楊 依,陳 凡,馮瑞興,郝彥惠,高 悅

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)部,西寧 810001;2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院,西寧 810001)

放射性肺損傷(Radiation-induced lung injury,RILI)是胸部放射治療最常見并發(fā)癥[1],它的防治在國(guó)內(nèi)外相關(guān)領(lǐng)域是一道學(xué)術(shù)難題。因此,能夠降低RILI的發(fā)生,對(duì)提高患者的生存率和生活質(zhì)量具有積極意義。

多項(xiàng)研究表明,PI3K/Akt信號(hào)通路是RILI發(fā)生的關(guān)鍵通路并參與RILI的發(fā)生,當(dāng)接收到輻射刺激時(shí),PI3K活化,激活A(yù)kt,活化的Akt可激活下游多種信號(hào)分子[2]。通過阻斷該信號(hào)通路,抑制PI3K、Akt磷酸化,抑制該通路中各分子的表達(dá),可減輕肺損傷[3,4]。p21蛋白屬于PI3K家族,是PI3K/Akt信號(hào)通路下游的效應(yīng)蛋白[5]。LY294002是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中廣泛使用的PI3K/Akt信號(hào)通路抑制劑,能夠抑制PI3K、Akt的磷酸化,從而阻礙通路的激活[6]。在高原環(huán)境下,有關(guān)通過PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)控p21對(duì)RILI的防護(hù)作用未見報(bào)道。

本研究基于小鼠RILI模型,在抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的基礎(chǔ)上,探討通過PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)控p21對(duì)RILI的防護(hù)作用,為臨床防治RILI提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

56只C57BL/6小鼠,SPF級(jí),6～8周齡,體質(zhì)量18～20 g,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,許可證號(hào)為SCXK(京)2021-0006。在青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房飼養(yǎng),溫度為20℃,濕度為50%～60%,所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序遵守國(guó)家動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理的政策法規(guī)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理福利原則。

1.1.2 主要試劑及儀器

醫(yī)用電子直線加速器(23EX,美國(guó)Varian醫(yī)療系統(tǒng)公司),PI3K抑制劑LY294002(HY-10108,美國(guó)MCE公司),PI3K抗體(YM3504,美國(guó)Immunoway公司),p-Akt抗體(YP0006,美國(guó)Immunoway公司),p21抗體(Bs-55160R,北京博奧森有限公司),高速冷凍離心機(jī)(MiCrofuge 22R,美國(guó)Beckman公司),石蠟包埋機(jī)(Arcadia H,德國(guó)Leica公司),石蠟切片機(jī)(RM2245,德國(guó)Leica公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及給藥方法

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d,將56只小鼠均分為7組:對(duì)照組、10Gy組、10Gy+LY294002組、15Gy組、15Gy+LY294002組、20Gy組、20Gy+LY294002組。根據(jù)文獻(xiàn)[7]所示方法使用LY294002。

1.2.2 照射方法

將麻醉小鼠固定于特制固定板上,采用醫(yī)用電子直線加速器照射胸部(6MV-X線,單次胸部劑量分別為10、15、20 Gy,劑量率為300 cGy/min,源皮距為100 cm)。小鼠頭部和腹部用多葉光柵遮擋。

1.2.3 HE染色方法

將肺組織從4%多聚甲醛中取出行常規(guī)操作。

1.2.4 IHC方法

取肺組織以常規(guī)方法制作切片。染色的陽性細(xì)胞呈棕黃色或深褐色。

1.2.5 RT-PCR方法

采用Trizol法從小鼠肺組織中提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,根據(jù)SYBR PCR試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)采用兩步法,第一步:在95℃條件下預(yù)變性30 s,循環(huán)1次;第二步:在95℃條件下預(yù)變性10 s,在60℃條件下預(yù)變性30 s,循環(huán)40次。p21上游引物為5′-CAGCTCAGGACTGGAAGG-3′,下游引物為5′-TCCGGAGGGTCTCGTAAGAT-3′,GAPDH上游引物為5′-TGATGGGTGTGAACGAG-3′,下游引物為5′-GGTGTCAGGTACGGTAGTGA-3′,以GAPDH為內(nèi)參,用2-△△Ct法計(jì)算p21mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.6 Western Blot方法

取冷凍的肺組織樣本提取組織蛋白,經(jīng)轉(zhuǎn)膜封閉后依序加入一抗(p21、PI3K、p-Akt)和二抗后曝光顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠體質(zhì)量變化情況

對(duì)照組體質(zhì)量增加明顯;與對(duì)照組比,各單純照射組小鼠體質(zhì)量隨劑量增加明顯減輕,P<0.05;與15Gy、20Gy組比,15Gy+LY294002、20Gy+LY294002組體質(zhì)量增加,P<0.05。(表1)

表1 各組小鼠的體質(zhì)量

2.2 小鼠肺組織病理變化情況

HE染色切片顯示,對(duì)照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰,肺泡形態(tài)正常,肺泡壁薄;10Gy組可見局部少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)及異型細(xì)胞,肺泡間隔增寬不明顯;10Gy+LY294002組可見炎細(xì)胞浸潤(rùn)減少(較10Gy組);15Gy組可見炎細(xì)胞浸潤(rùn)(明顯),少量細(xì)胞水腫,部分細(xì)胞核深染,還發(fā)現(xiàn)異型細(xì)胞(明顯);20Gy組可見肺泡上皮細(xì)胞增生、肺泡間隔增寬、細(xì)胞核深染、炎細(xì)胞浸潤(rùn);15Gy+LY294002、20Gy+LY294002組小鼠的RILI較15Gy、20Gy組減輕。 (圖1)

圖1 各組小鼠肺組織HE染色圖(HE,×100)

2.3 小鼠肺組織p21陽性細(xì)胞表達(dá)情況

IHC染色切片顯示,p21在正常肺組織中幾乎無表達(dá);與對(duì)照組相比,各單純照射組小鼠肺組織p21陽性細(xì)胞隨劑量增加而逐漸增多;與單純照射組相比,同劑量照射+LY294002組小鼠肺組織p21陽性細(xì)胞隨劑量增加而相對(duì)減少。(圖2)

圖2 各組小鼠肺組織IHC染色圖(×200)

2.4 小鼠肺組織p21吸光度和p21mRNA表達(dá)的情況

與對(duì)照組相比,各單純照射組小鼠肺組織p21吸光度值較高、p21mRNA相對(duì)表達(dá)量較高;與單純照射組相比,同劑量照射+LY294002組小鼠肺組織p21吸光度值較低、p21mRNA相對(duì)表達(dá)量較低。(表2)

表2 各組小鼠肺組織p21吸光度和p21mRNA表達(dá)量

2.5 小鼠肺組織蛋白表達(dá)情況

與對(duì)照組相比,各單純照射組小鼠肺組織p21、PI3K、p-Akt相對(duì)蛋白表達(dá)量均為高表達(dá),P<0.05;與單純照射組相比,同劑量照射+LY294002組小鼠肺組織p21相對(duì)蛋白表達(dá)量均為低表達(dá),P<0.05;同劑量照射+LY294002組小鼠肺組織PI3K相對(duì)蛋白表達(dá)量均為低表達(dá),P<0.05;同劑量照射+LY294002組小鼠肺組織p-Akt相對(duì)蛋白表達(dá)量均為低表達(dá),P<0.05。(表3,圖3)

圖3 各組小鼠肺組織相對(duì)蛋白表達(dá)量的電泳圖

表3 各組小鼠肺組織p21、PI3K、p-Akt相對(duì)蛋白表達(dá)量

3 討論

早期發(fā)現(xiàn),PI3K/Akt信號(hào)通路抑制導(dǎo)致許多惡性腫瘤被異常激活[8,9]。PI3K/Akt信號(hào)通路在肺癌細(xì)胞增殖中起重要作用[10]。研究發(fā)現(xiàn),PI3K/Akt信號(hào)通路與相關(guān)大鼠RILI機(jī)制有關(guān)(PI3K、Akt磷酸化,介導(dǎo)損傷的肺細(xì)胞凋亡)[11],與本研究結(jié)果一致。Tsoyi[12]等研究發(fā)現(xiàn),通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)通路,可抑制成纖維細(xì)胞活化并減輕輻射誘導(dǎo)的肺纖維化。肺組織炎癥因子可激活PI3K/Akt信號(hào)通路,可促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肺間質(zhì)細(xì)胞,表明PI3K/Akt信號(hào)通路參與放射性肺纖維化的形成[13]。而且PI3K抑制劑還可以克服肺癌放射治療中的耐藥性,因此準(zhǔn)確識(shí)別受益于PI3K治療的患者群體是研究的重點(diǎn)[14]。研究發(fā)現(xiàn),由LY294002干預(yù)的衰老細(xì)胞中的PI3K、p-Akt、p21表達(dá)水平明顯降低。PI3K-Akt是上調(diào)p21的激酶,參與細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)的激活[15],與本研究結(jié)果一致。單純照射組p21蛋白表達(dá)水平升高,而加入PI3K/Akt信號(hào)通路抑制劑后表達(dá)降低,小鼠放射損傷程度減輕。本實(shí)驗(yàn)采用小鼠全肺單次照射10、15、20 Gy的X射線,建立RILI模型[16-18]。單純照射組隨著劑量增加,小鼠肺組織出現(xiàn)不同程度的損傷,而同劑量照射+LY294002組小鼠的肺組織損傷相對(duì)較輕。表明抑制PI3K/Akt信號(hào)通路下游p21蛋白表達(dá)水平能夠有效預(yù)防或減輕RILI的發(fā)生。

綜上所述,通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路可降低小鼠肺組織p21表達(dá),對(duì)小鼠RILI具有防護(hù)作用。