王迦樂,黃登亮,張耀剛,姜 軍

(1.青海大學附屬醫(yī)院中心實驗室,西寧 810001;2.青海大學研究生院,西寧 810016;3.青海大學附屬醫(yī)院腫瘤科,西寧 810001)

乳酸是腫瘤重要的代謝產(chǎn)物,低氧又是腫瘤的普遍特征,兩者之間的相互作用是否會對腫瘤細胞線粒體功能產(chǎn)生影響?本研究通過相關(guān)研究初步探討乳酸對人非小細胞肺癌細胞線粒體自噬的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株

人正常肺上皮細胞(BEAS-2B)、人非小細胞肺癌細胞(A549)購自中國科學院細胞庫。

1.1.2 試劑與儀器

乳酸(Sigma-Aldrich公司,L6402型),乳酸檢測試劑盒(Solarbio公司,A019-2型),二甲基亞砜DMSO(Solarbio公司,D8370型),胎牛血清(Biological Industries公司,04-001-1ACS型),0.1%胰酶(Gibco公司,27250018型),1640培養(yǎng)基(Gibco公司,23400-021型),FastStart Universal SYBR GreenMaster(Roche公司,04913914001型),MitoTracker?Deep Red FM線粒體深紅色熒光探針(Thermor Frsher Scientific公司,M2247型),CytoPainter LysoView Blue溶酶體染料(abcam公司,ab176825型),LC3B抗體(abcam公司,ab192890型),β-Actin 抗體(boster公司,BMO627型),TOM20抗體(abcam公司,ab56783型),HSP60抗體(Cell Signaling Technology公司,12165S型)。細胞成像微孔板檢測系統(tǒng)(BioTek公司,Cytation5型),實時熒光定量PCR儀(ROCHE公司,ROCHE Light Cycler 480Ⅱ型),超微量核酸蛋白濃度測定儀(Nanodrop公司,Nanodrop 2000C型)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與分組

將BEAS-2B、A549細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中,置細胞培養(yǎng)箱(5%CO2,37℃,95%濕度)培養(yǎng),2～3 d更換培養(yǎng)基,細胞匯合度達到80%左右時用0.1%胰酶消化傳代,取對數(shù)生長期的細胞接種于12孔板或6孔板。將BEAS-2B、A549細胞分為常氧組(21%O2,5%CO2,37℃)、低氧組(1%O2,5%CO2,37℃)。將乳酸處理過的BEAS-2B、A549細胞分為常氧組(Lac-0、5、10 mM)、低氧組(Lac-0、5、10 mM)。

1.2.2 乳酸測定

將BEAS-2B、A549細胞接種于12孔板中,每孔細胞數(shù)為5×104個,在常氧和低氧條件下孵育24 h。根據(jù)試劑盒說明書檢測每個細胞培養(yǎng)上清液中的乳酸濃度。

1.2.3 線粒體DNA拷貝數(shù)分析

使用酚-氯仿法提取細胞樣本的DNA,測定DNA濃度。將待測樣品稀釋為5 ng/μL?？偡磻w系:DNA 2 μL,2×SYBR Green 7.5 μL,上下游引物(10 μM)共3 μL,ddH2O 2.5 μL。使用實時熒光定量PCR儀進行待測樣品擴增,擴增條件:預變性(95℃)10 min,變性(95℃)15 s,退火(60℃)延伸34 s,共40個循環(huán)。核DNA RPL13A基因上游引物:5′- CGCCCTACGACAAGAAAAAG-3′,下游引物:5′- CCGTAGCCTCATGAGCTGTT-3′;線粒體DNA mtCO1基因上游引物:5′-CAGGAGTAGGAGAGAGGGAGGTAAG-3′,下游引物:5′-TACCCATCATAATCGGAGGCTTTGG-3′。采用2-ΔΔCT 法分析mtCO1基因水平。

1.2.4 自噬相關(guān)蛋白LC3B、HSP60、TOM20表達檢測

收集低氧組和常氧組BEAS-2B、A549細胞,分別加入200 μL RIPA細胞裂解液經(jīng)超聲波細胞粉碎儀破碎、離心后提取蛋白,并用BCA法測定蛋白濃度,并將等量的蛋白(15 μg)加載到SDS-PAGE凝膠中進行電泳分離蛋白后,轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,用10%的脫脂奶粉封閉150 min后,用PBST緩沖液洗去膜表面多余的脫脂奶粉,按照不同目的蛋白大小將膜切開并放入封口膜中,分別加入3 mL一抗孵育(4℃,過夜,β-Actin 1:1000,LC3B 1:1000,HSP60 1:1000,TOM20 1:4000)。用 PBST緩沖液洗膜后,加入3 mL山羊抗兔或山羊抗鼠 IgG(1:10000)孵育(室溫)1 h后,用PBST緩沖液洗膜30 min,加入適量超敏ECL化學發(fā)光試劑,放入暗匣中曝光、顯影。應用Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值,以β-Actin蛋白為內(nèi)參照,對以上目的蛋白進行灰度值分析,目的蛋白相對表達量=目的蛋白A值/內(nèi)參照A值。

1.2.5 線粒體及溶酶體熒光強度共定位情況檢測

將BEAS-2B、A549細胞接種于96孔板中,每種細胞接種12個孔(每孔接種100 μL細胞懸液,含4000個細胞),分設(shè)0、5、10 mM乳酸組;細胞貼壁后加乳酸,24 h后,棄原有培養(yǎng)基,加入100 μL含Mito tracker(線粒體染料)、CytoPainter LysoBlue(溶酶體染料)的培養(yǎng)基,Mito tracker的工作濃度為100 nM,CytoPainter LysoBlue的工作濃度為50 nM。染色(37℃,30 min)后棄含染料的培養(yǎng)基,加入100 μL PBS洗滌一次,再加入100 μL PBS,通過Cytation5酶標儀檢測線粒體和溶酶體平均熒光強度及共定位情況。Mito tracker、CytoPainter LysoBlue檢測分別使用Texas Red和DAPI通道。

1.2.6 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 低氧條件對BEAS-2B、A549細胞內(nèi)乳酸生成的影響

在常氧和低氧(1% O2)條件下培養(yǎng)BEAS-2B、A549細胞24 h,檢測其培養(yǎng)上清液中的乳酸含量。結(jié)果顯示,低氧培養(yǎng)條件下,BEAS-2B、A549細胞內(nèi)的乳酸生成明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(表1)。

表1 常氧和低氧條件下培養(yǎng)的BEAS-2B、A549細胞內(nèi)的乳酸生成情況

2.2 低氧和乳酸對線粒體DNA拷貝數(shù)的影響

相比于常氧培養(yǎng)組,低氧條件下A549細胞的線粒體DNA拷貝數(shù)增加,BEAS-2B細胞線粒體DNA拷貝數(shù)減少,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.0001)。由于低氧能使細胞內(nèi)的乳酸含量升高,故使用外源乳酸干預A549細胞分析乳酸對線粒體DNA拷貝數(shù)的影響。結(jié)果顯示,在常氧和低氧培養(yǎng)條件下,隨著乳酸濃度的進一步增加,會引起A549細胞線粒體DNA拷貝數(shù)減少,BEAS-2B細胞線粒體DNA拷貝數(shù)增加。以上結(jié)果提示,外源乳酸干預能改變細胞線粒體DNA拷貝數(shù),且對BEAS-2B、A549細胞的影響程度不同(表2)。

表2 常氧和低氧條件下經(jīng)不同乳酸濃度處理的BEAS-2B、A549細胞線粒體拷貝數(shù)

2.3 外源乳酸對線粒體自噬的影響

前述結(jié)果顯示,外源乳酸干預的BEAS-2B、A549細胞線粒體拷貝數(shù)發(fā)生改變,在此基礎(chǔ)上分析乳酸對線粒體自噬的影響,以探索線粒體DNA拷貝數(shù)變化的原因。結(jié)果顯示,與對照組相比,在常氧和低氧培養(yǎng)條件下用乳酸干預的BEAS-2B、A549細胞中蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ比值增加(圖1、2和表3),提示經(jīng)乳酸干預后細胞自噬功能增強。進一步分析線粒體熱休克蛋白(HSP60)和線粒體外膜蛋白(TOM20)的蛋白表達水平發(fā)現(xiàn),經(jīng)乳酸干預后,A549細胞中的HSP60、TOM20蛋白表達水平均降低(圖1),可能是線粒體自噬增強引起細胞內(nèi)線粒體含量減少所致;而在常氧和低氧條件下,乳酸干預的BEAS-2B細胞中的HSP60、TOM20蛋白表達水平未見明顯改變(圖2)。

圖1 在常氧和低氧條件下經(jīng)不同濃度乳酸處理后的A549細胞LC3B、HSP60、TOM20蛋白表達水平

圖2 在常氧和低氧條件下經(jīng)不同濃度乳酸處理后的BEAS-2B細胞LC3B、HSP60、TOM20蛋白表達水平

表3 在常氧和低氧條件下用不同濃度乳酸處理BEAS-2B、A549細胞的LC3B蛋白表達量灰度值

2.4 外源乳酸對線粒體和溶酶體共定位信號的影響

由于線粒體自噬需要依賴溶酶體完成,故用線粒體和溶酶體熒光染料標記活細胞觀察線粒體和溶酶體熒光信號共定位信號情況。分析結(jié)果顯示,在常氧和低氧條件下,和對照組相比,乳酸干預后的A549細胞中線粒體和溶酶體共定位信號增多(圖3、4和表4)。結(jié)合乳酸干預后的A549細胞中線粒體DNA拷貝數(shù)減少,線粒體HSP60和線粒體TOM 20蛋白表達水平下降,提示,外源乳酸可能引起A549細胞線粒體自噬增強。

圖3 在常氧條件下經(jīng)不同濃度乳酸處理后的A549細胞線粒體和溶酶體共定位信號

圖4 在低氧條件下經(jīng)不同濃度乳酸處理后的A549細胞線粒體和溶酶體共定位信號

表4 常氧和低氧條件下經(jīng)不同乳酸濃度處理后的A549細胞線粒體和溶酶體共定位熒光強度值

3 討論

近年來,免疫治療的興起為非小細胞肺癌的治療帶來了一線生機。機體免疫系統(tǒng)負責監(jiān)控和殺傷腫瘤細胞,為了躲避免疫攻擊,腫瘤細胞常常增強一些關(guān)鍵的免疫抑制蛋白的表達,以程序性死亡分子1(programmed cell death protein1,PD1)及其配體(programmed cell death protein 1 ligand 1,PD-L1)最為常見,這些分子能抑制免疫細胞的激活,進而減弱免疫應答。免疫治療則是通過上述免疫抑制蛋白的抑制劑來激活免疫效應細胞,以達到殺傷腫瘤細胞的目的[1]。而被腫瘤浸潤的淋巴細胞則是免疫治療中被激活的主要效應細胞[2]。乳酸作為腫瘤微環(huán)境(TME)中的主要代謝物之一,它可以調(diào)節(jié)先天性免疫細胞和適應性免疫細胞的代謝,抑制CD+8T細胞和自然殺傷細胞、樹突狀細胞的活化和增殖。越來越多的研究表明,從癌細胞或間質(zhì)細胞流出的質(zhì)子偶聯(lián)乳酸在保持酸性表型方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用,并通過調(diào)節(jié)TME加速腫瘤進展,包括細胞侵襲、血管生成、轉(zhuǎn)移發(fā)展和逃避免疫監(jiān)視[3]。在肺癌模型中也發(fā)現(xiàn)了乳酸化的組蛋白,提示乳酸在肺癌細胞中很可能也通過組蛋白乳酸化修飾調(diào)控肺癌細胞和微環(huán)境組分細胞的基因表達[4]?？梢?深入了解肺癌的免疫微環(huán)境特征是理解非小細胞肺癌腫瘤免疫調(diào)控機制及尋找新的干預靶點的關(guān)鍵。故本研究通過探求由低氧和乳酸構(gòu)成的腫瘤微環(huán)境對肺癌細胞線粒體自噬的影響,尋找免疫靶點與疾病的相關(guān)性。

線粒體功能障礙所導致的氧化應激是癌癥的主要驅(qū)動因素之一[5]。線粒體是所有真核細胞的 “動力工廠”,其主要功能是通過氧化磷酸化為細胞提供三磷酸腺苷(ATP),同時,還參與細胞代謝、增殖、衰老及程序性死亡等過程[6]。對于正常細胞來說,主要依賴線粒體氧化磷酸化來獲取生命活動所需的ATP,而在腫瘤細胞中卻普遍存在能量代謝方式的改變情況,被稱為“有氧糖酵解”,即在氧氣充足的條件下,腫瘤細胞仍然采用糖酵解的方式產(chǎn)生ATP[7]。線粒體是高等動物細胞核外唯一含有DNA的細胞器。mtDNA的功能實現(xiàn)不但與其結(jié)構(gòu)完整性有關(guān),還與其拷貝數(shù)有關(guān)。線粒體DNA拷貝數(shù)代表了每個細胞的線粒體數(shù)目及線粒體基因組數(shù)目,是衡量線粒體功能的指標之一[8]。本研究結(jié)果提示,人非小細胞肺癌細胞(A549)在無外源乳酸干預的情況下,低氧組相較于常氧組,線粒體DNA拷貝數(shù)有所增加,但在常氧和低氧條件下隨著乳酸濃度的增加,線粒體拷貝數(shù)減少,說明低氧環(huán)境和乳酸對A549細胞的影響是不完全一致的,可能在于低氧環(huán)境不單增加乳酸濃度還會產(chǎn)生其他影響,如HIF信號通路的激活等[9,10]。

自噬是一種高度保守的自我消化和分解代謝過程,受損的蛋白質(zhì)和細胞器聚集在自噬體內(nèi),然后通過與溶酶體融合來降解,以維持細胞的新陳代謝和穩(wěn)定[11]。腫瘤細胞發(fā)生自噬的誘因源于營養(yǎng)和氧氣供應不足、細胞毒劑的毒害等。[12-14]。大量研究證實,自噬對腫瘤的發(fā)生有積極的調(diào)控作用。微管相關(guān)蛋白輕鏈3B(LC3B)是最常用的自噬相關(guān)標記[15],是癌癥中最常見的LC3亞型,在自噬過程中,LC3-Ⅰ通過類泛素系統(tǒng)的脂化作用轉(zhuǎn)移到LC3-Ⅱ中。LC3-Ⅱ的含量與自噬水平相關(guān),因此可作為自噬水平的標志。熱休克蛋白60是一種重要的分子伴侶蛋白[16],位于2號染色體上,由核基因HSPD1[17]編碼,主要分布在線粒體中,在輔助伴侶蛋白HSP10的幫助下發(fā)揮作用,糾正新生蛋白質(zhì)的折疊,恢復錯誤折疊的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),并維持線粒體蛋白質(zhì)的穩(wěn)定狀態(tài)[18],是維持線粒體呼吸鏈的完整性和功能的正常性以及細胞生存所必需的過程[19]。故本研究首先檢測自噬蛋白LC3BⅡ/Ⅰ比值,得出在常氧或低氧條件下,經(jīng)外源乳酸干預后,非小細胞肺癌細胞(A549)較正常肺上皮細胞(BEAS-2B)自噬增加的結(jié)果,而后通過檢測HSP60和線粒體TOM20的表達水平,分析線粒體與溶酶體熒光共定位信號的情況,進一步驗證了乳酸與非小細胞肺癌細胞(A549)線粒體自噬的發(fā)生有關(guān)。

綜上所述,在常氧或低氧條件下,乳酸濃度的上調(diào)可以通過增加線粒體自噬和減少線粒體拷貝數(shù)對人非小細胞肺癌細胞線粒體功能產(chǎn)生影響。在腫瘤早期,細胞相對處于常氧環(huán)境下,自噬可通過清除損傷的大分子或ROS產(chǎn)物抑制腫瘤的進展。而在腫瘤晚期,腫瘤細胞處于低氧條件下,自噬通過維持腫瘤細胞的生存促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。有研究證實,線粒體自噬可促進腫瘤的發(fā)生。在腫瘤轉(zhuǎn)化過程中,致癌KRas細胞會誘發(fā)線粒體自噬的發(fā)生。在低氧條件下,腫瘤細胞發(fā)生糖酵解,并產(chǎn)生大量乳酸。ATP能量減少致細胞發(fā)生凋亡。然而,線粒體自噬可以克服這種能量的缺乏[20,21]。因此,研究乳酸在腫瘤細胞中的作用機制,有助于通過免疫治療攻克非小細胞肺癌的研究;進一步研究在低氧狀態(tài)下,乳酸對腫瘤細胞增殖、遷徙和侵襲的影響,可為全面攻克非小細胞肺癌發(fā)揮重要作用。