藕濕重而言，藕節(jié)的沒食子兒茶素含量為84.13 μg/g，為藕皮的2 倍、去皮藕段的5 倍。而謝君等[4]的研究發(fā)現(xiàn)去皮藕段的沒食子兒茶素含量最高，可能是由于本研究中使用勻漿機破碎細胞時，使藕節(jié)中的沒食子兒茶素大量釋放。蓮藕中含有大量水分，通過真空冷凍干燥得出去皮藕段和藕節(jié)的含水量約為85%，藕節(jié)的含水量為78.80%（圖7B）。對于干重蓮藕，藕節(jié)的多酚含量為565.14 μg/g，其含量明顯高于藕皮和去皮藕段。無論是干重還是濕重，藕節(jié)汁的多酚含量均要顯著高于藕皮和去皮藕段，此結果與研究報道[4]的結果一致。

食品加工往往涉及細胞和組織的破壞，從而引起胞內和胞外物質的釋放。釋放的內源性多酚與其他成分如淀粉、非淀粉多糖和蛋白質接觸，對食品品質產生影響[28]。通過探究藕汁的多酚含量與種類，發(fā)現(xiàn)蓮藕淀粉中的酚類物質很可能來源于勻漿時蓮藕細胞釋放的酚類物質與淀粉的相互結合，其中蓮藕中含量最高的沒食子兒茶素對其作用最大。由于藕節(jié)中的多酚含量最高，可以明顯提高蓮藕淀粉的多酚含量。

3 結論

本試驗以蓮藕淀粉和藕節(jié)蓮藕淀粉為原料，分析了蓮藕淀粉的游離酚和結合酚組成，以及藕節(jié)對蓮藕淀粉含酚量的影響。結果表明，蓮藕淀粉在乙醇保護下用NaOH 堿提結合酚，可以有效地預防淀粉發(fā)生糊化，結合酚的主要組分為沒食子兒茶素，通過乙醇保護的堿提法為研究淀粉中的結合酚提供了新的研究思路。在制作蓮藕淀粉時，蓮藕會釋放大量的酚類物質，藕節(jié)中酚類物質主要為沒食子兒茶素、兒茶素、表兒茶素，其含量分別為565.14、263.59、21.50 μg/g（干重），其中沒食子兒茶素的含量明顯高于藕皮和去皮藕段。制作蓮藕淀粉時增加藕節(jié)的含量可以明顯提高蓮藕淀粉多酚的含量。