蘇秦，陳倩玲，吳偉斌，向青青，楊成梁，喬?hào)|訪，李志剛

1.廣州市刑事科學(xué)技術(shù)研究所 法醫(yī)病理學(xué)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510442；2.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院法醫(yī)系，廣東 廣州 510080；3.南方醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510515

腦干損傷是指對(duì)中腦、腦橋或延髓造成的損傷，是顱腦損傷中最危重的類型之一，起病急，病情進(jìn)展快，預(yù)后差。腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)是維持意識(shí)的重要結(jié)構(gòu)，因此，腦干損傷后常常發(fā)生意識(shí)障礙甚至死亡。原發(fā)性腦干損傷（primary brain stem injury，PBSI）在所有記錄的顱腦損傷中約占2%，死亡率卻高達(dá)70%[1]。PBSI包括腦干橫斷、挫傷、彌漫性軸索損傷和水腫[2]。在法醫(yī)實(shí)際工作中，常遇到頭面部遭受暴力后迅速死亡的案例，尸體檢驗(yàn)（包括心傳導(dǎo)系統(tǒng)檢查）時(shí)，通常找不到或僅在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)腦干有輕微、散在的小灶性出血，這給暴力致腦干損傷死亡的診斷帶來困難[3-4]。此外，在PBSI 致死過程中，原發(fā)病灶和后續(xù)腦外傷并存，相互影響，對(duì)死因鑒定造成干擾，直接影響案件的定性，給刑事辦案帶來困難[5]。PBSI 的死因鑒定尚未建立明確、客觀的診斷依據(jù)，目前主要借助于形態(tài)學(xué)方法，結(jié)合外傷史，在排除其他死亡原因的前提下得出鑒定意見[6]。因此，PBSI 的死因鑒別診斷仍是法醫(yī)病理鑒定實(shí)踐中的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

隨著社會(huì)法律意識(shí)與證據(jù)意識(shí)的提高，法醫(yī)病理學(xué)者必須從新的切入角度來進(jìn)行PBSI 的死因鑒別診斷。代謝組學(xué)分析被運(yùn)用于死因鑒別和死亡時(shí)間鑒定中，并取得了較好的效果[7-9]。本研究擬對(duì)比PBSI與其他死因，如非腦干腦損傷致死或剪頭處死的大鼠尸體腦干代謝組的變化規(guī)律，尋找代謝標(biāo)志物，提出可用于診斷腦干損傷的生理病理學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 PBSI 大鼠模型的構(gòu)建與評(píng)價(jià)

將72 只7 周齡、體質(zhì)量約250 g 的雄性SD 大鼠（廣東至遠(yuǎn)生物醫(yī)藥科技有限公司）隨機(jī)分為PBSI組、非腦干腦損傷組和對(duì)照組（剪頭處死），每組24 只。

PBSI 組大鼠于麻醉誘導(dǎo)箱中以3%異氟烷誘導(dǎo)麻醉，至角膜反射消失后取出，2%異氟烷維持麻醉。待大鼠頭頂部備皮后進(jìn)行碘附消毒，采用改良的Marmarou 模型進(jìn)行動(dòng)物建模（圖1A）[10]，新模型舍棄了緩沖墊，以張力極小的錫箔紙保持鼠頭與身體水平，保證打擊后頭部繞矢狀面旋轉(zhuǎn)90°做角加速運(yùn)動(dòng)，更符合腦干損傷（創(chuàng)傷性軸索損傷）的損傷機(jī)制。具體步驟：沿中線切開頭皮，暴露骨膜，將不銹鋼墊片（直徑1 cm、厚2 mm）用組織膠水固定于頂骨矢狀縫中間（圖1B），隨后撤離麻醉劑，待大鼠稍微清醒后將其俯臥固定于海綿墊上，將質(zhì)量為250 g 的不銹鋼圓柱體自2 m 高度自由下落，撞擊大鼠顱頂部不銹鋼墊片使其頭部產(chǎn)生快速過屈運(yùn)動(dòng)，且圓柱體打擊后不產(chǎn)生反彈。大鼠遭到打擊后迅速進(jìn)入昏迷狀態(tài)，相繼于1 h內(nèi)死亡。對(duì)于非腦干腦損傷組大鼠，除了將不銹鋼墊片固定于額骨中間（圖1C）外，其他操作同PBSI 組，經(jīng)處理后的大鼠也相繼于1 h 內(nèi)死亡。對(duì)照組大鼠在麻醉后僅進(jìn)行備皮消毒和切開頭皮的處理，并于1 h 后剪頭處死，剪斷位置為頸椎處。

圖1 大鼠模型的構(gòu)建Fig.1 Construction of rat models

將3 組大鼠尸體全部放置在室溫條件下（溫度25～27 ℃，濕度50%～55%），并于死后6 h 從每組隨機(jī)取8 只大鼠提取腦干組織。將剩余48 只大鼠尸體轉(zhuǎn)移至0～4 ℃環(huán)境中，分別于死后1 d 和3 d 提取腦干組織，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)8 只。

為評(píng)價(jià)構(gòu)建的大鼠模型，取出大鼠全腦，沿正中矢狀面對(duì)半切開后，取一半腦干組織置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，之后以切面為包埋面進(jìn)行常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋，并將蠟塊連續(xù)切片（5 μm），分別進(jìn)行常規(guī)HE 染色和甘氨酸銀染色。

本研究涉及動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)均通過廣東至遠(yuǎn)生物醫(yī)藥科技有限公司動(dòng)物倫理學(xué)委員會(huì)的審查（審批文號(hào)：IAEC-2022022301）。

1.2 樣本收集與處理

將切取的另一半腦干組織分裝于無菌袋（4 cm×4 cm）中，經(jīng)液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中保存。每份樣本取120 mg組織進(jìn)行液氮研磨，加入120 μL 50%甲醇溶液后充分混勻，提取樣品中的代謝物?；靹蛭锍仂o置10 min 后轉(zhuǎn)移至-20 ℃條件下過夜以沉淀樣品中的蛋白質(zhì)。4 000×g離心20 min，取上清液代謝物提取液至96 孔板用于上機(jī)檢測(cè)，其中每個(gè)樣品等量取出10 μL 稀釋液進(jìn)行混合，形成質(zhì)量控制樣品，用于檢測(cè)檢驗(yàn)方法的穩(wěn)定性。

1.3 LC-MS 檢測(cè)

用UltiMate 3000 超高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）分離色譜。采用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm；英國Waters公司）反相分離，柱溫35 ℃，流速0.4 mL/min；流動(dòng)相A 為水溶液（含0.1%甲酸），流動(dòng)相B 為乙腈（含0.1%甲酸）。梯度洗脫條件設(shè)置為：0～0.5 min 5%B，0.5～7.0 min 5%B～100%B，7.0～8.0 min 100%B，8.0～8.1 min 100%B～5%B，8.1～10 min 5%B。上樣量為4 μL。

1.4 數(shù)據(jù)前處理

使用MSConvert 軟件（美國ProteoWizard 公司）將下機(jī)的原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成可讀數(shù)據(jù)mzXML 文件，再利用R 4.1.2軟件（https://www.r-project.org/）和XCMS 3.4.1 包對(duì)代謝物離子峰進(jìn)行提取和質(zhì)量控制。通過R 軟件和CAMERA 3.4.1 包以及Compound Discoverer 3.1.0 軟件（美國Thermo Fisher Scientific 公司）分別對(duì)提取到的物質(zhì)進(jìn)行加和離子分析和物質(zhì)注釋（HMDB數(shù)據(jù)庫，https://hmdb.ca），將二級(jí)質(zhì)譜信息與代謝物標(biāo)準(zhǔn)品本地?cái)?shù)據(jù)庫（杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司）進(jìn)行匹配。經(jīng)K-最近鄰（K-nearest neighbor，KNN）算法補(bǔ)充缺失值，概率商歸一化（probabilistic quotient normalization，PQN）算法對(duì)樣品數(shù)據(jù)歸一化處理，利用質(zhì)量控制樣品進(jìn)行質(zhì)量控制-魯棒樣條校正（quality control-robust spline correction，QC-RSC），去掉不穩(wěn)定代謝物。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用R 軟件MetaX 1.4.16 包進(jìn)行偏最小二乘-判別分析法（partial least square-discriminant analysis，PLS-DA），計(jì)算R2（表示模型解釋能力）和Q2（表示模型預(yù)測(cè)能力），若均高于0.5，表明模型的解釋率和預(yù)測(cè)率均較好[11]。同時(shí)利用MetaX 1.4.16 包以變量投影重要性（variable important in projection，VIP）評(píng)分≥1.0作為篩選條件篩選組間變化顯著的代謝標(biāo)志物[12]，同時(shí)進(jìn)行交叉驗(yàn)證，并繪制置換檢驗(yàn)圖。通過R 軟件VennDiagram 1.7.1包繪制韋恩圖。利用R軟件random-Forest 4.7-1 包進(jìn)行隨機(jī)森林建模，首先采用Bootstrap方法對(duì)數(shù)據(jù)集進(jìn)行抽樣，每次抽取每組總體樣本的75%作為訓(xùn)練集對(duì)樣本進(jìn)行分類，另外25%的數(shù)據(jù)（稱為袋外數(shù)據(jù)）作為測(cè)試集用于估計(jì)隨機(jī)森林的分類誤差和計(jì)算變量的重要性。隨機(jī)森林建模時(shí)將樹的個(gè)數(shù)和每棵樹包含的特征個(gè)數(shù)分別設(shè)置為500 和3。隨后利用R 軟件randomForest 4.7-1 包建立的模型對(duì)測(cè)試集進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用R 軟件pROC 1.18.0 包進(jìn)行受試者操作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲線繪制。

2 結(jié)果

2.1 PBSI 模型評(píng)估

HE 染色結(jié)果顯示：對(duì)照組大鼠額葉、腦室和腦干組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，未見明顯病理改變；非腦干腦損傷組大鼠可見全腦蛛網(wǎng)膜下腔出血，實(shí)質(zhì)內(nèi)神經(jīng)元及血管周圍間隙擴(kuò)大，側(cè)腦室和第三腦室出血，額葉實(shí)質(zhì)內(nèi)散在點(diǎn)片狀出血；PSBI 組大鼠可見程度不一的蛛網(wǎng)膜下腔出血，實(shí)質(zhì)內(nèi)神經(jīng)元及血管周圍間隙增寬，側(cè)腦室、第三腦室和第四腦室出血，延髓實(shí)質(zhì)內(nèi)見多處灶狀出血（圖2）。甘氨酸銀染色結(jié)果顯示：對(duì)照組和非腦干腦損傷組大鼠腦干組織軸索排列整齊，走行正常，而PSBI 組大鼠腦干軸索排列紊亂，彌漫性斷裂、腫脹、扭曲呈蚯蚓狀，間隙增寬（圖3）。上述結(jié)果表明，PBSI 模型構(gòu)建成功。

圖2 不同死因大鼠腦組織的病理學(xué)改變（HE 染色）Fig.2 Pathological changes of rat brain tissues with different causes of death（HE staining）

圖3 不同死因大鼠腦干組織的病理學(xué)改變（甘氨酸銀染色）Fig.3 Pathological changes of rat brain stem tissues with different causes of death（Silver staining）

2.2 不同死因大鼠腦干組織的代謝物鑒定

3 組大鼠共檢測(cè)到1 597 種代謝物，包括有機(jī)酸及其衍生物（29.34%），脂質(zhì)和類脂分子（25.55%），雜環(huán)化合物（13.08%），苯類化合物（9.17%），有機(jī)氧化物（8.19%），苯丙酸類和聚酮化合物（4.77%），核苷（酸）及其類似物（3.55%），有機(jī)氮化物（2.81%）及其他（3.55%）。

2.3 基于PLS-DA 的差異代謝物分析

PLS-DA 被用于確定區(qū)分3 個(gè)死因模型中腦干的差異代謝物，利用1 597種代謝物中能被注釋到HMDB數(shù)據(jù)庫的818 種代謝標(biāo)志物進(jìn)行分析。死后6 h，3 種死因大鼠的腦干組織PLS-DA 結(jié)果顯示，R2和Q2分別為0.94 和0.81，死后1 d 大鼠腦干組織的R2和Q2分別為0.92 和0.65，死后3 d 大鼠腦干組織的R2和Q2分別為0.92 和0.69（圖4），且同一死因的樣本緊密聚合在一起，表明同一方式處理的樣本重復(fù)性良好。在3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的樣本中，PBSI 組和對(duì)照組均能明顯分離，而PBSI組和非腦干腦損傷組僅在死后6 h能有效分離，而在死后1 d和3 d存在部分重疊。對(duì)模型的質(zhì)量進(jìn)行交叉驗(yàn)證，置換檢驗(yàn)結(jié)果顯示Q2均＜0，表明模型不存在過擬合的情況，基于此獲得的差異代謝物準(zhǔn)確（圖5）。

圖5 不同死因大鼠死后不同時(shí)間點(diǎn)腦干組織OPLS-DA 的置換檢驗(yàn)（200 次）結(jié)果Fig.5 Permutation test results（200 times）of OPLS-DA of rat brain stem tissues with different causes of death at different time points after death

同時(shí)通過計(jì)算VIP 衡量各代謝物表達(dá)模式對(duì)各組樣本分類判別的影響強(qiáng)度和解釋能力，從而輔助代謝標(biāo)志物的篩選。結(jié)果顯示，死后6 h、1 d 和3 d 大鼠腦干組織的代謝標(biāo)志物分別為285、281 和301 種。通過韋恩圖分析發(fā)現(xiàn)，死后3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)大鼠腦干組織共有的代謝標(biāo)志物為86 種（圖6）。

圖6 死后6 h、1 d 和3 d 大鼠腦干組織代謝標(biāo)志物的韋恩圖Fig.6 Venn diagram of metabolic markers in rat brain stem tissues at 6 h，1 d and 3 d after death

2.4 基于隨機(jī)森林的差異代謝物分析

為了從死后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)大鼠腦干組織共有的86種代謝標(biāo)志物中找到最具有組別區(qū)分效應(yīng)的代謝物，將72 個(gè)樣本的86 種代謝標(biāo)志物的豐度信息構(gòu)建數(shù)據(jù)集，從各組各時(shí)間點(diǎn)大鼠樣本中隨機(jī)抽取6 個(gè)樣本構(gòu)成訓(xùn)練集（共54個(gè)樣本），其余樣本構(gòu)成測(cè)試集（共18個(gè)樣本），進(jìn)行隨機(jī)森林模型構(gòu)建和預(yù)測(cè)。通過對(duì)測(cè)試集數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其準(zhǔn)確率為83.3%（圖7A，表1）。其中：對(duì)照組均預(yù)測(cè)正確；非腦干腦損傷組存在2 個(gè)預(yù)測(cè)錯(cuò)誤，其中1 個(gè)被預(yù)測(cè)成對(duì)照組，另1 個(gè)被預(yù)測(cè)成PBSI 組；PBSI 組中有1 個(gè)被錯(cuò)誤預(yù)測(cè)成非腦干腦損傷組。

表1 86 種代謝標(biāo)志物和818 種代謝標(biāo)志物進(jìn)行隨機(jī)森林建模的預(yù)測(cè)結(jié)果Tab.1 Prediction results of random forest modeling using 86 metabolic markers and 818 metabolic markers（個(gè)）

圖7 86 種代謝標(biāo)志物的隨機(jī)森林模型構(gòu)建結(jié)果Fig.7 Construction results of random forest model for 86 metabolic markers

對(duì)隨機(jī)森林中變量的重要性進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果（圖7B）顯示，占據(jù)前10 的分別為HMDB0038126［京尼平苷酸（genipinic acid，GA）］、HMDB0037386｛（S）-薄荷酮-8-硫代乙酸酯［（S）-menthone 8-thioacetate］}、HMDB0059773［S-3-氧代癸酰半胱胺（S-3-oxodecanoyl cysteamine）］、HMDB0013272［N-月桂酰甘氨酸（N-lauroylglycine）］、HMDB0029365［阿魏酰酪胺（moupinamide）］、HMDB0040551［L-α-氨基-1H-吡咯-1-己 酸（L-alpha-amino-1H-pyrrole-1-hexanoic acid）］、HMDB0029427［L-次甘氨酸A（L-hypoglycin A）］、HMDB0005199｛（R）-去甲豬毛菜堿［（R）-salsolinol］}、HMDB0013645［N，N-二甲基鞘氨醇（N，Ndimethylsphingosine）］和HMDB0001008［膽綠素（biliverdin）］。其中，與對(duì)照組和非腦干腦損傷組相比，在PBSI 組顯著上調(diào)的代謝標(biāo)志物分別為HMDB0038126（京尼平苷酸）、HMDB0013272（N-月桂酰甘氨酸）、HMDB0005199［（R）-去甲豬毛菜堿］和HMDB0013645（N，N-二甲基鞘氨醇），見圖8。

圖8 15 種代謝標(biāo)志物在不同死因大鼠腦干組織中的相對(duì)表達(dá)量Fig.8 Relative expression levels of 15 metabolic markers in the rat brain stem tissues with different causes of death

此外，為了排除PLS-DA 篩選結(jié)果對(duì)隨機(jī)森林模型構(gòu)建的影響，將72 個(gè)樣本的818 種代謝標(biāo)志物的豐度信息構(gòu)建數(shù)據(jù)集，進(jìn)行隨機(jī)森林模型構(gòu)建和預(yù)測(cè)（訓(xùn)練集為54 個(gè)樣本，測(cè)試集為18 個(gè)樣本）。模型對(duì)測(cè)試集數(shù)據(jù)的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率為88.9%（圖9A，表1）。變量的重要性排序中，占據(jù)前10 的為HMDB0038126（京尼平苷酸）、HMDB0041907［咪達(dá)普利（imidapril）］、HMDB0014843［地拉 韋啶（delavirdine）］、HMDB0040551（L-α-氨基-1H-吡咯-1-己酸）、HMDB0030814（Mammea E/BB）、HMDB0033272（dihydroclusin）、HMDB0029365（阿魏酰酪胺）、HMDB0013645（N，N-二甲基鞘氨醇）、HMDB0037386［（S）-薄荷酮-8-硫代乙酸酯］和HMDB0062769［ε-己內(nèi)酰胺（epsilon-caprolactam）］，見圖9B。其中HMDB0041907（咪達(dá)普利）、HMDB0014843（地拉韋啶）、HMDB0030814（Mammea E/BB）、HMDB0033272（dihydroclusin）和HMDB0062769（ε-己內(nèi)酰胺）均在非腦干腦損傷組中高表達(dá)（圖8），另外5 種代謝標(biāo)志物與利用PLS-DA 篩選出來的86 種代謝標(biāo)志物進(jìn)行隨機(jī)森林建模變量的重要性占據(jù)前10 的代謝標(biāo)志物重疊。

圖9 818 種代謝標(biāo)志物的隨機(jī)森林模型構(gòu)建結(jié)果Fig.9 Construction results of random forest model for 818 metabolic markers

3 討論

本研究采用LC-MS 檢測(cè)了大鼠3 種死因所致的腦干代謝組變化，基于PLS-DA 分析篩選出86 個(gè)VIP值≥1.0 的代謝標(biāo)志物或直接用818 種代謝標(biāo)志物進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，基于隨機(jī)森林算法構(gòu)建最佳的死因鑒別模型，并對(duì)這些代謝標(biāo)志物在模型中的重要程度進(jìn)行排序，最終發(fā)現(xiàn)HMDB0038126（京尼平苷酸）、HMDB0037386［（S）-薄荷酮-8-硫代乙酸酯］、HMDB0041907（咪達(dá)普利）等15 種代謝標(biāo)志物起到重要的作用。

HMDB0038126（京尼平苷酸）最早于1964 年被發(fā)現(xiàn)[13]，通常在飲料和水果中被檢測(cè)到。京尼平苷酸屬于環(huán)烯醚萜類，可有效抑制小膠質(zhì)細(xì)胞釋放一氧化氮，減少細(xì)胞中白細(xì)胞介素1β、腫瘤壞死因子α、前列腺素E2 的產(chǎn)生，從而抑制細(xì)胞炎癥、保護(hù)神經(jīng)元[14-15]。CHEN 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，京尼平苷酸可上調(diào)神經(jīng)突生長(zhǎng)標(biāo)志物，包括微管相關(guān)蛋白2（microtubule associated protein 2，MAP2）和生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43（growth associated protein 43，GAP43），從而促進(jìn)神經(jīng)突生長(zhǎng)。此外，京尼平苷酸還可以作為降壓活性成分發(fā)揮作用[17]。在PBSI 中，腦干組織損傷所引起的局部反應(yīng)主要表現(xiàn)為細(xì)胞膜破壞，活性氧類物質(zhì)和胞質(zhì)內(nèi)游離鈣增多，缺氧，化學(xué)毒害和遺傳物質(zhì)變異等幾方面，而京尼平苷酸可以保護(hù)神經(jīng)元不受氧化應(yīng)激等誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的影響，抑制細(xì)胞炎癥，促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞降解和清除異常蛋白并促進(jìn)神經(jīng)元軸突再生[18]。因此，京尼平苷酸的生物學(xué)功能與本研究觀察到的結(jié)果即PBSI 致腦干組織中出現(xiàn)京尼平苷酸上調(diào)是一致的。但由于京尼平苷酸可能是大鼠通過食物攝取進(jìn)入體內(nèi)的物質(zhì)，不屬于體內(nèi)固有的代謝產(chǎn)物，其重要性有所削弱，在后續(xù)甄別應(yīng)用中應(yīng)加以注意。

HMDB0013272（N-月桂酰甘氨酸）被發(fā)現(xiàn)可作為診斷肝硬化的代謝組學(xué)生物標(biāo)志物[19]，在肝硬化患者體內(nèi)其豐度顯著提高[20]。HMDB0005199［（R）-去甲豬毛菜堿］是一種兒茶酚異喹啉類化合物，是多巴胺神經(jīng)毒素｛N-甲基（R）-去甲豬毛菜堿［N-methyl-（R）-salsolinol］｝的前體[21]，其合成水平受腦組織中多巴胺和乙醛濃度的影響。研究[22]表明，（R）-去甲豬毛菜堿可激活蛋白激酶B-哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（protein kinase B-mammalian target of rapamycin，AktmTOR）信號(hào)通路來調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的自噬水平，從而引發(fā)神經(jīng)毒性。HMDB0013645（N，N-二甲基鞘氨醇）是一種神經(jīng)性疼痛誘導(dǎo)劑，可通過上調(diào)神經(jīng)生長(zhǎng)因子活性誘發(fā)神經(jīng)性疼痛樣行為[23]。結(jié)合本研究的結(jié)果，表明（R）-去甲豬毛菜堿和N，N-二甲基鞘氨醇的上調(diào)可能是由于PBSI 的應(yīng)激作用引起。在代謝物重要性排序前10 中還有其他代謝物，目前雖暫不清楚其在PBSI 致死過程中的具體作用，但也提示其與PBSI致死相關(guān)。

此外，本研究利用隨機(jī)森林算法進(jìn)行死因識(shí)別建模，模型準(zhǔn)確率最高達(dá)88.9%，這可能是由于每個(gè)死因組別中包含了死后6 h、1 d 和3 d 的樣本，而樣本中的代謝物水平會(huì)隨著時(shí)間的變化而發(fā)生變化。若有足夠的樣本量來進(jìn)行單個(gè)時(shí)間點(diǎn)的建模，相信預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率將有所提高。此外，兩種隨機(jī)森林模型的結(jié)果表明，基于所有代謝物建模的效果更好，這可能是由于PLS-DA 與隨機(jī)森林算法對(duì)變量的篩選過程存在差異，利用更多變量進(jìn)行隨機(jī)森林建模，可提高模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。當(dāng)然，本研究主要是基于大鼠模型，若在實(shí)際案例中，則需要使用人類尸體樣本重新建模。

綜上所述，本研究對(duì)PBSI、非腦干腦損傷和對(duì)照（剪頭處死）組死后6 h、1 d 和3 d 的大鼠腦干組織樣本進(jìn)行了代謝組學(xué)分析，基于PLS-DA 和隨機(jī)森林算法，成功建立了死因識(shí)別模型，并鑒定出與PBSI 相關(guān)的代謝標(biāo)志物——京尼平苷酸、N-月桂酰甘氨酸、（R）-去甲豬毛菜堿和N，N-二甲基鞘氨醇，為法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中腦干相關(guān)的死因鑒別提供了一定的參考。