吳倩君 辜咪思 吳文煜 尤 潔 韓梅芳

華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院感染科 (湖北 武漢,430000)

慢性乙型肝炎(CHB)是嚴重危害我國人民健康的重大傳染性疾病,我國學(xué)者在2019年《慢性乙型肝炎臨床治愈(功能性治愈)專家共識》中指出[1],臨床治愈又稱功能性治愈,指患者療程結(jié)束時,血清HBsAg及HBV DNA檢測不到,且HBeAg陰轉(zhuǎn),伴或不伴HBsAb產(chǎn)生。國內(nèi)外指南均推薦將臨床治愈作為當前CHB患者治療的理想目標[1-3]。對于HBeAg陽性患者,血清HBsAg定量在一定程度上可以反映肝細胞HBV cccDNA的水平[4]。近年來,有研究顯示血清HBV RNA定量與抗病毒療效密切相關(guān)[5,6]。

目前,臨床上常用的抗病毒治療方案包括核苷(酸)類似物(NA)和聚乙二醇干擾素(Peg-IFN),國內(nèi)外諸多臨床試驗表明NA與Peg-IFN聯(lián)合治療比NA單藥治療有更大的優(yōu)勢,或可提高HBsAg清除率。本研究選取既往使用NA治療1年以上的患者,予以恩替卡韋(ETV)聯(lián)合聚乙二醇干擾素α-2b(Peg-IFNα-2b)治療96周,比較96周治療結(jié)束時臨床治愈組和非臨床治愈組的病毒學(xué)特征,分析干擾素治療對乙型肝炎病毒學(xué)指標的影響,現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究于2014年12月至2018年1月期間,按照入排標準納入122例符合條件且自愿參與本研究的CHB患者,入組標準:符合“慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)”診斷標準[7];既往接受NA治療1年以上(NA治療前HBV DNA≥104copies/ml,且ALT≥2倍正常值上限);年齡18～65周歲;HBV DNA<103copies/ml、HBsAg<3 000 IU/ml。排除標準:妊娠婦女或哺乳期婦女;本研究前6個月內(nèi)接受過抗腫瘤或免疫調(diào)節(jié)治療;其他活動性病毒性肝炎和/或HIV感染;急性嚴重肝損害,即ALT≥10倍正常值上限;肝硬化(肝臟彩超診斷)、腹水、失代償肝病、自身免疫性肝病、有肝性腦病病史、食管靜脈曲張出血病史;重要臟器功能不全(心、肺、腎);惡性腫瘤;自身免疫性疾病;神經(jīng)精神疾病;血糖控制不佳的糖尿病;眼底病變;或其他不適合使用干擾素的疾病。本研究項目獲得華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院倫理委員會批準(倫理批件號NCT02327416)。所有研究對象均在篩選前簽署知情同意書。

1.2 治療方法 入組患者給予Peg-IFNα-2b(商品名派格賓,規(guī)格:180 μg/支)皮下注射,180 μg/次,每周1次,0～96周,同時,口服ETV(商品名維力青,江西青峰制藥有限公司,規(guī)格:0.5 mg/片),每日1片,0～48周,48周后停用ETV。

1.3 觀察指標與方法

1.3.1 一般信息 收集入組患者身高、性別、乙型肝炎家族史、治療史等。

1.3.2 病毒學(xué)指標 HBsAg定量及HBeAg定量檢測均采用電化學(xué)發(fā)光法,分別使用羅氏免疫分析Ⅱ型乙型肝炎表面抗原定量檢測試劑(檢測下限為0.05 IU/ml,低于下限者統(tǒng)計時按照最低下限值計算)、雅培乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)檢測試劑(S/CO>1.0為陽性,S/CO<1.0為陰性)進行檢測。HBV DNA采用羅氏Cobas Taqman核酸檢測試劑進行檢測,檢測下限為20 IU/ml,低于下限者統(tǒng)計時按照最低下限值計算。HBV RNA使用基于TaqMan探針法的逆轉(zhuǎn)錄-定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)進行檢測,根據(jù)《慢性HBV感染者血清HBV RNA檢測及臨床應(yīng)用的專家共識》推薦[5],參考相關(guān)研究設(shè)計探針[8]:F:5′-AGACCACCAAATGCCCCTATC-3′,R:5′-AGGCGAGGG-AGTTCTTCTTCTA-3′;Probe:5′FAM-CAACACTTCCGGA-RACTACTGTTGTTAGACG-3′BHQ1,檢測下限為1 000 copies/ml,低于下限者統(tǒng)計時按照最低下限值計算。所有患者96周血清樣本均行HBsAg定量及HBV DNA定量檢測,由于樣本量有限,101例患者行HBV RNA檢測,118例患者行HBeAg定量檢測。

1.3.3 其他檢查 每12周隨訪1次,完善血常規(guī)、血生化、肝臟彩超、肝臟硬度值檢查(結(jié)果用Fibroscan表示),記錄患者一般情況,必要時調(diào)整藥物劑量。

1.4 療效判定標準 本研究根據(jù)患者96周時檢測結(jié)果,將96周時HBV DNA<20 IU/ml,且HBsAg<0.05 IU/ml的患者定義為“臨床治愈組”[1];不滿足該條件者,則定義為“非臨床治愈組”。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析;使用GraphPad Prism 9.0繪制圖形。計量資料比較使用t檢驗或Mann-Whitney U檢驗;計數(shù)資料比較使用卡方檢驗,P<0.05說明差異有統(tǒng)計學(xué)意義。相關(guān)性分析使用Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 基線特征比較 本研究共篩選211例CHB患者,排除89例不符合入組標準者,最終納入122例患者,其中,男性患者107例,女性患者15例。96周時,122例患者均按時隨訪。達到臨床治愈患者43例(35.25%),均按照方案完成干擾素治療96周。未達到臨床治愈患者79例(64.75%),其中3人未完成96周干擾素治療方案,僅進行12～24周干擾素治療,因不良反應(yīng)結(jié)束干擾素治療,予以NA單藥治療。臨床治愈組患者與非臨床治愈組患者基線一般特征比較見表1所示。兩組患者性別、年齡、病程、乙型肝炎家族史、合并脂肪肝比例、HBeAg陽性比例、HBeAg定量、HBV DNA陽性比例、HBV DNA定量、ALT、Fibroscan水平在基線時比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),臨床治愈組患者基線HBsAg定量低于非臨床治愈患者,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義[(2.507±0.44)vs(2.875±0.44)log 10 IU/ml,P<0.001]。另外,臨床治愈組患者復(fù)雜治療史(定義為患者在入組之前有除ETV以外其他NA藥物治療史)比例(93.02%)高于非臨床治愈組(53.16%),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

表1 臨床治愈組與非臨床治愈組基線時的臨床特征比較

2.2 臨床治愈組與非臨床治愈組HBsAg定量的動態(tài)變化 對干擾素治療的兩組患者各訪視點(包括基線、治療24周、48周、72周和96周)的HBsAg定量進行比較發(fā)現(xiàn),從治療12周至96周,與非臨床治愈組相比,臨床治愈組各訪視點HBsAg定量水平顯著降低,詳見表2。96周治療終點時,臨床治愈組所有患者均實現(xiàn)HBsAg<0.05 IU/ml,較基線明顯降低[(-1.301±0.000)vs(2.507±0.440),P<0.001]。非臨床治愈組患者治療96周時HBsAg滴度均值為1.743 log 10 IU/ml,較治療基線HBsAg滴度(2.875 log 10 IU/ml)也有明顯降低。兩組患者的HBsAg從基線到96周變化趨勢如圖1所示,在24周、48周、72周和96周,臨床治愈組與非臨床治愈組相比HBsAg定量水平明顯降低。臨床治愈組HBsAg定量0～24周、24～48周下降幅度分別為2.379 log 10 IU/ml和1.035 log 10 IU/ml,而非臨床治愈組HBsAg定量0～24周、24～48周下降幅度分別為0.715 log 10 IU/ml和0.417 log 10 IU/ml,提示早期(尤其是0～24周)臨床治愈組患者HBsAg下降明顯,48周后兩組患者HBsAg下速度均趨于平緩。

圖1 Peg-IFNα-2b治療期間臨床治愈與非臨床治愈患者HBsAg變化趨勢

表2 基線至96周臨床治愈組和非臨床治愈組HBsAg定量的比較

2.3 臨床治愈組與非臨床治愈組病毒學(xué)指標比較 對臨床治愈組與非臨床治愈組患者使用Peg-IFNα-2b治療終點(96周)時的病毒學(xué)指標分析,顯示:與非臨床治愈組相比,臨床治愈組患者的HBsAg定量明顯降低,兩組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義[(1.455±1.288)vs(-1.301±0)log 10 IU/ml,P<0.000 1],見圖2A;在HBeAg定量方面,臨床治愈組患者[(-0.235±0.466)log 10 S/CO]均值低于非臨床治愈組患者[(-0.157±0.486)log 10 S/CO],但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.318),見圖2B。所有患者在96周時均實現(xiàn)病毒學(xué)抑制,即HBV DNA低于檢測下限(20 IU/ml),二者不具有差異性,見圖2C。臨床治愈組與非臨床治愈組患者中分別有14例(33.33%)及8例(10.13%)HBV RNA低于檢測下限(<1 000 copies/ml),并且臨床治愈組患者HBV RNA定量顯著低于非臨床治愈組患者[(4.229±1.26)vs(4.906±0.93)log 10 copies/ml,P=0.009 4],差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,如圖2D所示。

圖2 Peg-IFNα-2b治療96周時臨床治愈組與非臨床治愈組患者病毒學(xué)指標比較

2.4 Peg-IFNα-2b治療96周時HBV RNA水平與HBsAg和HBeAg定量的相關(guān)性分析 通過相關(guān)性分析表明,對于所有患者,HBV RNA水平與HBsAg定量存在一定的正相關(guān),r=0.224,P=0.024,如圖3A所示;HBV RNA水平與HBeAg定量存在顯著正相關(guān),r=0.321,P=0.001,如圖3B所示。

圖3 Peg-IFNα-2b治療96周時HBV RNA水平與HBsAg和HBeAg定量的相關(guān)性分析

3 討論

CHB患者如何實現(xiàn)臨床治愈是近年來國內(nèi)外肝病學(xué)者共同關(guān)注的問題。多項研究表示,即使是實現(xiàn)病毒學(xué)應(yīng)答的患者,同樣有進展為肝硬化、肝癌的風險[9,10]。由于機體免疫耐受的存在,加之HBV整合、cccDNA難以清除等原因,導(dǎo)致單藥治療CHB患者臨床治愈率較低,對于CHB臨床治愈的方案需要更多探索。多項臨床研究表明,應(yīng)用NA聯(lián)合Peg-IFNα-2b治療可提高機體免疫功能,激活免疫應(yīng)答,促進宿主體內(nèi)HBV相關(guān)T細胞功能恢復(fù),能有效降低HBsAg水平,提高臨床治愈率[11,12]。本研究采用ETV聯(lián)合序貫Peg-IFNα-2b治療的新方案,于治療終點(96周)時有35.25%患者達到臨床治愈,且無患者出現(xiàn)嚴重并發(fā)癥而退出,提示本研究方案對核苷經(jīng)治CHB患者具有明顯療效,能顯著提高臨床治愈率,且安全性良好。

本研究對干擾素治療的兩組患者進行HBsAg定量比較,發(fā)現(xiàn)臨床治愈組患者在治療過程中(包括基線、治療24周、48周、72周和96周)HBsAg定量均顯著低于非臨床治愈組,表明患者在不同階段的HBsAg定量均與其96周療效相關(guān),在24周或48周HBsAg下降的患者,其96周時治療效果顯著。臨床治愈組的患者基線HBsAg較低,經(jīng)過Peg-IFNα-2b抗病毒治療96周全部獲得臨床治愈,提示基線HBsAg的低水平與干擾素臨床治愈密切相關(guān)。在Peg-IFNα-2b使用早期,(即本研究0～24周),臨床治愈組患者較非臨床治愈組患者HBsAg定量下降幅度尤為明顯(見圖1),這與我們前期OSST研究和Endeavor研究的結(jié)論相符,即干擾素治療前HBeAg陰性且HBsAg<1 500 IU/ml的患者更有可能實現(xiàn)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)化及HBsAg清除(OSST研究)[13],干擾素治療24周HBsAg下降明顯的患者,臨床治愈率更高(Endeavor研究)[14]。Marcellin等[15]發(fā)現(xiàn),對于使用Peg-IFNα-2b治療的患者,若治療前12周HBsAg定量下降較慢,可能預(yù)示難以實現(xiàn)病毒學(xué)應(yīng)答(即HBV DNA低于檢測下限),而HBsAg定量快速下降可預(yù)示更容易實現(xiàn)HBsAg清除,這與本研究結(jié)論一致。另外有研究表明,Peg-IFNα-2b在確定療程之后(通常為48周),仍可持續(xù)發(fā)揮作用,使得患者HBsAg定量進一步降低[4]。

本研究中,所有患者經(jīng)過干擾素治療,在治療終點96周時HBV DNA定量均低于檢測下限(20 IU/ml),但非臨床治愈組HBV RNA定量顯著高于臨床治愈組[見圖2D,(4.906±0.93)vs(4.229±1.26)log 10 copies/ml,P=0.009 4],提示臨床治愈患者,其血清HBV RNA含量明顯減低,HBV RNA有可能成為有效預(yù)測和評估臨床抗病毒療效的病毒學(xué)指標。CHB患者血液中的HBV RNA主要來源于包裹在核衣殼內(nèi)的HBV前基因組RNA(pregenomic RNA,pgRNA),除此之外,還包括pgRNA剪接變異體及3′端截斷體[5,16]。對于長期使用抗病毒藥物實現(xiàn)病毒學(xué)應(yīng)答的患者來說,HBV DNA檢測不再是評估治療效果的唯一檢測指標。近年來,HBV RNA檢測逐漸為人們重視,我國首次發(fā)布有關(guān)HBV RNA檢測指南[5],提出血清HBV RNA水平可作為反映肝內(nèi)cccDNA存在和轉(zhuǎn)錄活性的指標。Fan等[6]研究表明,在同樣實現(xiàn)HBsAg清除的患者中,HBV RNA陰性的患者其病毒學(xué)復(fù)發(fā)率明顯低于HBV RNA陽性患者?？梢?HBV RNA可以預(yù)測臨床治愈患者的病毒學(xué)復(fù)發(fā),而HBV DNA作為病毒學(xué)檢測指標尚存在一定的局限性,兩者可以互補。近年來,其他新型血清學(xué)標志物,包括乙型肝炎病毒核心相關(guān)抗原、抗HBc抗體等與臨床療效的關(guān)系引起了廣泛關(guān)注,我們前期的研究發(fā)現(xiàn),治療終點HBcrAg<4 log 10 U/mL且HBsAb >2 log 10 IU/L模型有助于識別可能實現(xiàn)持久功能性治愈的患者[17],但未進行HBV RNA定量方面的探索。因此,本研究進行了HBV RNA定量等病毒學(xué)方面的檢測和分析,發(fā)現(xiàn)對于核苷經(jīng)治的CHB患者,采用干擾素治療時,治療末期HBV RNA水平有助于評估干擾素抗病毒療效,可彌補HBV DNA定量的不足,具有重要的臨床價值。

Wang等[18]發(fā)現(xiàn),對于未經(jīng)治療的CHB患者,其體內(nèi)HBV RNA水平與HBsAg定量呈正相關(guān),而使用抗病毒治療后,其相關(guān)性下降。李小鵬等[19]分析CHB患者血清HBV RNA與HBsAg、HBeAg相關(guān)性時發(fā)現(xiàn),血清HBV RNA水平與HBsAg定量無顯著相關(guān)性,與HBeAg定量呈顯著正相關(guān)。本研究就治療終點HBV RNA與HBsAg和HBeAg定量進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),HBV RNA與HBeAg定量存在顯著正相關(guān),(見圖3B,r=0.321,P=0.001),HBV RNA與HBsAg定量存在一定相關(guān)性,(見圖3A,r=0.224,P=0.024),這與既往研究結(jié)論一致。

綜上,本研究數(shù)據(jù)顯示,對于核苷經(jīng)治的CHB患者,采用Peg-IFNα-2b治療96周,可提高CHB患者臨床治愈率,有效改善CHB患者預(yù)后,且安全性高。對于使用Peg-IFNα-2b治療早期出現(xiàn)HBsAg定量下降幅度較大的患者,后期更有可能實現(xiàn)HBsAg清除,這部分患者治療48周以上可以獲得更好的療效。臨床治愈患者,其96周HBsAg定量和HBV RNA定量均顯著低于非臨床治愈患者,提示HBV RNA有助于評估HBsAg陰轉(zhuǎn)患者的抗病毒療效。相信隨著臨床研究的深入開展,將能獲得更多有效評估抗病毒療效的血清學(xué)標志物。