劉洪濤 馮守寧 劉金強(qiáng) 吳慧麗

1.鄭州人民醫(yī)院急診科 (河南 鄭州,450000) 2.鄭州中心醫(yī)院消化內(nèi)科

肝細(xì)胞癌是臨床上最常見惡性腫瘤之一,發(fā)病率和死亡率分別位列第7位和第4位。肝癌早期癥狀不明顯,多數(shù)患者一經(jīng)發(fā)現(xiàn)已處于中晚期,預(yù)后不佳,5年生存率僅為15%～40%,給患者的生命安全帶來嚴(yán)重威脅[1]。乙型肝炎病毒(HBV)是肝細(xì)胞癌最常見的危險(xiǎn)因素,HBV相關(guān)性肝癌在國內(nèi)的原發(fā)性肝癌病例中占80%左右,HBsAg呈陽性患者患肝細(xì)胞癌地風(fēng)險(xiǎn)比HBsAg陰性人群高10～50倍[2]。因此,早期診斷、早期治療可極大提高患者的治愈率,延長生存期。微小RNA(miRNA)是一種小的類似于小干擾RNA(siRNA)的分子,參與多種腫瘤細(xì)胞的分化、增殖、凋亡等多個(gè)過程,現(xiàn)已成為新一代疾病診斷與分子靶向治療的標(biāo)志物[3,4]。miR-127-3p是一種小分子的非編碼RNA,在不同癌癥中均具有重要作用,研究表明,其在胃癌、宮頸癌患者中表達(dá)水平較低,并對癌細(xì)胞的生長、增殖主要起抑制作用[5,6]。目前關(guān)于miR-127-3p在HBV相關(guān)性肝癌中的表達(dá)意義及其對肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響研究鮮有報(bào)道?；诖?本研究探討miR-127-3p在HBV相關(guān)性肝癌中的表達(dá)意義及對HBV陽性肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響,為HBV陽性肝癌分子靶向治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 肝癌組織標(biāo)本來源 肝癌組織標(biāo)本均取自2018年12月至2020年12月在醫(yī)院普通外科接受手術(shù)切除的64例HBV相關(guān)性肝癌患者。所有標(biāo)本采集均經(jīng)過患者及其家屬同意并簽署知情同意書。所有患者乙型肝炎表面抗原HBsAg或HBV DNA檢查為陽性,且術(shù)前均未行放化療,術(shù)后病理證實(shí)為HBV相關(guān)性肝癌。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng) 通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RTFQ-PCR)檢測肝癌及癌旁組織miR-127-3p相對表達(dá)量。Trizol法提取肝癌組織、癌旁組織及細(xì)胞中總RNA。以5 μl總RNA為模板,使用RT-PCR試劑盒(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,總反應(yīng)體系:2 μl cDNA,2.5 μl Taq DNA聚合酶,0.5 μl上下游引物,10 μl雙蒸水。以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,在美國ABI 7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀系統(tǒng)上進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min,95℃變性15 s,60℃退火45 s,共35個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品的CT值以U6作為內(nèi)參進(jìn)行校正,△CT=CT目的基因-CTU6,采用2-ΔΔCt法計(jì)算miRNA的相對表達(dá)量。miRNA的引物序列來自Sanger數(shù)據(jù)庫,由上海賽百勝基因技術(shù)有限公司合成。miR-127-3p正向引物序列:5′-UGAUUGGUACGUCUGUGGGUAGTT-3′,反向引物序列:5′-CUACCCACAGACGUACCAAUCATT-3′;內(nèi)參基因U6上游序列:5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′,下游序列:5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。

1.3 肝癌HepG2細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 將購于上海生工生物工程股份有限公司的人肝癌HepG2細(xì)胞株快速解凍,加入RPMI-1640培養(yǎng)液(含10%小牛血清及1%的青霉素鏈霉素雙抗),混勻后置于離心機(jī)中,1 000 rpm/min離心5 min,棄上清,用8 ml配好的RPMI-1640重懸細(xì)胞并吹打混勻,將細(xì)胞懸液移至培養(yǎng)瓶中,于37℃、5% CO2、濕度 85%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞,待瓶底鋪滿時(shí)棄上清,用高溫滅菌的1×PBS洗滌3次,加入2 ml胰蛋白酶,常溫靜置4 min,棄去胰蛋白酶,用含10%FBS的1640培養(yǎng)液終止消化,反復(fù)吹打后將細(xì)胞懸液置于15 ml離心管,1 000 rpm/min離心5 min,獲得細(xì)胞沉淀。轉(zhuǎn)染前24 h,將肝癌HepG2細(xì)胞接種于6孔板中,待細(xì)胞長到80%匯合度時(shí),按照LipofectamineTM2000試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)操作說明書將不同濃度的miR-127-3p mimic(10、20、50 pmol)(廣州市銳博生物科技有限公司)和LipofectamineTM2000混合均勻,用完全培養(yǎng)基定容至2 ml,8 h后更換新鮮培養(yǎng)基,48 h后收集細(xì)胞提取總RNA檢測轉(zhuǎn)染效率及進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)。對照組(0 pmol miR-127-3p mimic)加等量Opti-MEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

1.4 HepG2細(xì)胞中miR-127-3p表達(dá)量檢測 取各組轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞,以RTFQ-PCR檢測miR-127-3p表達(dá)量,具體操作方法同癌癥組織與癌旁組織miR-127-3p相對表達(dá)量檢測步驟。

1.5 MTT法檢測各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖情況 收集10、20、50 pmol miR-127-3p mimic轉(zhuǎn)染組及對照組細(xì)胞,0.25%胰酶消化后重懸,按照2.0×104個(gè)/ml接種至96孔板,每組5個(gè)復(fù)孔,培養(yǎng)至48 h時(shí),加入新鮮制備的20 μl MTT溶液(5 mg/ml)(武漢普諾賽生命科技有限公司),同條件培養(yǎng)4 h后棄去上層培養(yǎng)液,各孔加入150 μl DMSO溶液,振蕩至紫色結(jié)晶充分溶解,使用酶標(biāo)儀于波長570 nm處測定各孔的光密度(optical density,OD)值。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。細(xì)胞增殖率=(OD試驗(yàn)-OD空白)/(OD對照-OD空白)×100%。

1.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力 用馬可筆在6孔板背后劃均勻平行的橫線,間隔約1 cm,橫穿過孔,每孔至少穿過5條線,在孔中加入5×105個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)基,次日待細(xì)胞鋪滿孔底后,使用槍頭垂直于馬可筆的橫線劃痕,PBS漂洗細(xì)胞3次,去除劃下的細(xì)胞,加入無血清培養(yǎng)基,于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),于48 h取出,于倒置顯微鏡下觀測拍照,測量周邊細(xì)胞向劃痕區(qū)域中央遷移的距離。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力 提前將Matrigel基質(zhì)膠均勻平鋪于上室,消化收集各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞,用無血清培養(yǎng)基重懸,將含7×104個(gè)細(xì)胞的無血清細(xì)胞懸液200 μl添加至小室上層,小室下層添加含10% FBS的血清DMEM培養(yǎng)基作為誘導(dǎo)物,常規(guī)培養(yǎng)48 h后終止培養(yǎng),用體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min,擦去小室內(nèi)室膜上的細(xì)胞,1%結(jié)晶紫染色30 min,輕輕擦去小室上層未穿膜細(xì)胞,用自來水清洗后于室溫晾干,用Olympus顯微鏡(200×)隨機(jī)選取3個(gè)視野計(jì)算穿膜細(xì)胞并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織與癌旁組織miR-127-3p表達(dá)量比較 見表1。

表1 肝癌組織與癌旁組織miR-127-3p表達(dá)量比較

2.2 各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞miR-127-3p表達(dá)量比較 見表2。

表2 各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞miR-127-3p表達(dá)量比較

2.3 各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖情況比較 見表3。

表3 各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖情況比較

2.4 各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞遷移能力比較 見表4。各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞遷移形態(tài)見圖1。

圖1 各轉(zhuǎn)染組miR-127-3p對肝癌HepG2細(xì)胞遷移的影響

表4 各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞遷移能力比較

2.5 各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞侵襲能力比較 見表5。各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞結(jié)晶紫染色見圖2。

圖2 各轉(zhuǎn)染組miR-127-3p對肝癌HepG2細(xì)胞侵襲的影響(結(jié)晶紫染色×200)

表5 各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞侵襲能力比較

3 討論

HBV感染作為肝細(xì)胞癌的主要病因已被世界公認(rèn),每年0.4%～0.6%的HBV慢性感染者被診斷為肝癌,其危險(xiǎn)程度遠(yuǎn)高于非感染者[7]。miRNA是一類長19～25 nt的非編碼微小RNA,作為基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子,是基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的核心成分,廣泛存在于從病毒到人類的各種生物中,近年來逐漸被報(bào)道廣泛參與包括細(xì)胞生長、增殖、分化凋亡等多種生物進(jìn)程,包括腫瘤的形成,且不同miRNA在不同的腫瘤中發(fā)揮不同作用,包括致癌和抑癌作用[8]。miRNA與HBV相關(guān)性肝癌的發(fā)生發(fā)展具有密切關(guān)系,但其表達(dá)存在顯著差異,作用機(jī)制也多有不同。因此明確HBV感染引起肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生機(jī)制、尋找新的早期診斷指標(biāo)以及治療靶標(biāo)具有重要作用。

miR-127-3p是人類miR-127基因前體可以表達(dá)的成熟miRNA之一,在多種腫瘤組織中均有表達(dá),但表達(dá)程度不同[9]。典輝等[10]報(bào)道顯示,miR-127-3p在乳腺癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織,認(rèn)為其在乳腺癌中發(fā)揮促癌作用。但多數(shù)研究均顯示[11,12],miR-127-3p是一種腫瘤抑制因子,可通過不同信號通路抑制葡萄膜黑色素瘤、人骨肉瘤等腫瘤細(xì)胞的增殖。如Ji等[13]研究報(bào)道顯示口腔鱗狀細(xì)胞癌患者miR-127-3p表達(dá)下調(diào),認(rèn)為miR-127-3p通過影響KIF3B信號通路抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。另有研究報(bào)道稱[14],miR-127-3p通過下調(diào)MAPK4抑制大鼠卵巢癌的增殖。上述文獻(xiàn)報(bào)道證實(shí)miR-127-3p在腫瘤中主要發(fā)揮抑癌作用。本研究結(jié)果表明,HBV相關(guān)性肝癌患者肝癌組織miR-127-3p表達(dá)量低于癌旁組織,提示miR-127-3p在HBV相關(guān)性肝癌患者中低表達(dá),可作為重點(diǎn)篩查指標(biāo),以提前預(yù)警并監(jiān)測肝癌的發(fā)生。

據(jù)報(bào)道,肝癌發(fā)生的潛在機(jī)制是肝細(xì)胞中載脂蛋白B mRNA編輯酶催化亞基2的過表達(dá)誘導(dǎo)的抑癌基因突變[15]。miRNA可通過靶向HBV基因表達(dá)所需的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子或通過直接結(jié)合HBV轉(zhuǎn)錄物來調(diào)節(jié)HBV轉(zhuǎn)錄水平的感染[16]。Li等[17]研究顯示,miR-122可以特異性結(jié)合酶催化亞基2 mRNA的3′-非翻譯區(qū)(3′UTR),從而抑制肝癌細(xì)胞的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示,上調(diào)miR-127-3p表達(dá)后,肝癌HepG2細(xì)胞增殖率降低,遷移距離減小,穿膜細(xì)胞數(shù)減少,說明miR-127-3p參與了HBV陽性肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,并呈負(fù)調(diào)控作用,與張玉蓉等[18]研究結(jié)果基本一致,證實(shí)miR-127-3p在HBV陽性肝癌中發(fā)揮抑癌作用。推測其作用機(jī)制可能與miR-127-3p可靶向下調(diào)MAPK4表達(dá),抑制其下游蛋白MAPKAPK5及HSPB1磷酸化有關(guān)[19]。

綜上所述,miR-127-3p與HBV相關(guān)性肝癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切,在肝癌患者中呈低表達(dá),可作為重點(diǎn)關(guān)注指標(biāo)。此外,miR-127-3p過表達(dá)可抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力,發(fā)揮抑癌作用,但具體作用機(jī)制仍需更深入挖掘探究,以期發(fā)現(xiàn)肝癌早期診斷及靶向治療的新途徑。