陳俊儒,張馨予,康 平,田福燕,張執(zhí)中

眾多慢性腎病(CKD)病程發(fā)展的終末階段共同表現(xiàn)為腎臟纖維化［1-3］,表現(xiàn)為腎小管上皮間質(zhì)細(xì)胞纖維化、腎小球出現(xiàn)硬化、腎小球?yàn)V過(guò)作用受阻、細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積,導(dǎo)致腎臟功能進(jìn)行性減弱,甚至最終喪失［4］。研究表明,LBP作為枸杞中發(fā)揮作用的主要活性成分之一,具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能、抵抗細(xì)胞氧化、預(yù)防衰老和抗腫瘤等作用［5］。有研究發(fā)現(xiàn),LBP可以緩解心肌組織膠原纖維沉積,抑制慢性心力衰竭大鼠心肌纖維化,改善大鼠心功能［6］。在小鼠腎臟纖維化模型中的研究也表明,LBP能夠緩解腎臟纖維化,但是具體機(jī)制尚不明確。目前許多證據(jù)表明微小RNA(miRNA)在腎臟纖維化調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮著作用,通過(guò)靶向調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)從而影響疾病的進(jìn)程［7］。本研究通過(guò)結(jié)扎左側(cè)輸尿管構(gòu)建腎臟纖維化模型,給予LBP干預(yù)后,探討miR-150-5p在LBP抑制腎臟纖維化過(guò)程中的作用。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:實(shí)驗(yàn)所用小鼠均為18～20 g的雌性Balb/c小鼠,購(gòu)自北京維通利華公司,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,待小鼠適應(yīng)環(huán)境后,采用手術(shù)的方法構(gòu)建腎臟纖維化小鼠模型。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料與試劑:枸杞多糖(純度>95%)購(gòu)自西安草根生物工程有限公司;所有熒光定量PCR引物均委托上海生工進(jìn)行合成;RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑購(gòu)自Thermo公司;離心管等耗材購(gòu)自武漢塞維爾公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組及模型的構(gòu)建:21只雌性Balb/c小鼠隨機(jī)分成3組,即假手術(shù)組、模型組和LBP干預(yù)組,每組7只小鼠。假手術(shù)組小鼠麻醉后,側(cè)臥位,分離出左側(cè)輸尿管,不結(jié)扎,清理傷口后縫合;模型組小鼠麻醉后,分離出左側(cè)輸尿管,6號(hào)線結(jié)扎2道,在其間剪斷輸尿管,清理傷口并縫合;LBP干預(yù)組小鼠在模型組的基礎(chǔ)上每天灌胃0.1 mg/g的LBP,假手術(shù)組和模型組小鼠灌胃100 μL生理鹽水,連續(xù)灌胃21 d。取材后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 小鼠取材及腎臟指數(shù)的計(jì)算:稱取小鼠體重后,眼球取血,摘取左側(cè)腎臟組織,剔除多余的脂肪組織,用分析天平稱重,計(jì)算各組小鼠腎臟指數(shù)。腎臟指數(shù)=腎臟濕重(g)/小鼠體重(g)×100%。

1.3.3 小鼠腎臟RNA的提取與逆轉(zhuǎn)錄:上述摘取左側(cè)腎臟組織用預(yù)冷的生理鹽水洗去血液,剪碎后置于預(yù)冷的研缽中,加入適量液氮進(jìn)行研磨。待其成為粉末后,轉(zhuǎn)移至無(wú)酶EP管中,加入Trizol后徹底混勻,室溫避光靜置5 min。避光加入200 μL氯仿,劇烈混勻后靜置5 min,離心后吸取上層清液至新的EP管中,加入400 μL異丙醇,室溫靜置10 min,離心,加入預(yù)冷的75%酒精1 mL,離心棄上清液,用50 μL 雙蒸水重新懸浮。檢測(cè)RNA的濃度后按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

1.3.4 小鼠腎臟基因表達(dá)水平的檢測(cè):將10 μL 2x SYBR GreenERTM qPCR Super Mix,0.5 μL上游引物,0.5 μL下游引物,1μL cDNA模板,0.4 μL Rox和7.6μL ddH2O依次加入八聯(lián)管,形成20 μL的反應(yīng)體系;反應(yīng)條件為94 ℃ 3 min預(yù)變性,94 ℃ 30 s變性,57 ℃ 30 s退火,72 ℃ 30 s是延伸過(guò)程,總共完成40個(gè)循環(huán),循環(huán)結(jié)束后,讀取CT值,根據(jù)2-ΔΔCT方法計(jì)算基因與GAPDH的相對(duì)比值,將對(duì)照組的比值換算成1,繪制條形圖。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.3.5 ELISA檢測(cè)小鼠血清中纖維化指標(biāo):向包被抗體的酶標(biāo)板中加入稀釋的小鼠血清(1∶200),置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育1 h,PBST洗板3次,加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗,37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育30 min,PBST洗板3次。加入底物,37 ℃避光孵育10 min,最后加入終止液,在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下讀取數(shù)值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)值計(jì)算并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,將各組的均值代入公式計(jì)算樣品中各細(xì)胞因子含量。

1.3.6 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-150-5p靶基因:使用Targetscan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-150-5p靶基因,并利用qRT-PCR驗(yàn)證靶基因Mtmr1和Prickle mRNA在各組肝臟組織中的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 LBP對(duì)左腎纖維化小鼠腎臟指數(shù)的影響:與假手術(shù)組相比,模型組小鼠腎臟濕重、小鼠體重以及腎臟指數(shù)均顯著下降,LBP干預(yù)組小鼠腎臟濕重和小鼠體重顯著下降(P<0.05),腎臟指數(shù)沒(méi)有明顯改變;與模型組小鼠相比,LBP干預(yù)組小鼠腎臟濕重、小鼠體重均顯著上升(P<0.05),腎臟指數(shù)降低(P<0.05),見(jiàn)表2。

表2 LBP對(duì)左腎纖維化小鼠體重、腎臟濕重及腎臟指數(shù)的影響

2.2 LBP對(duì)左腎纖維化各組小鼠腎組織纖維化相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平的影響:與假手術(shù)組相比,模型組小鼠腎臟組織中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、FN及α-SMA的mRNA的表達(dá)水平顯著上升(P<0.05);LBP干預(yù)組小鼠腎臟組織中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、FN及α-SMA較假手術(shù)組顯著上升(P<0.05);與模型組小鼠相比,LBP干預(yù)組小鼠腎臟組織中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、FN及α-SMA mRNA表達(dá)水平顯著下降(P<0.05),見(jiàn)圖1(目次后)。

2.3 LBP對(duì)左腎纖維化小鼠腎組織miR-150-5p表達(dá)水平的影響:與假手術(shù)組相比,模型組、LBP干預(yù)組miR-150-5p表達(dá)均降低(P<0.05);與模型組相比,LBP干預(yù)組miR-150-5p的表達(dá)上升(P<0.05),見(jiàn)圖2(目次后)。

2.4 miR-150-5p靶基因的預(yù)測(cè):經(jīng)過(guò)Targetscan在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-150-5p靶基因,結(jié)果顯示miR-150-5p靶基因總共有326個(gè),篩選出與纖維化相關(guān)的靶基因總共有2個(gè),分別是肌微管蛋白相關(guān)蛋白1(Mtmr1),Prickle,見(jiàn)圖3(目次后)。

2.5 LBP對(duì)左腎纖維化小鼠腎組織miR-150-5p靶基因Mtmr1和 Prickle mRNA表達(dá)水平的影響:與假手術(shù)組相比,模型組Mtmr1與Prickle的mRNA表達(dá)水平均顯著上升(P<0.05),LBP干預(yù)組Mtmr1 mRMNA表達(dá)水平顯著上升(P<0.05),Prickle mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型組相比,LBP干預(yù)組Mtmr1 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),Prickle表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)圖4(目錄后)。

3 討論

腎臟纖維化是CKD發(fā)展到終末階段的共同結(jié)果。截至目前腎臟纖維化機(jī)制尚未闡明,臨床對(duì)腎臟纖維化病人的治療措施也有限,這就使腎臟纖維化成為一種嚴(yán)重影響人類健康的疾病。枸杞多糖作為枸杞主要活性成分之一,已被證實(shí)具有免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、抗氧化和抗腫瘤等作用。近年來(lái)有研究表明LBP具有抗纖維化作用,干預(yù)改善了心肌組織膠原纖維沉積,能夠抑制慢性心力衰竭大鼠心肌纖維化,改善心功能。左側(cè)輸尿管結(jié)扎是構(gòu)建腎臟纖維化小鼠模型常用的一種方式［8］。本研究通過(guò)該種方式構(gòu)建實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,發(fā)現(xiàn)小鼠腎臟濕重和腎臟指數(shù)顯著降低,此外RT-qPCR結(jié)果也顯示纖維化指標(biāo)Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、FN和α-SMA的mRNA表達(dá)水平顯著上升,這就表明腎臟纖維化小鼠模型構(gòu)建成功。給予LBP干預(yù)后,小鼠腎臟濕重上升,纖維化指標(biāo)Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、FN和α-SMA mRNA表達(dá)顯著下調(diào) ,腎臟纖維化得到緩解,這就提示LBP具有緩解腎臟纖維化的作用,這與文獻(xiàn)報(bào)道的LBP作用相同。

miRNA是一種非編碼RNA的參與多種生命活動(dòng)的調(diào)節(jié),如基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯等,長(zhǎng)度約為 22 個(gè)核苷酸,其能夠與靶基因 miRNA的3’-UTR完全或不完全配對(duì),在轉(zhuǎn)錄水平上發(fā)揮抑制基因表達(dá)的作用［9-12］。近年來(lái)大量研究表明miRNA廣泛參與腎臟纖維化調(diào)控,這些靶向腎臟纖維化相關(guān)的miRNA可能成為抗纖維化治療的潛在手段［13］。研究表明miR-34a通過(guò)下調(diào)klotho緩解腎臟纖維化［14］;miR-21通過(guò)靶向阻斷腎臟中的PTEN激活成纖維細(xì)胞,從而調(diào)節(jié)腎纖維化［15］。Peng等人發(fā)現(xiàn)miR-135a可以結(jié)合circRNA_010383緩解糖尿病腎病引起的腎臟纖維化［16］。越來(lái)越多的miRNA被鑒定出來(lái),這些miRNAs可以作為潛在的診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物。本研究發(fā)現(xiàn),在腎臟纖維化模型中miR-150-5p表達(dá)下調(diào),LBP干預(yù)后miR-150-5p表達(dá)上調(diào),這就表明miR-150-5p可能參與LBP抑制腎臟纖維化進(jìn)程。通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的miR-150-5p靶基因總共有326個(gè),經(jīng)過(guò)篩選得到與纖維化相關(guān)的mRNA有2個(gè),分別是Mtmr1和Prickle。經(jīng)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)Mtmr1和Prickle在模型組小鼠腎臟組織中顯著上調(diào),給予LBP干預(yù)后,Mtmr1表達(dá)水平顯著下調(diào),Prickle表達(dá)沒(méi)有明顯改變。這就提示miR-150-5p可能上調(diào)緩解腎臟纖維化,這還需雙熒光素酶報(bào)告基因進(jìn)行證實(shí)。

綜上所述,LBP能夠通過(guò)調(diào)節(jié)miR-150-5p的表達(dá),起到改善腎臟纖維化的作用,其機(jī)制可能是通過(guò)靶向Mtmr1實(shí)現(xiàn)的,這可能為腎臟纖維化的診斷和治療提供新思路。