楊菊輝

（哈藥集團(tuán)制藥六廠，黑龍江哈爾濱 150056）

維生素K 是一類具有葉綠醌生物活性的萘醌基團(tuán)的衍生物。維生素K1是食物中維生素K 的重要來源，存在于綠色植物中；維生素K2在動(dòng)物體內(nèi)具有生物活性，主要由腸道細(xì)菌合成，具利尿、強(qiáng)化肝臟的解毒功能、降血壓的作用，多用于維持凝血時(shí)間、加速凝血、治療維生素K 缺乏引起的出血癥，可以預(yù)防治療骨質(zhì)疏松癥，增強(qiáng)骨密度，防止骨折。1995 年，日本首次將維生素K2應(yīng)用于臨床治療骨質(zhì)疏松[1]。2009 年，歐盟通過了2009/345/EC 決議，批準(zhǔn)維生素K2作為食品配料，并投放市場[2]。美國藥典委員會(huì)發(fā)布的《2015 年膳食補(bǔ)充劑綱要》支持維生素K2開發(fā)的準(zhǔn)入標(biāo)準(zhǔn)[3]。2016 年，我國衛(wèi)計(jì)委發(fā)布《關(guān)于海藻酸鈣等食品添加劑新品種的公告（2016年第8 號(hào)）》將維生素K2（MK-7）列入了食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑新品種[4]。

基于維生素K2的生理功能，人們越來越重視它的攝入，目前國內(nèi)外尚沒有關(guān)于食品中維生素K的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法發(fā)布，國內(nèi)相關(guān)公告中提供了維生素K2含量的測定方法，我國衛(wèi)計(jì)委2016 年第8 號(hào)公告、國家衛(wèi)健委2019 年第6 號(hào)公告、國家衛(wèi)健委2020 年第9 號(hào)公告《蟬花子實(shí)體（人工培植）等15 種“三新食品”的公告》分別批準(zhǔn)來自發(fā)酵法工藝和合成法工藝生產(chǎn)的維生素K2（MK-7）作為營養(yǎng)強(qiáng)化劑使用，原國家食藥總局2016 年第205 號(hào)公告規(guī)定了保健食品中維生素K2的使用范圍和使用量?！妒称钒踩珖覙?biāo)準(zhǔn) 運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)食品通則》（GB 24154—2015）中規(guī)定了運(yùn)動(dòng)后恢復(fù)類、骨關(guān)節(jié)恢復(fù)類運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)食品中可選擇添加維生素K2，其檢測方法參考使用《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中維生素K1的測定》（GB 5009.158—2016）中的高效液相色譜-熒光檢測法，此方法簡便、靈敏度高、選擇性高。維生素K2常見的檢測方法主要包括液相色譜紫外檢測法[5]、液相色譜熒光檢測法[6]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法[7]等。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

異丙醇、色譜醇，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；甲醇，色譜純，北京迪馬科技有限公司；維生素K2對(duì)照品（批號(hào)R080LD，97.8%），執(zhí)行美國藥典標(biāo)準(zhǔn)。

分析天平，MS205D；高效液相色譜儀，e2695泵，2489 檢測器，美國Waters 公司；數(shù)控超聲波清洗器，KQ-100DE，昆山市超聲儀器有限公司；離心機(jī)，KL04A；湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

100 μg·mL-1維生素K2標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：取維生素K2對(duì)照品，精密稱定10 mg，置于100 mL 棕色容量瓶中，加入異丙醇，充分溶解，定容至刻度線，0 ～4 ℃保存。

5 μg·mL-1維生素K2標(biāo)準(zhǔn)工作液：精密吸取5 mL維生素K2標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于100 mL 棕色容量瓶中，加異丙醇稀釋，定容至刻度線，搖勻。

1.3 試樣制備

取20 片多種維生素片，研細(xì)，混勻，稱取約6 g的試樣，精密稱定，置于50 mL 離心管中，加異丙醇20 mL，渦旋3 min，溫度≤50 ℃超聲30 min，冷卻至室溫，3 000 r·min-1離心5 min，取上清液，用0.45 μm 濾膜過濾，得供試品溶液，操作過程注意避光。

1.4 色譜條件

色譜柱：C18ODS 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），內(nèi)裝C18填充物；檢測器：紫外檢測器，波長254 nm；色譜流動(dòng)相：甲醇；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：50 μL；柱溫：50 ℃。

1.5 測定

分別注射50 μL 維生素K2標(biāo)準(zhǔn)工作溶液、50 μL供試品溶液，得到標(biāo)準(zhǔn)品和供試品溶液中維生素K2峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算。

1.6 計(jì)算公式

樣品中維生素K2的計(jì)算公式為

X=C×V/M（1）

式中：X為樣品中維生素K2的含量，μg；C為供試品中維生素K2的質(zhì)量濃度，μg·mL-1；V為供試品的體積，mL；M 為供試品的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 專屬性

取陰性空白輔料（不含有維生素K2），按供試品同法處理得空白溶液。取空白溶液、標(biāo)準(zhǔn)工作液、供試品溶液，按1.4 色譜條件檢測?？瞻纵o料在主峰位置無吸收，主成分峰色譜前后雜質(zhì)分離良好，該方法專屬性良好。

2.2 線性關(guān)系與范圍

精密吸取維生素K2標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，按標(biāo)準(zhǔn)液25%、50%、100%、150%和200%濃度水平制備梯度曲線，依法測定，以不同稀釋倍數(shù)的溶液濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，線性回歸處理，計(jì)算回歸方程及線性相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表1。線性相關(guān)系數(shù)0.998 2，在1.25 ～10.00 μg·mL-1線性關(guān)系良好。

表1 維生素K2 含量測定方法線性關(guān)系試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.3 準(zhǔn)確度

取維生素K2對(duì)照品與試樣樣品，按50%加標(biāo)回收法平行制備6 份供試品溶液，依法測定，計(jì)算回收率，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD），結(jié)果見表2，方法回收率良好。

表2 維生素K2 含量測定方法準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

2.4 精密度

2.4.1 重復(fù)性精密度

取試樣樣品6 份，按1.3 平行制備供試品溶液，分別檢測維生素K2的含量，計(jì)算得RSD 為1.69%，詳見表3。

表3 維生素K2 含量測定方法重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.4.2 中間精密度

同一樣品，由2 名實(shí)驗(yàn)人員在不同日期分別取樣6 份，使用不同的高效液相色譜儀（島津）依法測定維生素K2含量，計(jì)算RSD 值，結(jié)果見表4。計(jì)算12 個(gè)檢驗(yàn)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差來驗(yàn)證中間精密度，結(jié)果為1.70%，表明檢測方法的重復(fù)性和精密度良好。

表4 維生素K2 含量測定方法中間精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.5 檢出限與定量限

檢出限：折到3 倍信噪比時(shí)的濃度；定量限：折到10 倍信噪比時(shí)的濃度。本方法檢測多種維生素片中維生素K2檢出限為0.06 μg·g-1，定量限為0.20 μg·g-1。

2.6 穩(wěn)定性

取2.4.1 中樣品，分別于0 h、12 h、24 h 進(jìn)樣，考察樣品溶液穩(wěn)定性。由表5 可知，RSD 值為0.63%，說明本品測定方法耐用性良好。

表5 維生素K2 含量測定方法溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.7 試樣驗(yàn)證

按照1.3 制備兩個(gè)樣品1#，2#，按此法檢測維生素K2含量，結(jié)果見表6。經(jīng)過驗(yàn)證，試樣檢測的精密度符合要求。

表6 試樣中維生素K2 含量結(jié)果

2.8 系統(tǒng)重復(fù)性、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、試樣的色譜圖

按照1.4液相色譜條件檢測樣品和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以色譜峰外標(biāo)法進(jìn)行定量，系統(tǒng)適用性重疊色譜圖見圖1，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖見圖2，試樣色譜圖見圖3。

圖1 系統(tǒng)適用性重疊色譜圖

圖2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖

圖3 試樣色譜圖

3 結(jié)論

本研究建立了高效液相色譜法檢測多種維生素片中維生素K2含量的方法，本方法專屬性良好，在1.25 ～10.00 μg·mL-1線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)為0.998 2，重復(fù)性實(shí)驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.69%，50%加標(biāo)回收率為92.21%～100.22%，檢出限為0.06 μg·g-1，定量限為0.20 μg·g-1。該方法精密度和準(zhǔn)確度良好，靈敏度高，分離度好，可用于多種維生素片中維生素K2含量的研究，本文為保健食品中維生素K2的檢測、質(zhì)控、監(jiān)管提供了技術(shù)支撐。