尹鳳嬌,徐 凱,陳佳昕,仁增卓嘎,乜 茹,冶賡搏,龐明泉,樊海寧,曹得萍,王海久*,王志鑫

(1.青海大學(xué)附屬醫(yī)院 肝膽胰外科,西寧 810001;2.青海省包蟲(chóng)病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西寧 810001;3.桂林醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教研室,桂林 541199)

DNA損傷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子4(DNA damage-inducible transcript 4,DDIT4)是一種與代謝、免疫等相關(guān)的蛋白,在損傷等應(yīng)激條件下高表達(dá)。在前列腺癌、卵巢癌等眾多惡性腫瘤的表達(dá)中有顯著性差異,且在抗腫瘤治療中起著“保護(hù)傘”作用[1-3]。肝多房棘球蚴病病灶邊界不清楚,囊液持續(xù)外滲,刺激周圍肝細(xì)胞,導(dǎo)致正常肝細(xì)胞損傷。徐凱[4]等研究發(fā)現(xiàn),正常小鼠肝細(xì)胞經(jīng)多房棘球蚴囊液(HCF)干預(yù)后,細(xì)胞活性明顯受到抑制,且DDIT4在凋亡、自噬相關(guān)蛋白中高表達(dá)。本研究觀測(cè)HCF對(duì)沉默DDIT4后小鼠肝細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系

正常小鼠肝細(xì)胞株(AML-12)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所,保存于青海大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 小鼠

BALB/c小鼠購(gòu)自南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng),動(dòng)物合格證號(hào):No.201930977。

1.1.3 主要試劑和儀器

RIPA裂解液、0.25%胰蛋白酶消化液(不含EDTA)、嘌呤霉素(puromycin)均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司,DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司,CCK-8試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司,DDIT4一抗、Beclin-1一抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司,Caspase-3一抗、LC3A/B一抗購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司,β-actin抗體、HRP山羊抗兔二抗購(gòu)自武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司,RNA Simple總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司,DDIT4引物、18S引物購(gòu)自華大基因公司,LV-Ddit4-RNAi、陰性對(duì)照病毒購(gòu)自吉?jiǎng)P基因公司。生物倒置顯微鏡系統(tǒng)購(gòu)自日本OLYMPUS公司,熒光化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)GE公司,酶標(biāo)儀購(gòu)自德國(guó)Tecan公司,電泳儀購(gòu)自BIO RAD公司,PCR基因擴(kuò)增儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司,普通高速離心機(jī)購(gòu)自Sigma公司,Cytation5細(xì)胞成像微孔板檢測(cè)系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)BioTek公司,實(shí)時(shí)熒光PCR儀購(gòu)自Roche公司,透射電子顯微鏡購(gòu)自HITACHI公司。

1.2 方法

1.2.1 囊液收集及處理

將造模小鼠采用頸椎脫臼法處死,以無(wú)菌方式打開(kāi)腹腔并小心分離多房棘球蚴囊泡(用PBS反復(fù)多次清洗),并將囊泡放至20 mL無(wú)菌注射器內(nèi),以擠壓方式分離囊液并離心(3200 r/min,7 min),用濾器(0.22 μm)過(guò)濾離心囊液后分裝,并存于-80℃冰箱備用。

1.2.2 慢病毒LV-Ddit4-RNAi轉(zhuǎn)染

小鼠肝細(xì)胞按規(guī)定密度(4×104個(gè)/mL)接種于六孔板中。24 h后當(dāng)細(xì)胞覆蓋率為20%～30%時(shí)進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染。根據(jù)《慢病毒使用操作手冊(cè)》要求,每組細(xì)胞分別加入LV-Ddit4-RNAi 1、LV-Ddit4-RNAi 2、LV-Ddit4-RNAi 3和LV-Ddit4-NC病毒,以及相應(yīng)的轉(zhuǎn)染增強(qiáng)液置培養(yǎng)箱(37℃,5% CO2)培養(yǎng)。用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定細(xì)胞株,并進(jìn)行RT-qPCR及Western Blot鑒定,檢測(cè)各組DDIT4基因mRNA和蛋白表達(dá)量,并確定合適的慢病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.3 小鼠肝細(xì)胞DDIT4蛋白的表達(dá)量檢測(cè)

分別收集經(jīng)HCF作用后的LV-Ddit4-RNAi 1、LV-Ddit4-RNAi 2、LV-Ddit4-RNAi 3和LV-Ddit4-NC細(xì)胞,細(xì)胞用含有PMSF蛋白酶抑制劑的Ripa緩沖液做冰上裂解(30 min)、離心(4℃,12 000 r/min,10 min)后取上清液后用5×蛋白上樣緩沖液稀釋并水浴(95℃,10 min),通過(guò)BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白樣品濃度。取30 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳。結(jié)束后轉(zhuǎn)移至0.2 μm PVDF膜上,用5%脫脂奶粉封閉(室溫,1 h)。將膜與DDIT4(1:1000)、β-actin(1:1500)一抗一同孵育(4 ℃,過(guò)夜)。第二天對(duì)稀釋(1:5 000)的用HRP標(biāo)記的二抗進(jìn)行孵育(室溫,1 h)。使用增強(qiáng)型ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)進(jìn)行印記檢測(cè)(以β-actin為內(nèi)參)。使用Image J軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度分析。

1.2.4 小鼠肝細(xì)胞DDIT4的表達(dá)量檢測(cè)

直接提取細(xì)胞總RNA,將適量的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,采用RT-qPCR法檢測(cè)4組DDIT4的mRNA表達(dá)量,篩選慢病毒。將4個(gè)樣品用DDIT4基因和內(nèi)參基因引物擴(kuò)增,見(jiàn)表1。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次。采用20 μL體系建立擴(kuò)增體系。采用兩步法PCR反應(yīng)程序進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。PCR結(jié)果分析由ABI Q5 PCR儀完成。

表1 DDIT4、18S引物序列

1.2.5 HCF對(duì)沉默DDIT4后小鼠肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響

收集轉(zhuǎn)染后的小鼠肝細(xì)胞接種于6孔板(3×105個(gè)/孔),24 h后更換培養(yǎng)基并加入濃度為0.0、0.4、0.8 mg/mL的HCF,分別與細(xì)胞培養(yǎng)48 h。

1.2.6 HCF對(duì)沉默后小鼠肝細(xì)胞活性的影響

收集轉(zhuǎn)染后的小鼠肝細(xì)胞接種于96孔板(1×104個(gè)/孔),24 h后更換培養(yǎng)基并加入濃度為0.0、0.4、0.8 mg/mL的HCF,處理48 h后,每孔加入CCK-8試劑孵育。

1.2.7 凋亡自噬相關(guān)蛋白水平檢測(cè)

同1.2.3所示方法。

1.2.8 細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)觀察

收集轉(zhuǎn)染后的小鼠肝細(xì)胞,在培養(yǎng)皿(35 mm)接種細(xì)胞(1×106個(gè)/皿),24 h后更換培養(yǎng)基,并加入不同濃度的HCF培養(yǎng)48 h。從EP管中收獲培養(yǎng)48 h的細(xì)胞,用PBS洗滌2次;用2.5%戊二醛固定(過(guò)夜)后以1%鋨酸固定(避光,室溫)2 h,再用不同濃度梯度(30%、50%、70%、80%、95%、100%)乙醇進(jìn)行脫水,然后浸透、包埋、聚合、切片、拍照,在電鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 慢病毒轉(zhuǎn)染效率

2.1.1 細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)染情況

使用Image J軟件檢測(cè)熒光細(xì)胞所占全視野細(xì)胞的百分比達(dá)80%以上,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如圖1。

A為明場(chǎng)鏡下圖(×100);B為同一視野熒光圖(×100),綠色熒光表明慢病毒已成功轉(zhuǎn)染細(xì)胞

2.1.2 經(jīng)HCF作用后的慢病毒轉(zhuǎn)染小鼠肝細(xì)胞的DDIT4蛋白表達(dá)量

經(jīng)HCF作用后慢病毒轉(zhuǎn)染小鼠肝細(xì)胞的DDIT4蛋白表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果顯示,LV-Ddit4-RNAi 1、LV-Ddit4-RNAi 2、LV-Ddit4-RNAi 3組分別與LV-Ddit4-NC組比較,前三組DDIT4蛋白含量顯著下降,LV-Ddit4-RNAi 3組尤為顯著(P<0.01),見(jiàn)圖2、表2。因此最終選用LV-Ddit4-RNAi 3組細(xì)胞做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 小鼠肝細(xì)胞DDIT4蛋白表達(dá)圖

表2 小鼠肝細(xì)胞DDIT4蛋白表達(dá)結(jié)果

2.1.3 經(jīng)HCF作用后慢病毒轉(zhuǎn)染小鼠肝細(xì)胞的DDIT4基因表達(dá)量

經(jīng)HCF作用后慢病毒轉(zhuǎn)染小鼠肝細(xì)胞的DDIT4基因表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果顯示,LV-Ddit4-RNAi 1、LV-Ddit4-RNAi 2、LV-Ddit4-RNAi 3組分別與LV-Ddit4-NC組比較,前三組DDIT4基因表達(dá)水平均顯著下降,LV-Ddit4-RNAi 3組尤為顯著(P<0.01),見(jiàn)表3。

表3 小鼠肝細(xì)胞DDIT4的表達(dá)結(jié)果

2.2 HCF對(duì)沉默后AML-12細(xì)胞形態(tài)的影響

與HCF共培養(yǎng)48 h后,con組LV-Ddit4-NC和LV-Ddit4-RNAi組細(xì)胞形態(tài)多呈橢圓形或者圓形,細(xì)胞生長(zhǎng)密度正常,貼壁良好,連接成島狀;而LV-Ddit4-RNAi組分別經(jīng)過(guò)0.4、0.8 mg/mL HCF處理后細(xì)胞數(shù)及狀態(tài)明顯好于LV-Ddit4-NC 0.4、0.8 mg/mL組,多數(shù)細(xì)胞形態(tài)較正常,且貼壁狀態(tài)良好,可見(jiàn)少部分細(xì)胞漂浮于培養(yǎng)基中,見(jiàn)圖3。

圖3 48 h后各組細(xì)胞形態(tài)鏡下圖(×100)

2.3 AML-12細(xì)胞活力

與LV-Ddit4-NC 0.4、0.8 mg/mL組細(xì)胞比較,LV-Ddit4-RNAi 0.4、0.8 mg/mL組細(xì)胞OD值明顯上升,增殖率也隨之增加(P<0.01);與HCF共培養(yǎng)48 h后,沉默DDIT4組細(xì)胞形態(tài)接近正常AML-12細(xì)胞形態(tài),多呈橢圓形或者圓形,且細(xì)胞生長(zhǎng)密度較LV-Ddit4-NC組明顯為高。見(jiàn)表4。

表4 HCF對(duì)各組AML-12細(xì)胞活力的影響

2.4 凋亡自噬相關(guān)蛋白水平

與LV-Ddit4-NC con組比較,LV-Ddit4-NC 0.4、0.8mg/mL HCF組Beclin-1、LC3-II、Caspase-3蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01);與LV-Ddit4-RNAi con組比較,LV-Ddit4-RNAi 0.4 mg/mL HCF組的Beclin-1表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),LV-Ddit4-RNAi 0.8 mg/mL HCF組的Beclin-1表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與LV-Ddit4-RNAi con組相比,LV-Ddit4-RNAi 0.8 mg/mL HCF組的Caspase-3表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與LV-Ddit4-NC 0.4、0.8 mg/mL HCF組比較,LV-Ddit4-RNAi 0.4、0.8 mg/mL HCF組的LC3-II表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05),Beclin-1、Caspase-3蛋白表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與LV-Ddit4-RNAi con組比較,LV-Ddit4-RNAi 0.4、0.8 mg/mL組的LC3-II表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖4、表5。

圖4 Caspase-3、Beclin-1、LC3蛋白水平表達(dá)圖

表5 凋亡自噬相關(guān)蛋白水平

2.5 細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)

LV-Ddit-4-NC和LV-Ddit4-RNAi組的透射電鏡圖顯示,胞質(zhì)未見(jiàn)明顯損傷,線粒體基質(zhì)較均勻,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未見(jiàn)明顯擴(kuò)張,自噬水平低,見(jiàn)圖5a-d;LV-Ddit4-RNAi 0.4、0.8 mg/mL組細(xì)胞損傷較輕,胞質(zhì)內(nèi)存在較多脂滴,自噬數(shù)量增多,見(jiàn)圖5e-h;LV-Ddit4-NC 0.4、0.8 mg/mL組細(xì)胞損傷最嚴(yán)重,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)嚴(yán)重?cái)U(kuò)張,胞質(zhì)內(nèi)存在大量脂滴,可見(jiàn)大量自噬結(jié)構(gòu),見(jiàn)圖5i-l。

圖5 各組AML-12細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)圖

3 討論

DDIT4是位于染色體10(10q22.1)上,由232個(gè)氨基酸組成的一種蛋白質(zhì)。有研究表明,DDIT4能發(fā)揮廣泛的細(xì)胞及生物學(xué)功能[5-6]。DNA損傷轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)在多種細(xì)胞中出現(xiàn),正常情況下DDIT4均呈低表達(dá),且半衰期短,很難被檢測(cè)出來(lái)[7]。

在寄生蟲(chóng)感染中,由于蟲(chóng)體寄生誘發(fā)了宿主細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)并啟動(dòng)未折疊蛋白反應(yīng)。多種應(yīng)激條件下,自噬水平會(huì)顯著上升[8]。

Hou等[9]研究發(fā)現(xiàn),沉默DDIT4后可減輕LPS誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。Su等[10]研究得出,降低DDIT4表達(dá)水平可減輕蛛網(wǎng)膜下腔出血患者腦脊液中代謝產(chǎn)物所引起的原代皮層神經(jīng)元凋亡。DDIT4也可密切參與對(duì)細(xì)胞自噬的調(diào)控作用[11-12]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[4],HCF對(duì)正常小鼠肝細(xì)胞有損傷作用。國(guó)內(nèi)外眾多研究發(fā)現(xiàn),DDIT4可能與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬密切相關(guān),故本研究篩選LV-Ddit4-RNAi 3做相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

本研究觀測(cè)HCF對(duì)沉默DDIT4后小鼠肝細(xì)胞生物學(xué)功能的影響發(fā)現(xiàn):1.AML-12細(xì)胞增殖;2.AML-12細(xì)胞凋亡、自噬數(shù)量減少。