向青青，陳立方，2，蘇秦，杜宇坤，梁沛妍，康曉東，石河，徐曲毅，趙建，劉超，，陳曉暉

1.昆明醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500；2.云南省公安廳刑事科學(xué)技術(shù)研究所，云南 昆明 650228；3.廣州市刑事科學(xué)技術(shù)研究所 法醫(yī)病理學(xué)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510442；4.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，廣東 廣州 510080；5.南方醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510515

死亡時(shí)間（postmortem interval，PMI）指檢驗(yàn)尸體時(shí)距死亡發(fā)生時(shí)的死后經(jīng)歷或間隔時(shí)間[1]，準(zhǔn)確推斷PMI 在案件偵破中具有重要作用，國(guó)內(nèi)外法醫(yī)學(xué)者一直在研究準(zhǔn)確的PMI 推斷方法。PMI 推斷的技術(shù)方法不僅包括形態(tài)學(xué)、昆蟲學(xué)、物理化學(xué)、生物化學(xué)等傳統(tǒng)手段，還包括微生物組學(xué)、代謝組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)以及轉(zhuǎn)錄組學(xué)等組學(xué)方法。這些方法雖均能為PMI 提供重要信息，但形態(tài)學(xué)、昆蟲學(xué)、生物化學(xué)和分子病理學(xué)等反映的死后時(shí)序性變化規(guī)律多局限于理想條件或模型中[2]，如法醫(yī)昆蟲學(xué)方法主要應(yīng)用于中晚期PMI 推斷，但我國(guó)較多地區(qū)缺乏研究數(shù)據(jù)影響了其應(yīng)用；生物化學(xué)方法可通過(guò)檢測(cè)死后骨髓細(xì)胞核DNA 含量來(lái)推斷晚期尸體PMI，但DNA含量隨取材部位而異且存在個(gè)體差異，還易受到疾病、損傷、死亡原因、細(xì)菌繁殖等因素的影響。因此，這些方法的適用性和準(zhǔn)確性易受到影響。

有學(xué)者結(jié)合微生物學(xué)和法醫(yī)學(xué)兩門學(xué)科的專業(yè)知識(shí)，將微生物組學(xué)分析應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)研究[3]。哺乳動(dòng)物的尸體和微生物是環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)循環(huán)的關(guān)鍵，而在不同宿主和環(huán)境中，驅(qū)動(dòng)尸體腐敗分解的各種微生物在一定程度上是相似的，故哺乳動(dòng)物尸體的腐敗分解過(guò)程可能包括一個(gè)可預(yù)測(cè)的微生物序列[4]。這為利用與尸體相關(guān)的微生物群落推斷PMI 提供了生態(tài)學(xué)依據(jù)，使利用微生物組學(xué)方法進(jìn)行PMI 推斷成為可能。已有研究使用測(cè)序技術(shù)對(duì)死后尸體樣本（皮膚、腸道等器官組織[5-14]）以及尸體相關(guān)土壤[5，7-8，11，15]的微生物進(jìn)行分析，將微生物組數(shù)據(jù)與PMI 相關(guān)聯(lián)并建立回歸模型來(lái)預(yù)測(cè)PMI?；谖⑸锝M數(shù)據(jù)建立的回歸模型在一定程度上提供了較準(zhǔn)確的PMI[5，11，13-14]以及可量化的錯(cuò)誤率[7-8，16]。因此，利用微生物群落數(shù)據(jù)進(jìn)行PMI 推斷是一種有價(jià)值的法醫(yī)學(xué)PMI 調(diào)查手段。本文就微生物群落在PMI 推斷中的技術(shù)方法、實(shí)際應(yīng)用及影響因素等方面進(jìn)行綜述，旨在為利用微生物組數(shù)據(jù)進(jìn)行法醫(yī)學(xué)調(diào)查提供新的見解和思路。

1 微生物群落在PMI推斷中的技術(shù)方法

1.1 微生物群落的檢測(cè)鑒定方法

細(xì)菌、真菌等微生物的生長(zhǎng)繁殖規(guī)律可通過(guò)人工培養(yǎng)方法進(jìn)行研究，但這種傳統(tǒng)的培養(yǎng)方式不僅對(duì)環(huán)境條件和操作技術(shù)要求高，且無(wú)法培養(yǎng)大量未知的和某些已知的菌種，還不能全面、準(zhǔn)確地解釋微生物物種多樣性及其分布與功能，但測(cè)序技術(shù)的發(fā)展打破了這一瓶頸。高通量測(cè)序（high-throughput sequencing，HTS）不需要分離和培養(yǎng)目標(biāo)微生物，可直接對(duì)與尸體相關(guān)的微生物群落進(jìn)行測(cè)序，從而獲得測(cè)序樣本的全部物種分類和豐度信息[17]。雖然高通量測(cè)序技術(shù)存在讀取DNA 長(zhǎng)度較短[18]、嚴(yán)重依賴數(shù)據(jù)儲(chǔ)存和分析能力[19]等局限性，但其在鑒定和表征微生物群落結(jié)構(gòu)特征方面的能力不斷增強(qiáng)，即使是豐度較低的目標(biāo)微生物也可通過(guò)高通量測(cè)序及其相關(guān)的生物信息學(xué)技術(shù)被檢測(cè)出來(lái)，擴(kuò)大了基于微生物的法醫(yī)學(xué)鑒定范圍。因此，高通量測(cè)序具有高通量、高精度和大規(guī)模自動(dòng)化能力等優(yōu)勢(shì)，是微生物群落應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)研究的理想、合適的分析技術(shù)，其主要通過(guò)16S rRNA、18S rRNA和內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）測(cè)序來(lái)識(shí)別或描述樣本的微生物群落組成[20]。

16S rDNA 編碼細(xì)菌核糖體RNA 的小亞基（16S rRNA），其分子大小適中、功能高度保守、序列不同位置的變異速率不同，因此，一般選擇16S rDNA 作為分子標(biāo)記進(jìn)行細(xì)菌或古菌群落結(jié)構(gòu)和功能分析[21]。與原核生物相比，16S rRNA小亞基在真菌和其他真核生物中更保守，且提供的系統(tǒng)發(fā)育信息和物種劃分能力十分有限[22]，故一般不使用16S rRNA 小亞基作為真菌群落物種水平分析的目標(biāo)。而真核藻類、真菌等真核生物群落多樣性研究常用的分子標(biāo)記是18S rDNA和ITS。所有真核生物中均有18S rRNA，18S rDNA 的保守區(qū)允許設(shè)計(jì)高度通用的引物對(duì)真核生物進(jìn)行廣泛的物種鑒定；ITS 位于18S rDNA、5.8S rDNA 與28S rDNA 之間，不編碼核糖體成分，種內(nèi)變異相對(duì)較低，能在進(jìn)化過(guò)程中承受變異，其進(jìn)化速率為18S rDNA的10 倍[23-24]。

1.2 利用微生物群落數(shù)據(jù)推斷PMI 的分析方法

有研究者利用高通量測(cè)序標(biāo)記基因（16S rRNA[7-8，13-14]、18S rRNA[5，11]或ITS[23-24]）對(duì)每個(gè)微生物類群進(jìn)行了分析，并將這些標(biāo)記基因作為預(yù)測(cè)特征通過(guò)訓(xùn)練、測(cè)試回歸模型來(lái)學(xué)習(xí)微生物組結(jié)構(gòu)與腐敗分解時(shí)間點(diǎn)之間的關(guān)系。機(jī)器學(xué)習(xí)方法在計(jì)算能力和大數(shù)據(jù)處理方面具有相當(dāng)大的優(yōu)勢(shì)，能分析大量具有巨型DNA 序列的微生物組數(shù)據(jù)集[9]，建立一個(gè)基于微生物測(cè)序數(shù)據(jù)的PMI 推斷模型。

用于建立PMI 推斷模型的機(jī)器學(xué)習(xí)算法種類較多，且各有優(yōu)勢(shì)和局限性，實(shí)際應(yīng)用時(shí)可根據(jù)數(shù)據(jù)類型和實(shí)際情況選擇合適的機(jī)器學(xué)習(xí)算法建立PMI推斷模型。有研究[7，13-14]表明，隨機(jī)森林回歸（random forest regression）可以基于不同物種尸體不同部位的皮膚樣本以及與尸體相關(guān)的土壤樣本的微生物組數(shù)據(jù)準(zhǔn)確地推斷PMI。METCALF 等[7]根據(jù)微生物數(shù)據(jù)訓(xùn)練的隨機(jī)森林回歸模型預(yù)測(cè)了PMI，在分解早期（前兩周）模型中的誤差為2～3 d。此外，他們還使用一種與土壤類型相關(guān)的細(xì)菌數(shù)據(jù)來(lái)訓(xùn)練回歸模型，且當(dāng)其預(yù)測(cè)其他類型樣本的PMI 時(shí)，對(duì)PMI 的估計(jì)仍然準(zhǔn)確。隨機(jī)森林回歸模型推測(cè)PMI，其優(yōu)點(diǎn)在于性能優(yōu)異、易于并行化計(jì)算、回歸精度較高，但其局限性是具有系統(tǒng)偏差[9]。JOHNSON 等[8]通過(guò)開發(fā)支持向量回歸（support vector regression，SVR）、K-最近鄰（K-nearest neighbor，KNN）回歸、套索回歸、隨機(jī)森林回歸和貝葉斯回歸等模型，建立了人類腐敗尸體鼻腔和耳道中微生物群落估計(jì)PMI 的算法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，精確至科和屬的完整數(shù)據(jù)集更適合訓(xùn)練回歸量，且基于KNN 回歸推斷模型的平均誤差為±55 累積日度（accumulated degree days，ADD），能推斷較長(zhǎng)的PMI，顯示出更高的準(zhǔn)確性。KNN 簡(jiǎn)單直觀、模式識(shí)別好，但對(duì)大數(shù)據(jù)集的可擴(kuò)展性較低[5，8，25]。SVR 能較好地處理高維數(shù)據(jù)，但若相關(guān)性少則性能差[16]。LIU 等[13]通過(guò)隨機(jī)森林、支持向量機(jī)（support vector machine，SVM）和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（artificial neural network，ANN）模型分別預(yù)測(cè)小鼠死后模型的PMI，將支持向量機(jī)遞歸特征消除（support vector machine-recursive feature elimination，SVM-RFE）模型、隨機(jī)森林回歸模型和ANN 模型應(yīng)用于小鼠3種器官的死后微生物數(shù)據(jù)集，并使用PMI推斷的平均絕對(duì)誤差（mean absolute error，MAE）和擬合優(yōu)度檢驗(yàn)（R2）來(lái)評(píng)估模型的性能和精度，其研究結(jié)果表明，ANN 模型結(jié)合盲腸的死后微生物數(shù)據(jù)集為最優(yōu)組合，24 h 和15 d 內(nèi)其MAE 分別為（1.5±0.8）h和（14.5±4.4）h。

機(jī)器學(xué)習(xí)算法通過(guò)綜合考察、挖掘、分析基于高通量測(cè)序技術(shù)的微生物群落多維度大數(shù)據(jù)，可評(píng)估、識(shí)別基因組數(shù)據(jù)的多變模式，建立準(zhǔn)確、高效的回歸模型，進(jìn)一步提升基于微生物群落演替估計(jì)PMI 的精確性[26]。

2 微生物群落在PMI推斷中的研究應(yīng)用

2.1 微生物時(shí)鐘

微生物時(shí)鐘是基于已知PMI 與相應(yīng)尸體樣本微生物組數(shù)據(jù)建立的回歸模型，但其存在什么樣本類型或尸體部位有最準(zhǔn)確的微生物序列、什么時(shí)間段的時(shí)鐘最準(zhǔn)確、哪些環(huán)境變量會(huì)提高模型的準(zhǔn)確性等問題[16]。為此，國(guó)內(nèi)外研究者做了大量工作，METCALF等[5]采集小鼠尸體腹腔內(nèi)樣本及頭部、腹部皮膚樣本進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)基于腹腔微生物組數(shù)據(jù)的PMI 推斷模型的MAE 最大，而基于頭部皮膚微生物組數(shù)據(jù)的PMI推斷模型的MAE 最小，相比腹腔內(nèi)樣本，皮膚樣本更能提供有用的信息來(lái)評(píng)估PMI。BELK 等[9]的研究也表明，基于微生物的PMI 推斷，與尸體相關(guān)的土壤和皮膚是較優(yōu)的樣本，比較不同位置的皮膚可以幫助確定微生物時(shí)鐘最準(zhǔn)確的取樣部位。ZHANG 等[27]采用高通量測(cè)序技術(shù)研究了埋于土壤20 cm 深處的SD 大鼠腐敗尸體的直腸、皮膚以及尸體相關(guān)土壤的微生物群落，結(jié)果表明，直腸微生物群落的變化相對(duì)緩慢，而尸體相關(guān)土壤微生物群落的演替最快，與PMI 的線性回歸擬合度最高。該研究還發(fā)現(xiàn)，與早期分解階段相比，晚期分解階段的α 多樣性較低，并且在分解后期不同部位樣本的微生物群落趨于相似，這一結(jié)果與METCALF 等[7，15，28]的研究結(jié)果相似。METCALF 等[7，14]的研究表明，與分解晚期階段相比，分解早期階段的微生物群落演替快、多樣性高，可能是最準(zhǔn)確的時(shí)間框架，并且在早期分解過(guò)程中更頻繁的采樣可以提高模型的精度。DAMANN 等[28]探究了尸體腐敗分解晚期的微生物群落變化，發(fā)現(xiàn)部分白骨化遺骸中存在與人類腸道相關(guān)的細(xì)菌，而完全白骨化遺骸的細(xì)菌組成與土壤群落特征相似。此外，ZHANG 等[27]還發(fā)現(xiàn)埋葬于土壤和暴露于空氣中的尸體，雖然氧氣、濕度和光照等環(huán)境條件不同，但在分解過(guò)程中存在相似的微生物群落演替。環(huán)境因素是微生物群落聚集的重要驅(qū)動(dòng)因素，不同埋藏條件下的死后微生物時(shí)鐘以及其與暴露于空氣中的腐敗微生物時(shí)鐘是否相同，還需進(jìn)一步研究。

2.2 利用不同類型的微生物群落進(jìn)行PMI 推斷

由于編碼細(xì)菌16S rRNA 的16S rDNA 具有良好的時(shí)鐘特性，故微生物群落研究主要集中于用細(xì)菌群落演替規(guī)律推斷PMI[6-10，12-15，29]。COBAUGH 等[15]分 析了人類腐敗尸體下土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，在自然土壤中豐度低而在腐爛過(guò)程中顯著增加的腐生細(xì)菌可成為PMI 推斷的生物標(biāo)志物。DEBRUYN等[12]反復(fù)采集自然環(huán)境條件下腐爛尸體的盲腸菌群，通過(guò)16S rDNA 擴(kuò)增子測(cè)序表征人類腸道細(xì)菌群落的死后變化，結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的推移，腸道細(xì)菌豐度顯著增加，而多樣性則顯著降低。還有大量的研究[7-9，13-14]證明細(xì)菌群落變化可用于PMI 的估計(jì)，且建立的回歸模型效果較好，如HU 等[14]從死亡5～192 h 人類尸體的闌尾和橫結(jié)腸中分別采集菌群樣本，并運(yùn)用闌尾菌群建立了一個(gè)R2為0.910、MAE 為（25.79±0.43）h 的隨機(jī)森林回歸模型，同時(shí)確定了每個(gè)樣本實(shí)際PMI 和預(yù)測(cè)PMI 之間的差異，表明可使用人類闌尾細(xì)菌群落演替估計(jì)PMI。

也有研究者探究了真核生物群落與尸體分解的關(guān)系，雖然關(guān)于真核生物群落影響尸體腐敗分解的研究較少，但其重要性不可忽視。METCALF 等[5]檢測(cè)了在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中小鼠尸體的細(xì)菌群落和真核生物群落，發(fā)現(xiàn)僅基于真核生物群落建立的PMI 推斷模型效果不亞于細(xì)菌群落。FU 等[11]研究了室內(nèi)外豬尸體分解過(guò)程中的真菌組成及其演替模式，觀察到Candida xylopsoci、子囊菌（Ascomycota sp.）和嗜熱子囊菌（Thermoascus aurantiacus）等在腐敗尸體真菌群落中占主導(dǎo)地位，該研究結(jié)果表明，可將這些特定的真菌分類群與PMI 相聯(lián)系作為推斷PMI 的指標(biāo)，尤其是在尸體嚴(yán)重腐敗的情況下，真菌具有相當(dāng)大的PMI 推斷潛力。FORGER 等[30]研究了死亡1 703 個(gè)ADD（或死亡60 d）豬尸體腐敗分解模型的真核生物群落特征，發(fā)現(xiàn)利用分類至科水平的真核生物群落數(shù)據(jù)所建立的隨機(jī)森林模型能解釋89.58%的ADD（或天）的變化，均方根誤差（root mean square error，RMSE）為177.55 個(gè)ADD（約為6 d），這一研究結(jié)果突出了真核生物群落在分解過(guò)程和PMI 推斷中的重要性。

2.3 利用微生物群落推斷水中尸體PMI

水中尸體死后淹沒時(shí)間（postmortem submersion interval，PMSI）可根據(jù)腐敗分期、尸體現(xiàn)象、昆蟲發(fā)育、理化方法、生物膜等方法進(jìn)行推斷[17]。水中尸體腐敗分解受到自身（如死者自身穿著、是否負(fù)有重物）及其所處水環(huán)境（如水文環(huán)境、生物因素）的影響[31-33]，這些因素會(huì)影響PMSI 的準(zhǔn)確推斷。而水中尸體體表形成的生物膜［由胞外聚合物（extracellular polymeric substance，EPS）包裹的有三維結(jié)構(gòu)的微生物群落］，能抵抗外界環(huán)境變化[30]，且生物膜形成過(guò)程中，微生物群落存在演替規(guī)律，生物膜結(jié)構(gòu)也由簡(jiǎn)單逐漸變復(fù)雜。生物膜的這些特性均表明生物膜與PMSI密切相關(guān)[34]，展現(xiàn)出利用水中尸體上生物膜推斷PMSI 的潛能。

BENBOW 等[6]研究夏季和冬季河流中豬尸體皮膚的細(xì)菌群落變化規(guī)律，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)季節(jié)的屬豐富度均顯著增加，不同季節(jié)的細(xì)菌群落存在顯著差異，表明探尋不同季節(jié)水中尸體的細(xì)菌群落變化規(guī)律可用于估計(jì)PMSI。隨后，LANG 等[35]使用自動(dòng)核糖體間隔基因分析技術(shù)對(duì)比兩條淡水河流中豬尸體上生物膜的細(xì)菌群落，發(fā)現(xiàn)死亡3～7 d 豬尸體皮膚固有的細(xì)菌群落轉(zhuǎn)變?yōu)橐原h(huán)境為基礎(chǔ)的生物膜細(xì)菌群落，且死亡14～17 d 豬尸體上生物膜的細(xì)菌群落存在演替，證實(shí)尸體上生物膜的細(xì)菌群落均顯示出與PMSI 相關(guān)的演替規(guī)律。KASZUBINSKI 等[36]通過(guò)高通量測(cè)序描述靜水環(huán)境中豬尸體的死后微生物群落組成變異性，確定了靜水環(huán)境中與尸體分解相關(guān)的關(guān)鍵微生物分類群，建立了R2為0.975、誤差為±3 d 的隨機(jī)森林回歸模型以估計(jì)PMSI，并確定了幾個(gè)重要分類群為未來(lái)估計(jì)PMSI 重要的指標(biāo)分類群。WANG 等[37]利用第三代全長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)檢測(cè)溺水大鼠皮膚表面的細(xì)菌群落，發(fā)現(xiàn)尸體皮膚表面的細(xì)菌有規(guī)律的演替模式，綠彎菌門（Chloroflexi）和梭桿菌門（Fusobacteriota）僅出現(xiàn)在死亡后的前7 天，可用于確定PMSI 是否超過(guò)1 周。該研究利用細(xì)菌群落數(shù)據(jù)結(jié)合尸體腐敗分解征象，將PMSI鎖定在具體的時(shí)間段內(nèi)，為利用細(xì)菌生物膜估計(jì)水中尸體的PMI 提供了參考。

3 微生物群落在PMI推斷中的影響因素

尸體腐敗分解過(guò)程中，溫度、濕度、周圍植被和土壤酸堿度等環(huán)境因素以及組織類型和昆蟲等生物因素均會(huì)影響微生物群落的演替[22]，目前的研究主要集中于探究昆蟲活動(dòng)及溫度對(duì)微生物群落演替推斷PMI 的影響。

有學(xué)者進(jìn)行了微生物-昆蟲相互作用對(duì)PMI 推斷影響的研究。CROOKS 等[38]研究了大腸桿菌和金黃色葡萄球菌對(duì)絲光綠蠅（Lucilia sericata）、紅頭麗蠅（Calliphora vicina）及反吐麗蠅（Calliphora vomitoria）定殖和生長(zhǎng)的影響，了解微生物-昆蟲相互作用以改進(jìn)最小PMI 的估計(jì)。該研究還發(fā)現(xiàn)，不同種類蒼蠅幼蟲的生長(zhǎng)速度受到不同種類飼糧（包含不同種類細(xì)菌）的影響，喂養(yǎng)含有大腸桿菌飼糧和含有混合細(xì)菌飼糧的反吐麗蠅的體質(zhì)量最大，而喂養(yǎng)含有金黃色葡萄球菌飼糧的紅頭麗蠅的體質(zhì)量最大，并指出細(xì)菌代謝活性增加對(duì)幼蟲發(fā)育的影響可能是積極的、消極的或中性的。而昆蟲活動(dòng)對(duì)微生物群落的影響，可能是在尸體分解過(guò)程中通過(guò)嗜尸性昆蟲運(yùn)輸?shù)绞w上的細(xì)菌，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)、協(xié)同等過(guò)程影響尸體上的微生物物種豐度，并且隨著時(shí)間的推移，由于昆蟲的定殖和侵蝕導(dǎo)致物種豐度下降，隨后昆蟲定殖者的幼蟲發(fā)育可能會(huì)通過(guò)在尸體上直接或間接的相互競(jìng)爭(zhēng)而破壞已建 立的 微生 物群 落[39]。WEATHERBEE 等[40]用16S 擴(kuò)增子測(cè)序表征豬尸體表面相關(guān)的、環(huán)境中嗜尸性雙翅目幼蟲內(nèi)部的以及定殖于豬尸體上的雙翅目幼蟲群的微生物組，發(fā)現(xiàn)多種蒼蠅物種在群體中的相對(duì)豐度發(fā)生了變化，群體中某些麗蠅科（Calliphoridae）物種的存在可能與微生物群落的時(shí)間變化有關(guān)，表明環(huán)境、微生物和昆蟲幼蟲之間存在顯著的相互作用。因此，在利用微生物群落信息進(jìn)行PMI 推斷時(shí)應(yīng)考慮昆蟲的存在與否，且應(yīng)將其作為未來(lái)相關(guān)研究的重要特征進(jìn)行檢驗(yàn)驗(yàn)證。

已有研究[7-9]表明，溫度是微生物分解回歸模型的重要環(huán)境特征，在同一環(huán)境中使用兩個(gè)季節(jié)的PMI模型時(shí)，預(yù)測(cè)精度優(yōu)于隨機(jī)水平。IANCU 等[41]研究寒冷季節(jié)戶外豬尸體直腸和口腔內(nèi)嗜尸性昆蟲物種和細(xì)菌群落的演替，發(fā)現(xiàn)嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）和γ 變形桿菌（Gammaproteobacteria）棲息在溫度非常低的土壤中，甚至在10 ℃下也能繁殖，還發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)嗜冷桿菌屬持續(xù)生長(zhǎng)的環(huán)境溫度與該研究調(diào)查過(guò)程中的最低溫度相對(duì)應(yīng)。為探究不同季節(jié)不同溫度下尸體腐敗過(guò)程中的嗜尸性昆蟲物種及微生物群落變化，IANCU 等[42]又研究了溫暖季節(jié)豬尸體分解過(guò)程中嗜尸性昆蟲定殖過(guò)程中細(xì)菌物種的時(shí)間演替，以確定其是否有助于估計(jì)PMI。該研究采用主成分分析方法揭示了溫暖季節(jié)實(shí)驗(yàn)中空氣溫度、土壤溫度和相對(duì)濕度對(duì)分解階段動(dòng)態(tài)的影響，結(jié)果顯示：第一主成分軸與空氣溫度和土壤溫度呈高度的直接相關(guān)，與相對(duì)濕度呈高度的負(fù)相關(guān)；第二主成分軸與空氣溫度呈負(fù)相關(guān)，與土壤溫度和相對(duì)濕度高度相關(guān)。以上研究均表明，溫度是尸體腐敗分解過(guò)程中微生物群落研究不可忽視的因素。

法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中現(xiàn)場(chǎng)實(shí)際情況復(fù)雜、影響因素不一，每種因素都可能單獨(dú)影響PMI 推斷模型的建立或多種因素產(chǎn)生聯(lián)合作用影響PMI的推斷。如METCALF[16]所指出的陸地、水生等不同環(huán)境類型，氧含量、濕度等環(huán)境變量，以及尸體衣著、死因等尸體本身相關(guān)變量，這些因素是否影響以及如何影響尸體腐敗分解過(guò)程中微生物群落的演替，都應(yīng)作為未來(lái)研究的重要參數(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)。是否可以開發(fā)一個(gè)單一的、可推廣的模型，或者建立多影響因素下的PMI 推斷模型，是未來(lái)利用微生物群落演替規(guī)律推斷PMI 的重點(diǎn)。

4 展 望

本文綜述了近年來(lái)利用微生物群落演替規(guī)律推斷PMI 的研究進(jìn)展，通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)分析技術(shù)表征微生物群落結(jié)構(gòu)和豐度變化，再結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)算法關(guān)聯(lián)死后微生物群落與PMI，并建立PMI推斷模型以便更準(zhǔn)確地推斷尸體PMI。微生物群落在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用因高通量測(cè)序數(shù)據(jù)的存儲(chǔ)與分析以及基因數(shù)據(jù)生成的進(jìn)展而得到了重大突破，與死后尸體相關(guān)的微生物群落可應(yīng)用于陸地、水中尸體的PMI 推斷，從而作為輔助證據(jù)在刑事案件的法醫(yī)學(xué)調(diào)查中扮演重要角色[43]，未來(lái)微生物組的研究可能在法醫(yī)學(xué)中應(yīng)用更廣泛。

微生物群落變化受環(huán)境因素和生物因素的影響，因此，在后續(xù)利用微生物群落演替推斷PMI 的研究中應(yīng)充分探究各因素對(duì)微生物組的動(dòng)態(tài)影響，綜合探討各影響因素的變化規(guī)律對(duì)于準(zhǔn)確關(guān)聯(lián)PMI 和微生物群落變化具有的重要意義。微生物測(cè)序過(guò)程中的不同階段均可能影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此，有必要為樣本的采集、處置和保存制定標(biāo)準(zhǔn)，還應(yīng)進(jìn)一步驗(yàn)證所有方法的靈敏度、特異性、重復(fù)性和檢測(cè)限等性能，并創(chuàng)建可靠、全面、公開可用的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫(kù)[44]。利用機(jī)器學(xué)習(xí)算法輔助推斷PMI 應(yīng)擴(kuò)大研究范圍，優(yōu)化和標(biāo)準(zhǔn)化用于微生物群落分析的機(jī)器學(xué)習(xí)算法，生成一個(gè)全面的數(shù)據(jù)集來(lái)訓(xùn)練、測(cè)試和建立具有更大樣本量的健壯模型，保證模型的普適性、有效性和可靠性，進(jìn)一步提升基于微生物群落的PMI 推斷的準(zhǔn)確性。此外，微生物組學(xué)方法推斷PMI 在研究成本和技術(shù)上要求較高，解決關(guān)于微生物組現(xiàn)有的知識(shí)、技術(shù)和數(shù)據(jù)等問題，在高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)微生物的基礎(chǔ)上，研發(fā)和篩選出低成本且操作便捷的微生物組學(xué)PMI 推斷方法勢(shì)在必行。