袁榕穗，吳植強，聶榮志，鐘文婷，張克勤

（1 廣西食品藥品審評查驗中心，南寧 530000）

（2 廣西醫(yī)療器械檢測中心，南寧 530000）

（3 賀州學(xué)院 公共基礎(chǔ)教學(xué)部，賀州 542899）

（4 蘇州大學(xué) 紡織與服裝工程學(xué)院，蘇州 215021）

0 引言

成年人體重的約60%是水，具體取決于年齡，性別等因素。人體脫水或水合過度會導(dǎo)致嚴重的健康問題，并可能伴隨各種醫(yī)療狀況。在健康老齡化和醫(yī)療保健成本不斷增加的時代，脫水導(dǎo)致大量的老年人入院治療，同時水合過度也與脫水一樣頻繁發(fā)生。此外，在耐力運動中，許多生理參數(shù)被監(jiān)測以優(yōu)化表現(xiàn)，十分需要直接測量機體含水量?？傊嬖谠S多可能導(dǎo)致過度水合或脫水的醫(yī)療狀況以及急性事件，及時干預(yù)和適當(dāng)?shù)墓芾硇枰煽康乃蠣顟B(tài)分析。然而目前還沒有快速簡單，非侵入性的方法可以可靠地測量和監(jiān)測某人的水合作用狀態(tài)［1］。

皮膚是人體主要蓄水池之一，含水量占全身的18%～20%，是理想的機體含水量檢測位置。目前皮膚含水量的研究主要以電學(xué)法［2-3］和拉曼光譜法［4］為主，其中電學(xué)法基于皮膚的電導(dǎo)或電容特性計算含水量，除檢測皮膚樣品外還可檢測人體活體，但使用前需要對皮膚嚴格的清潔以及等待清潔后恢復(fù)正常狀態(tài)的時間，準確度依賴清潔的效果，實際使用時非常不便利。拉曼光譜法可直接識別水的光譜信號強度，在體外皮膚樣本含水量檢測中展現(xiàn)了很高的精度，但面對活體檢測時有著穿透深度不足、難以聚焦以及依賴中大型光譜儀的缺點，未能應(yīng)用到人體活體實驗中。

空間位移拉曼光譜技術(shù)穿透性更強，可很大程度的減少皮膚表面水份、油脂等污染物的干擾，更換被測人時不需要重新校準光路，激發(fā)光斑大可避免皮膚刺痛感，但現(xiàn)有的空間位移拉曼光譜裝置激發(fā)點和收集點之間的空間位移量一般為幾個毫米，最常用于穿透藥瓶等包裝材料，若應(yīng)用于生物探測時會忽略皮膚厚度，采集到來自皮下的信號，因此更適用于皮下，例如骨信號的檢測［5-9］。當(dāng)應(yīng)用于皮膚檢測時，水信號占比極小，光譜收集效率低，而且受限于機械結(jié)構(gòu)和光學(xué)元件尺寸，難以縮小空間位移量。

本研究沒有使用傳統(tǒng)空間位移拉曼光譜裝置的機械偏移或者遮擋實現(xiàn)激發(fā)點和收集點的相對位移，而是設(shè)置了可微移的光源，利用光源與激發(fā)點的共軛關(guān)系調(diào)節(jié)空間位移量，同時引入顯微成像光路控制調(diào)節(jié)，最終實現(xiàn)了小于1 000 μm 的空間位移量的連續(xù)可調(diào)，應(yīng)用于皮膚含水量的檢測，通過對不同空間位移量下光譜數(shù)據(jù)的分析，最終在300 μm 的最優(yōu)條件下實現(xiàn)了皮膚中水信號的檢測，并報道了基于拉曼光譜的皮膚含水量無創(chuàng)檢測。

1 實驗部分

1.1 實驗裝置

用于對比的檢測方法為電學(xué)法，使用了Real Bubee 公司的RB-916 型皮膚水份測試儀。使用時將電極按壓到待測皮膚上，單次測量時間大約5 秒，儀器根據(jù)電導(dǎo)率等信號可直接給出含水量?？臻g位移拉曼激發(fā)和收集裝置為實驗室搭建，考慮到人體檢測需要儀器可移動，以及探頭和光譜儀分離［10-11］，光譜儀采用了可便攜的光纖光譜儀［12］，型號為Wasatch Photonics 公司的WP785ER 型拉曼光譜儀。

圖1 為空間位移拉曼實驗裝置的示意圖，整套裝置由采樣區(qū)（Sampling region）、激發(fā)區(qū)（Excitation region）、收集區(qū)（collecting region）和成像區(qū)（Imaging region）組成，其中采樣區(qū)為激發(fā)和收集光路共用，成像區(qū)用來確定空間位移量。

圖1 空間位移拉曼裝置Fig. 1 Device of spatially offset Raman spectroscopy

激發(fā)光路：光源采用QPhotonics 公司波長為761 nm 的單模光纖輸出激光器（Laser），光譜寬度0.2 nm，功率為100 mW，經(jīng)過鏡頭1（Lens1）準直后由窄帶通濾光片1（Filter1）去除邊頻，以45 度角入射到二向色鏡1（Dichroscope1）表面，經(jīng)反射后由鏡頭2（Lens2）聚焦于樣品（Sample）位置，最終可達皮膚的激光功率為80 mW，光斑直徑約為15 μm。被測位置放置平面窗口（Platewindow），測量時用手按壓，保持不動，測量時間為30 s。除此之外，平面窗口在光路校正時還起到反射信標光斑的作用，激發(fā)光路或者收集光路都可向平面窗口發(fā)射一束信標光，其中被反射的光的強度足夠被成像光路產(chǎn)生清晰的光斑像，用以確定光斑的尺寸和位置。

收集光路：樣品受激發(fā)后產(chǎn)生的拉曼散射光信號由鏡頭2（Lens2）收集并準直，輸送到二向色鏡1（Dichroscope1），二向色鏡1（Dichroscope1）允許波長大于激發(fā)光的信號通過，但還有約百分之一的激發(fā)光殘余，為粗濾。粗濾后的光由二向色鏡2（Dichroscope2）反射轉(zhuǎn)向濾光片2（Filter2），濾光片2（Filter2）為Semrock 公司OD=7 的長通濾光片，可將殘余激發(fā)光的強度降為百萬分之一，為精濾，精濾后的光由鏡頭3（Lens3）耦合進光纖光譜儀（Spectrograph），形成拉曼散射光譜。

成像光路：粗濾后殘余的激發(fā)光穿過二向色鏡2（Dichroscope2），由鏡頭4（Lens4）投射到像面成像，由目鏡（Microscope）觀察，首先在平面窗口處放置帶刻度的分劃板，用來標定視野中像的尺寸，便于后續(xù)確定空間偏移量。在空間位移拉曼實驗中，收集光路保持在中心光軸位置不動以保證收集效率，通過調(diào)整光源位置使光源離軸，將激發(fā)光源固定到一維精密位移臺上，移動位移臺（螺紋牙間距小于0.35 mm），相應(yīng)的窗口處光斑也會偏離光軸，根據(jù)分劃板的標定使成像視野中激發(fā)光光斑偏移中心位置200～1 000 μm，其下限200 μm 用以保證穿透角質(zhì)層，上限設(shè)為1 000 μm，此時像差已經(jīng)非常明顯，且接近視場邊緣，不宜繼續(xù)偏移。

1.2 實驗過程

實驗?zāi)繕藶? 人，5 男2 女，年齡分布在25～40 歲之間，為增加樣本多樣性，每人的每個手指分別作為一個樣本，則可將樣本量擴展到至少70 個。所有受試者手部皮膚健康、光滑無傷疤，無紅斑、脫屑。洗潔被測部位后5～10 min（表面水分自然消失）進行測試。實驗期間受試部位不可使用護膚品，以避免電解質(zhì)滲入皮膚，不可使用洗滌劑，以避免破壞角質(zhì)層，干擾測試結(jié)果。測試時將被測位置輕壓在平面光學(xué)窗口上，保持不動，測量時間為30 s，測試過程需要遮光。

實際測試發(fā)現(xiàn)指尖含水量明顯高于手掌其它部位，因此對測試部位分組，指尖編為A 組，手指中部編為B 組，大魚際和指跟編為C 組，編號結(jié)果見圖2。實驗后發(fā)現(xiàn)，B 組和C 組的電學(xué)法測量受洗手時間和環(huán)境濕度影響較大，最終只取A 區(qū)結(jié)果進行分析。

圖2 雙手分區(qū)編號示意圖Fig.2 Numbered partition map of hands

2 結(jié)果與討論

2.1 光譜定量分析

拉曼光譜的橫坐標為拉曼位移，單位為波數(shù)（cm-1），縱坐標為光譜強度，由于光纖拉曼光譜儀采用了硅基探測器作為光電轉(zhuǎn)換器件，其對光信號強度為線性響應(yīng)，因此該讀數(shù)可以用于定量分析［13-14］。

2.1.1 光譜去背景

圖3 展示了熒光背景高低不同的三條光譜，需要注意的是這是對同一人同一位置皮膚的三次重復(fù)測試，按先后分別對應(yīng)圖中的a、b、c。從拉曼光譜中可以看到無論是中心波數(shù)位于3 390 cm-1的水峰還是中心波數(shù)位于2 935 cm-1的蛋白峰，光譜1、光譜2 和光譜3 都不重合，其原因主要來源于熒光信號強度隨照射時間的衰減，造成了光譜基線不重合，為了保證從三條光譜中得到相同的結(jié)果，必須對光譜進行去背景處理［15］。

圖3 同一位置重復(fù)測試三遍得到的差異性光譜Fig.3 Three different spectra collected from the same location

假設(shè)采集得到的拉曼光譜數(shù)據(jù)集合為Y（i，j），光譜對應(yīng)的拉曼位移為Xi，i=1～n，n為光譜儀數(shù)據(jù)點個數(shù)，j=1～m，m為拉曼光譜條數(shù)。在Xi尋找最接近2 790 cm-1和3 780 cm-1的i值i_2790 和i_3780，對每一條光譜，做計算，即

獲得去背景后的光譜集合Y1（i，j）。其中橫坐標區(qū)域限定在2 790 cm-1到3 780 cm-1段，因為皮膚中與水相關(guān)的信息主要集中于此，過多則會增加干擾信息。

2.1.2 計算水峰面積和蛋白質(zhì)峰面積

在Xi尋找最接近水峰范圍邊界3 350 cm-1和3 550 cm-1對應(yīng)的i值i_3350 和i_3550，以及蛋白質(zhì)峰范圍邊界2 910 cm-1和2 965 cm-1對應(yīng)的i值i_2910 和i_2965，使用積分法計算光譜面積有

式中，Wj為水峰面積，Pj為蛋白質(zhì)峰面積。

2.1.3 根據(jù)光譜數(shù)據(jù)推算皮膚相對含水量

基于拉曼光譜的水含量定量分析采用拉曼波段在3 390 cm-1處的強度和2 935 cm-1處的強度之比確定組織中的水蛋白比例［16］，計算每個樣本的含水量Pw，公式為

對于水峰和蛋白質(zhì)峰，有

式中，mWj為每個樣本所對應(yīng)的水的質(zhì)量，mPj為每個樣本所對應(yīng)的蛋白質(zhì)的質(zhì)量，R為水峰和蛋白質(zhì)峰的峰面積比例系數(shù)。

人體平均含水量為60%，按含水量計算公式

則mW/mP=1.5。據(jù)此。

按照以上方法，A 組產(chǎn)生70 個相對水含量，重復(fù)三次實驗以增加穩(wěn)定性，對應(yīng)的三條光譜在正常情況下經(jīng)過上述算法處理后可以得到重復(fù)的結(jié)果。圖4 為所有70 條光譜的合集，圖中右上角為經(jīng)過去背景處理后的效果。含水量用百分比（%）表示，表1 和表2 分別記錄了用電學(xué)法和光譜法測得的皮膚含水量數(shù)值，其中7 行代表編號為1～7 的7 個受試者，10 列代表每個受試者的10 個測試位置，下文將兩組結(jié)果做一致性分析。

表1 1-7 號受試者的光譜法結(jié)果（%）Table 1 Results of spectroscopic methods for subjects 1-7（%）

表2 1-7 號受試者的電學(xué)法結(jié)果（%）Table 2 Results of electrical conductivity methods for subjects 1-7（%）

圖4 70 條原始光譜以及去背景光譜的集合Fig.4 A collection of 70 original spectra and 70 spectra after baseline calibration

2.2 一致性分析

組內(nèi)相關(guān)系數(shù)（ICC）常用于評價不同方法、設(shè)備或測試人員對同一定量測量結(jié)果的一致性和可重復(fù)性［17-18］，ICC=σ2T/(σ2T+σ2B+σ2E)。其中σ2T為被測者變異，σ2B為系統(tǒng)誤差（不同測試方法），σ2E為隨機誤差造成的變異。相關(guān)工作由SPSS 方法完成，選擇“可靠性分析”功能，調(diào)用適用于兩項分析的Alpha 模型，α是衡量信度的一種方法，α>0.7 屬于高信度，0.35<α<0.70 表示可以接受，α<0.35 屬于低信度。

對數(shù)據(jù)統(tǒng)計時選用組內(nèi)相關(guān)系數(shù)，組內(nèi)相關(guān)系數(shù)的計算有三種模型，分別是單向隨機、雙向隨機和雙向混合。其中，單項隨機模型不適用于評價結(jié)果的可重復(fù)性。雙向隨機模型與雙向混合模型接近，理論上都可用來評價可重復(fù)性，其中雙向隨機模型適用于采用任意同樣設(shè)備的兩個研究者，而雙向混合模型的結(jié)果僅限于給定的兩種設(shè)備，不能推論其他。因此，本研究選擇雙向混合模型。該模型下又分為兩種評價類型，分別為一致性和絕對一致，考慮到電學(xué)法和光譜法得到的含水量未經(jīng)過統(tǒng)一標定，因此選擇一致性評價方法。計算的結(jié)果見表3，結(jié)果包含了組內(nèi)相關(guān)系數(shù)及其95%置信區(qū)間，其中單個測量（Single measurement）可以估計單個設(shè)備的可靠性，平均測量（Average measurement）為兩者的平均值。由單個測量組內(nèi)相關(guān)系數(shù)為0.889 可以看出，兩種方法的檢測結(jié)果有較高的一致性，但基于空間拉曼光譜法的檢測裝置對皮膚的清潔要求并不嚴格，應(yīng)用更加便利。

個體的差異使信號來源并不一致，例如若甲比乙的角質(zhì)層厚，則甲的信號很可能來自上層水含量低的位置而乙的信號來自下層水含量高的位置，這使兩人含水量的對比失去意義。幸運的是，皮膚中水含量穩(wěn)定的儲水層具有足夠的厚度，這使本研究可以找到一個適合的探測參數(shù)，使每個人的信號來源既不過淺，又不過深，即位于甲和乙能代表總體含水量的區(qū)域的重疊位置，基于此建立一種適用于多數(shù)人的含水量比較方法。

找到適合大多數(shù)人的適宜深度是消除差異性的關(guān)鍵，假設(shè)人體的差異體現(xiàn)到空間位移距離上小于800 μm，從200 μm 到1 000 μm 的范圍內(nèi)做了4 組對比實驗，用來探索效果最佳的探測參數(shù)。如圖5 所示，本文設(shè)置了4 種不同空間位移量的實驗，圖5 中（a）～（d）對應(yīng)的空間位移距離分別為200 μm、300 μm、500 μm和1 000 μm，每個光譜都連續(xù)的重復(fù)測量3 次，用以展示熒光衰減后光譜強度的分布范圍。不同空間位移量下測得的來自同一人同一位置的皮膚光譜，可以看到只在信號強度上有明顯區(qū)別，而在光譜輪廓和細節(jié)上沒有顯著和規(guī)律的變化，無法區(qū)別哪種光譜的效果更好，只能依靠定量分析的結(jié)果來判斷。本文在4 種空間位移量下分別重復(fù)了上文所述的實驗和分析過程，最終確認了空間位移量為300 μm 時可以得到最佳的效果。

圖5 在不同空間位移量下測得的拉曼光譜Fig.5 Raman spectra at different spatially offsets

用統(tǒng)計學(xué)的方法證明該裝置具有空間靈敏性并且得到最優(yōu)的裝置參數(shù)后，我們也希望總結(jié)出一種更直觀的通過光譜特征快速的判斷信號優(yōu)劣的方法，圖5 為在不同空間位移量下測得的拉曼光譜，依舊是連續(xù)采集三條光譜以保證光譜典型性，從表4 可以看出隨著空間位移距離的增大，光譜高度依次降低，但一致性卻隨著光譜高度的遞減呈現(xiàn)先升高后降低然后再升高的趨勢，并沒有什么規(guī)律，因此不能從光譜高度來判斷信號優(yōu)劣。我們注意到即使是同一個人的同一個位置，水信號相對強度（拉曼波數(shù)在3 390 cm-1和2 935 cm-1處的強度之比）在不同空間位移距離的檢測條件下，其值也是不相等的，原因在于皮膚并非所有的深度都能正確的體現(xiàn)含水量。表4 展示了不同空間位移下獲得的數(shù)據(jù)的組內(nèi)相關(guān)系數(shù)以及相對水峰強度?？傮w而言，如果水信號相對強度小于0.05，那么檢測結(jié)果就只有低可信度，例如實驗中空間位移距離為500 μm 時，水信號相對強度只有0.023，組內(nèi)相關(guān)系數(shù)只有0.316，這種條件下就需要調(diào)整光路，或者檢查被測人皮膚是否有損傷、疤痕等問題；如果水信號相對強度接近0.10，即可判斷此時的光路配置基本合格，只需要進一步細調(diào)，以確定最佳參數(shù)，該經(jīng)驗方法可以快速有效的對弱信號、強背景光譜進行篩選，提高研究效率。

表4 不同空間位移對應(yīng)的組內(nèi)相關(guān)系數(shù)Table 4 ICC for different spatially offsets

3 結(jié)論

本文探索了基于空間位移拉曼光譜和便攜式光纖光譜儀檢測皮膚含水量的可行性，搭建了精密的空間位移拉曼光譜裝置并用統(tǒng)計學(xué)的方法證明了該裝置具有空間靈敏性。實驗裝置設(shè)計了可微移的光源，利用光源與激發(fā)點的共軛關(guān)系調(diào)節(jié)空間位移量，同時引入顯微成像光路控制調(diào)節(jié)，最終實現(xiàn)了小于1 000 μm 的空間位移量的連續(xù)可調(diào)，在不同空間位移距離下采集了一系列人體光譜，經(jīng)過光譜去背景、水相對含量分析等算法的處理，得到了穩(wěn)定的相對水含量，證明該實驗裝置可以得到重復(fù)性良好的光譜。通過對電學(xué)法和光譜法測試結(jié)果的對比統(tǒng)計分析得到組內(nèi)相關(guān)系數(shù)，當(dāng)空間位移距離分別為200 μm、300 μm、500 μm 和1 000 μm 時，對應(yīng)的組內(nèi)相關(guān)系數(shù)分別為0.612、0.889、0.316 和0.544。確定了適用于人體皮膚含水量檢測的最優(yōu)空間位移量為300 μm，在該條件下基于空間位移拉曼光譜測得的人體活體皮膚含水量結(jié)果與電學(xué)法檢測結(jié)果具有較高一致性，同時不需要電學(xué)法嚴格的皮膚清潔過程，有望實現(xiàn)皮膚內(nèi)層水含量的便捷檢測。光纖光譜儀和探測探頭分離的設(shè)計也滿足實用化的要求，便于展開大量人體測量實驗，有轉(zhuǎn)化成醫(yī)療器械的潛能。