王 玲,王玉清,王兆芬#,姚 杰,程國棟,史發(fā)鵬,冶庚祉,黃秋麗,曹雪平,李 澤

(1.青海大學醫(yī)學院,西寧 810001;2.青海省第四人民醫(yī)院,西寧 810007)

對肺結(jié)核患者進行精準化治療需要明確痰檢陽性與陰性活動性肺結(jié)核患者的腸道菌群差異情況。為了探究青海成年痰檢陽性與陰性活動性肺結(jié)核患者的腸道菌群差異性,本研究利用16S rDNA測序技術(shù)開展相關(guān)研究。

1 對象與方法

1.1 對象

本研究依據(jù)《肺結(jié)核診斷標準(WS 288-2017)》,選取青海省第四人民醫(yī)院痰檢陽性活動性肺結(jié)核患者14例作陽性組、痰檢陰性活動性肺結(jié)核患者12例作陰性組。研究對象年齡范圍為18-85歲。痰檢陽性組與陰性組肺結(jié)核患者基本情況相似。研究方案通過青海大學醫(yī)學院倫理委員會審核。

1.2 方法

1.2.1 糞便采集

在抗結(jié)核治療前采集3～10 g糞便置-80℃冰箱保存。使用QIAamp PowerFecal DNA Pro Isolation Kit試劑盒提取細菌基因組DNA,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確定基因組DNA完整性后,使用Nanodrop 2000平臺(Thermo Fisher Scientific,美國)檢測基因組DNA質(zhì)量(濃度為20 ng/μL,總量≥500 ng,OD260/280=1.8～2.0)。

1.2.2 16S rDNA基因測序

使用PCR擴增引物對細菌總DNA中的16S rDNA基因的V3-V4區(qū)進行擴增。16S rDNA V3-V4區(qū)的擴增引物序列見表1。按建庫試劑盒說明(Illumina Inc,美國)在擴增產(chǎn)物的兩端加上barcode序列,等比例混合該產(chǎn)物后,由上海天昊生物有限公司在Illumina NovaSeq 6000平臺上測序。

1.2.3 生物信息學分析

使用QIIME2軟件的DADA2插件對數(shù)據(jù)進行質(zhì)量過濾、降噪、拼接及去嵌合體處理。使用QIIME2軟件對ASV/OTU(Amplicon sequence variant,ASV/Operational taxonomic units,OTU)序列進行分類學注釋,并計算α多樣性指數(shù)(Chao1、ACE、Shannon及Simpson指數(shù))和β多樣性指數(shù)。

1.2.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 腸道菌群差異

2.1.1 樣本測序量

26份樣本經(jīng)16S rDNA測序后,共得到2 449 062條原始序列,對其雙端序列進行質(zhì)量控制、拼接及去噪后共獲得1 771 789條高質(zhì)量序列,共生成2 341個ASV,其中痰檢陽性組與痰檢陰性組共有597個ASV,痰檢陰性組特有的ASV有775個,痰檢陽性組特有的ASV有969個,見表2。

表2 痰檢陽性組和痰檢陰性組樣本的ASV數(shù)量

2.1.2 腸道菌群多樣性與豐富度

α多樣性分析顯示,成年痰檢陰性肺結(jié)核患者與痰檢陽性肺結(jié)核患者的腸道菌群的Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)及Simpson指數(shù)無明顯統(tǒng)計學差異(P>0.05),見表3。β多樣性分析顯示,兩組樣本腸道菌群的多樣性差異無統(tǒng)計學意義,見圖1。經(jīng)PERMANOVA檢驗顯示,兩組差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

P:痰檢陽性組;N:痰檢陰性組

表3 痰檢陽性組和痰檢陰性組樣本α多樣性指數(shù)

2.2 門和屬水平上的物種組成和豐度差異

利用Silva數(shù)據(jù)庫(http://www.arb-silva.de)對獲得的代表性序列ASV進行物種注釋,采用R軟件包分別從門水平和屬水平對兩組研究對象的菌群相對豐度值進行分析。26份樣本共檢測出11個門、18個綱、26個目、56個科、140個屬。在門級別中,兩組研究對象中相對豐度含量較高的菌門是厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和疣微菌門(Verrucomicrobia)等,見表4。使用Metastats方法進行差異比較,痰檢陰性組與陽性組相比,厚壁菌門相對豐度差異無統(tǒng)計學意義(57.06% vs 47.49%,P>0.05),擬桿菌門相對豐度差異無統(tǒng)計學意義(32.10% vs 26.86%,P>0.05),見表5。在屬水平中,兩組研究對象中相對豐度含量較高的菌屬分別是擬桿菌屬(Bacteroides)、普雷沃氏菌屬(Prevotella)、糞桿菌屬(Faecalibacterium)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)和埃希氏志賀氏菌屬(Escherichia/Shigella),見表4。痰檢陰性組與陽性組相比,擬桿菌屬相對豐度值(19.02% vs 13.47%,P>0.05)、普雷沃氏菌屬相對豐度值(6.69% vs 6.5%,P>0.05)和糞桿菌屬相對豐度值(8.37% vs 4.46%,P>0.05)的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見圖2。在門和屬水平上,痰檢陽性組與陰性組的腸道菌群豐度差異存在統(tǒng)計學意義,見表6。

表4 總體樣本腸道菌群豐度前5的物種相對豐度值

表6 痰檢陰性與痰檢陽性組門和屬水平中腸道菌的相對豐度

2.3 線性判別分析結(jié)果

經(jīng)LEfSe分析,進一步篩選出2個最可能解釋陰性組與陽性組差異的腸道菌群,分別是紅球菌屬和諾卡氏菌科。痰檢陰性組與陽性組的|LDA|值在紅球菌屬(0 vs 2.530)和諾卡氏菌科(0 vs 2.431)中的差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討論

3.1 腸道菌群差異

本研究發(fā)現(xiàn),所調(diào)查的青海成年痰檢陽性肺結(jié)核患者與痰檢陰性患者的腸道菌群多樣性和豐富度差異在統(tǒng)計學上無意義。研究顯示[1],肺結(jié)核感染與腸道菌群多樣性無關(guān)聯(lián)。研究顯示[2],經(jīng)過一周和一個月治療的肺結(jié)核患者的腸道菌群多樣性與豐富度無明顯差異。

3.2 門和屬水平上的物種組成和豐度差異

腸道菌群構(gòu)成分析顯示,兩組研究對象的腸道菌群中厚壁菌門、擬桿菌門與變形菌門為三組優(yōu)勢菌門,共占總菌門數(shù)80%以上。痰檢陰性組與陽性組相比,厚壁菌門相對豐度和擬桿菌門相對豐度的差異無統(tǒng)計學意義。最近的研究結(jié)果表明,短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)中的丁酸鹽具有重要的腸道和免疫調(diào)節(jié)功能[3],而丁酸鹽主要由厚壁菌門產(chǎn)生。SCFAs通過不同的機制調(diào)節(jié)腸上皮細胞的增殖和分化,加強腸道屏障功能以及宿主代謝。SCFAs通過強化NF-κB的活化來影響促炎細胞因子(例如IL-6和TNFα)的產(chǎn)生[4]。在炎癥期間,SCFAs通過激活G蛋白偶聯(lián)受體維持免疫穩(wěn)態(tài)[5]。SCFAs在緊密連接蛋白的協(xié)同下維持腸上皮屏障的完整性[6]。同時,特異性SCFAs通過Keap1-Nrf2途徑防止氧化損傷[7]。兩組間差異菌門為迷蹤菌門,在痰檢陽性組相對豐度較高。兩組研究對象共鑒定出13種差異菌屬,其中痰檢陽性組中不動桿菌屬、叢毛單胞菌屬、凝聚桿菌屬、分支桿菌屬、紅球菌屬、梭菌屬、無氧芽孢桿菌屬、微桿菌屬及根瘤菌屬的相對豐度較高。研究顯示[8],腸道菌群中不動桿菌屬是條件致病菌,不動桿菌的毒力特性主要來源于先天免疫系統(tǒng)對其清除的逃避,導致不動桿菌數(shù)量增加,從而引發(fā)脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)——TLR4介導的敗血癥。不動桿菌屬在痰檢陽性組富集,提示痰檢陽性患者可能易受到細菌攻擊。目前,已有研究將菌群失調(diào)與感染結(jié)核分枝桿菌后的免疫損傷聯(lián)系起來,發(fā)現(xiàn)微生態(tài)平衡破壞導致結(jié)核病易感性增加。研究顯示[9],小鼠在感染結(jié)核分枝桿菌的第一周出現(xiàn)微生物群失調(diào),導致結(jié)核分枝桿菌在肺部的早期定植增加,這與此段時間內(nèi)腸道微生物群的多樣性改變有關(guān);研究顯示[10],用抗結(jié)核藥異煙肼和吡嗪酰胺治療小鼠導致的腸道微生物組變化與肺結(jié)核傳播加快有關(guān)。

3.3 線性判別

恰當?shù)纳飿酥疚锟梢暂o助肺結(jié)核的鑒定和治療。本研究發(fā)現(xiàn),紅球菌屬和諾卡氏菌科可作為區(qū)分青海成年痰檢陰性活動性肺結(jié)核患者與痰檢陽性活動性肺結(jié)核患者的潛在差異標志物。但因樣本量少,需進一步確認。

綜上所述,青海成年痰檢陽性與陰性活動性肺結(jié)核患者的腸道菌群的多樣性和豐富度無差異性,但菌群構(gòu)成差異顯著,特定紅球菌屬與諾卡氏菌科菌群可作為潛在生物標志物。