◎ 李 悅，陳 靜，張曉雨，劉 義，韋云路

（1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽(yáng) 621000；2.貴州食品工程職業(yè)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550000）

胞外多糖(EPS)是乳酸菌向周邊環(huán)境產(chǎn)生的高分子化合物，主要由糖和糖的衍生物組成[1]，長(zhǎng)期以來(lái)一直被安全地用于食品工業(yè)[2]。由于LAB通常被認(rèn)為是一種安全的食品微生物，純化的LAB和EPS可以直接用于乳品行業(yè)，作為商業(yè)乳化劑和增稠劑的替代品，以改善酸奶的黏度、質(zhì)地和風(fēng)味[3,4]。然而，雖然人們普遍認(rèn)識(shí)到了LAB與EPS的各種好處，但只有少數(shù)產(chǎn)品已經(jīng)商業(yè)化和工業(yè)化生產(chǎn)。

分離能夠產(chǎn)生活性EPS的天然乳酸菌株，是廣泛使用和應(yīng)用乳酸菌的先決條件。發(fā)酵食品大多是由乳酸菌發(fā)酵而成，可以作為產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的重要來(lái)源[5]。研究者發(fā)現(xiàn)一種土耳其飲料，以植物乳桿菌為主要菌種，并從天然發(fā)酵的青橄欖汁中篩選了17個(gè)以上的菌株[6-9]。

研究表明，產(chǎn)生胞外多糖的乳酸菌和發(fā)酵劑的結(jié)合，可以增加酸奶的黏度和改善口感，而酸奶的黏度主要由形成胞外多糖的數(shù)量及結(jié)構(gòu)決定[10-11]。Helen等[12]人提出，產(chǎn)胞外多糖乳酸菌在提高發(fā)酵乳硬度方面具有一定效果，且EPS產(chǎn)量越高，制品硬度越小。隨著穩(wěn)定劑在歐洲被禁止使用，出現(xiàn)了不使用添加劑的天然食品[13]。

本研究采用四川特色傳統(tǒng)發(fā)酵食品臘肉與泡菜作為原材料，篩選并鑒定高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌菌株，且對(duì)其抗氧化性與自聚集能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為開展高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的開發(fā)與研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料：自然發(fā)酵的泡菜、四川農(nóng)家自制臘肉。

培養(yǎng)基：MRS固體培養(yǎng)基、MRS液體培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)公司。

試劑：胰蛋白酶，北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司；濃硫酸、二甲苯、酚酞、過氧化氫、無(wú)水乙醇，成都金山化學(xué)試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

TOMY SX-700立式高壓蒸汽滅菌鍋：櫻美迪生物科技(上海)有限公司；SW-CJ-1F水平流潔凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；SPX-250-B-Z微生物恒溫培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；UV-5800PC紫外分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分離、純化

取5 g產(chǎn)品進(jìn)行處理，利用梯度稀釋將濃度降到10～5。每個(gè)梯度于MRS瓊脂上涂覆，置于37 ℃培養(yǎng)24～48 h。從平板上選取具有不同特征的單個(gè)菌落，對(duì)其展開分離和純化，反復(fù)進(jìn)行以上步驟，直至產(chǎn)生純菌落,然后將所得的單一菌株進(jìn)行排序，甘油保藏[14]。

1.3.2 菌株的篩選

1.3.2.1 菌株自聚集實(shí)驗(yàn)

參考SON等[15]的方法作適當(dāng)修改，將乳酸菌菌株5 000 r/min，離心10 min收集，利用PBS緩沖液洗滌菌體2次，PBS緩沖液重懸菌體用測(cè)OD600并調(diào)至1.0，于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置2 h，取0.1 mL上層懸液加入1.9 mL的PBS中測(cè)定OD600。

1.3.2.2 乳酸菌胞外多糖的提取

根據(jù)劉滔[16]和陳東[17]的方法做了修改， 3%接種量接種于MRS中， 37 ℃發(fā)酵24 h，離心（5 000 r/min、25 min）取上清液，加入三氯乙酸使其濃度為4 %， 4 ℃靜置過夜，離心（5 000 r/min、20 min）取上清液，加入3倍體積無(wú)水乙醇， 4 ℃靜置過夜，離心（5 000 r/min、20 min）去上清液，用蒸餾水使其溶解，在4 ℃下透析2 d，冷凍干燥，稱重量。

1.3.3 菌株的鑒定

（1）乳酸菌的16S rDNA 基因序列測(cè)定

由專業(yè)公司測(cè)序，將測(cè)序后獲得的16S rDNA基因序列遞交美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)；使用搜索工具（BLAST）進(jìn)行同源性比對(duì)，對(duì)序列一致性分析[18]。

（2）乳酸菌細(xì)胞形態(tài)觀察

將篩選出的3株乳酸菌培養(yǎng)24 h，隨后用革蘭氏染色法對(duì)目標(biāo)細(xì)菌的形態(tài)進(jìn)行觀察。

1.3.4 菌株的體外益生特性

1.3.4.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定

吸取不同發(fā)酵時(shí)段的發(fā)酵上清液2 mL于10 mL試管中，每支試管加入2 mL 、2×10-4mol·L-1的DPPH溶液，將其振蕩均勻，在黑暗處放置30 min，取上清液，測(cè)定波長(zhǎng)為517 nm的吸光度。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組[19-20]。

式中，A1是DPPH溶液與被測(cè)定的液體的吸光度；A2是無(wú)水酒精與被測(cè)定的溶液的吸光度；A0為DPPH溶液與無(wú)水酒精的吸光度值。

1.3.4.2 乳酸菌細(xì)胞表面疏水性的測(cè)定

利用BATH測(cè)定細(xì)胞表面疏水性：取菌液5 mL于離心管，離心（3 000 r/min 、10 min）收集菌體。用5 mL的PBS緩沖液清洗兩次，以 PBS緩沖液作空白對(duì)照，用其調(diào)節(jié)OD600為1.00 nm，取4 mL于離心管內(nèi)，添加二甲苯0.8 mL,對(duì)照組未添加，震蕩30 s后放置10 s,再次震蕩30 s，靜置10 min待分層。測(cè)水相測(cè)定OD600nm值[21]。

式中，A0是與二甲苯混合前菌液OD值；A是與二甲苯混勻后菌液 OD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離結(jié)果

從四川傳統(tǒng)的發(fā)酵食品樣品中，分離純化出大約40株的乳酸菌單菌落，其固體培養(yǎng)基的形態(tài)，菌株均為白色，形狀為圓形，且表面濕潤(rùn)和凸起，可以明顯分辨為乳酸菌單個(gè)菌落。其中，由泡菜篩選的菌株編號(hào)為P1-25，臘肉編號(hào)為L(zhǎng)1-15，分離到的乳酸菌均采用甘油進(jìn)行菌株保藏，以備后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 菌株的篩選及鑒定

2.2.1 菌株的篩選

2.2.1.1 自聚集能力

采用整群隨機(jī)抽樣的方法，從某省某高校二年級(jí)學(xué)生中選取120名非英語(yǔ)專業(yè)大學(xué)生為調(diào)查對(duì)象。其中男生57名，女生63名。

對(duì)篩選的乳酸菌進(jìn)行培養(yǎng)，形成單菌落，初步觀察其菌落形態(tài)后，選取菌落較大、黏稠的菌株，并進(jìn)行自聚集能力測(cè)定，測(cè)定結(jié)果顯示自聚集率最高的10株乳酸菌，分別為P2、P6、P10、P12、P15、P16、P18、P19、L2、L6（如表1所示）。

表1 菌株自聚集能力表

2.2.1.2 高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的篩選

將2.2.1.1中所得的10株菌進(jìn)行培養(yǎng)并提取胞外多糖后經(jīng)真空冷凍干燥，獲得的乳酸菌胞外多糖樣品顏色為淡黃色或乳白色，結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)疏松多孔的形態(tài)；對(duì)每株菌產(chǎn)生的EPS進(jìn)行稱重，篩選出來(lái)的3株高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌菌株分別是P2、P6、P19（如表2所示）。

表2 菌株多糖產(chǎn)量表

2.2.2 菌株的鑒定

2.2.2.1 乳酸菌的16S rDNA 基因序列

將從四川傳統(tǒng)發(fā)酵食品中獲得的高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌送公司鑒定，結(jié)果如表3所示，分別為P2（Leuconostoc mesenteroides）、P6（Lactobacillus sakei）、P9（Weissella viridescens）。

表3 菌株16S rDNA的測(cè)序結(jié)果表

對(duì)3株高產(chǎn)胞外多糖的乳酸菌進(jìn)行革蘭氏染色，結(jié)果見圖1，所有的細(xì)菌都是革蘭氏陽(yáng)性，并且細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)長(zhǎng)杄、短?hào)e、棒狀、球狀、細(xì)長(zhǎng)形，無(wú)分枝。

圖1 顯微鏡下菌株細(xì)胞形態(tài)圖

2.3 乳酸菌益生特性

2.3.1 乳酸菌DPPH自由基清除能力

用 DPPH自由基清除速率來(lái)評(píng)估乳桿菌的抗氧化性。如圖2所示，乳桿菌發(fā)酵液具有一定的抗氧化活性，數(shù)據(jù)顯示，在乳酸菌的發(fā)酵過程中，3株菌的DPPH自由基清除率均隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增長(zhǎng)，30 h后，P2和P6有降低趨勢(shì)，清除率最低的是P2；18 h前，P19的清除能力最強(qiáng)；18h后，P19和P6對(duì)DPPH自由基的清除能力相當(dāng)。

圖2 乳酸菌DPPH自由基清除能力圖

2.3.2 乳酸菌菌株的表面疏水性

在益生菌的體外篩選過程中，菌體的疏水度反應(yīng)了菌體在生物體內(nèi)的定殖能力。本研究分別對(duì)篩選到的乳酸菌菌株P(guān)2、P6、P19的表面疏水性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果由表4可知，各種類型的乳酸菌對(duì)二甲苯具有不同的吸附量。其中，P19的疏水率大于90 %，對(duì)二甲苯有較好的吸附性；P2、P6兩種材料的疏水性均低于50%，對(duì)二甲苯的吸附性比較差。

表4 菌株表面疏水性測(cè)定結(jié)果表

3 討論

本研究從四川傳統(tǒng)的發(fā)酵食物泡菜和臘肉中分離出乳酸菌，并且進(jìn)行篩選，篩選出的乳酸菌單菌落形狀與陳東[17]等篩選出的乳酸菌菌落特征一致，初步認(rèn)定為乳酸菌。在此基礎(chǔ)上，本研究對(duì)所獲取的17株通過自聚集進(jìn)行篩選，結(jié)果表明，這17株乳酸菌的自聚集能力較強(qiáng)，均在90 %以上，說(shuō)明所篩選的乳酸菌可快速繁殖、自行聚集成團(tuán)，這一結(jié)果與陳孝勇[22]等在牦牛酸乳中選擇出的乳酸菌結(jié)果相似。隨后，本研究對(duì)自聚集能力較強(qiáng)的菌株進(jìn)行胞外多糖產(chǎn)量的測(cè)定，得到P2、P6、P19菌株，并運(yùn)用16S rDNA鑒定菌株，二者16S rDNA序列同源性均大于97.5%，表明二者為同種，這與陳明霞[23]等的研究結(jié)果相似。本研究最終篩選出的3株菌在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST相似性對(duì)比。其中，P2為L(zhǎng)euconostoc mesenteroides、P6為L(zhǎng)actobacillus sakei、P19為Weissella viridescens。隨后將這3株乳酸菌進(jìn)行革蘭氏染色并在顯微鏡下觀察，可以看見明顯的紫色，為革蘭氏陽(yáng)性菌，形態(tài)觀察與16S rDNA鑒定結(jié)果一致。

乳酸菌的抗氧化能力能夠幫助機(jī)體維持相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，本研究表明，3株菌株的自由基清除能力均隨著發(fā)酵時(shí)間增加而增強(qiáng)，30 h后P2和P6有降低趨勢(shì)。由此可見，選擇適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵時(shí)間，對(duì)于提高乳酸菌的抗氧化能力具有重要作用。

菌體的疏水度反應(yīng)了菌體在生物體內(nèi)的定殖能力，本研究中，P19的疏水率大于90 %，P2、P6兩種材料的疏水性均低于50%。國(guó)內(nèi)學(xué)者從四川傳統(tǒng)干酪中篩選得到乳酸菌菌株N-4的疏水性達(dá)21.37%，篩選的降膽固醇乳酸菌 ZG2YLu05疏水性為 46.82%[25-26]。與上述研究結(jié)果相比，3株菌的優(yōu)勢(shì)明顯，可見其具有明顯的腸道定殖潛力。

4 結(jié)語(yǔ)

本研究從四川傳統(tǒng)發(fā)酵食品中共分離篩選出3株高產(chǎn)胞外多糖乳酸菌，分別是P2、P6、P19，其產(chǎn)量分別為0.140、0.124、0.128 g/L，鑒定為L(zhǎng)euconostoc mesenteroides、Lactobacillus sakei、Weissella viridescens。在益生特性評(píng)價(jià)中，P2的抗氧化能力較弱，但對(duì)DPPH自由基的清除能力最弱；P19和P6抗氧化能力較強(qiáng)，對(duì)DPPH自由基的清除能力18 h后相當(dāng)，18 h前P19的清除能力最強(qiáng)。此外，3株菌的表面疏水性有所不同，其中，P19的疏水率高于90%，這表明3株菌有在腸道定殖的潛力。因此，本研究結(jié)果表明，3株菌均有開展益生性能與胞外多糖研究的價(jià)值，可以為后續(xù)探究奠定基礎(chǔ)。