劉鴿，趙博，劉揚，李俊達，孫旭紅，付樹志，楊可青，郝佳瑞，劉惠榮

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

黃芪（Astragalus membranaceus）屬豆科多年生草本植物，是我國大宗常用滋補類中藥材，具有固表補氣、托毒生肌、利水消腫、降血糖及抗病毒等功效[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究及臨床應(yīng)用表明，黃芪中的活性成分可起到抗腫瘤、抗衰老、多靶點免疫調(diào)節(jié)等作用，已被廣泛用于相關(guān)疾病治療。

根際是土壤-根系-微生物三者緊密結(jié)合且相互影響的場所，不同植物都有其特定的根際微生物組群。相關(guān)研究表明，根際微生物群落中的不同微生物能夠與植物進行互作，在促進植物生長、抑制土傳病害、平衡土壤養(yǎng)分及提升養(yǎng)分利用率等方面具有重要意義[2]。目前科研工作人員對黃芪的研究側(cè)重于黃芪的活性成分，僅有少量學(xué)者對黃芪根際微生物群落做了相關(guān)研究。此外，前人未曾對內(nèi)蒙古固陽縣不同生長年限黃芪根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)進行研究。固陽縣位于內(nèi)蒙古中西部，典型的半干旱大陸性氣候有利于黃芪有效成分的積累。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，內(nèi)蒙古黃芪生態(tài)種植主要集中在固陽縣及其周邊，且“固陽黃芪”已被國家核準注冊為中國地理標(biāo)志商標(biāo)。目前，由于黃芪市場需求增加、多年生黃芪種植成本高及易感病，當(dāng)?shù)攸S芪種植年限縮短至2 年。因此本試驗采用高通量測序技術(shù)，對內(nèi)蒙古固陽縣不同種植年限黃芪的根際微生物進行多樣性分析，以期為黃芪種植及開發(fā)黃芪功能微生物提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

PowerSoil DNA Kit 試劑盒，美國QIAGEN 公司；LSC-373G 型4 ℃冰箱，浙江星星冷鏈股份有限公司；DW-HL398S 型-80 ℃低溫冷凍箱，中科美菱低溫科技股份有限公司；SX-500 高溫高壓滅菌鍋，日本TOMY 公司；SW-CJ-1FD 型超凈無菌工作臺，蘇州凈化公司；ABI GeneAmp?9700 型PCR 儀，美國ABI 公司；DYY-6C 電泳儀，北京六一生物科技有限公司。

1.2 采樣區(qū)概況及樣品采集

供試土樣采于2021 年7 月，來源于固陽縣二年生、三年生黃芪根際。在每個采樣點隨機布設(shè)3 個1.5 m×1.5 m 樣方，每樣方隨機選取5 株植株。采用抖根法收集土樣，用毛刷將緊貼附于根系的土壤裝入無菌自封袋，編號。兩組黃芪根際土壤樣品分別命名為Ⅱ-TYB（二年生黃芪根際土壤，取樣地海拔1 550 m，位于北緯41°06′59″、東經(jīng)110°18′54″）、Ⅲ-TYA（三年生黃芪根際土壤，取樣地海拔1 540 m，位于北緯41°06′56″、東經(jīng)110°18′25″）。將樣品迅速放入4 ℃冰盒保存，及時帶回實驗室，將采集的土樣分別放入4 ℃與-80 ℃冰箱保存。

1.3 土壤微生物基因組DNA 的提取、PCR 擴增及測序

利用PowerSoil DNA Kit 試劑盒提取根際土壤微生物總DNA，使用NanoDrop 2000 檢測DNA 濃度和純度。用引物338 F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806 R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'） 擴增細菌16S rDNA 序列的V3-V4 區(qū)，用引物ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和引物ITSIF2R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）擴增真菌ITS1區(qū)。PCR 反應(yīng)體系：10×Buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，rTaq 聚合酶0.2 μL，兩條引物（5 μmol/L）各0.8 μL，DNA 模 版10 ng，BSA 0.2 μL，ddH2O 補 足至20 μL。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s（細菌27 個循環(huán)、真菌35 個循環(huán)），72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物的片段及長度，并對合格產(chǎn)物進行純化、定量，對純化后的PCR 產(chǎn)物建庫，質(zhì)檢合格后使用Illumina Miseq PE300 平臺進行測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計

對所得原始測序序列進行質(zhì)控拼接，根據(jù)97%相似度對序列進行OTU 聚類并剔除嵌合體。利用RDP classifier 對每條序列進行物種分類注釋，比對Silva 16S rRNA 數(shù)據(jù)庫（Release 138）及Unite 真菌數(shù)據(jù)庫（Release 8.0），設(shè)置置信度閾值為70%。并統(tǒng)計每個樣本在不同物種分類水平下的群落組成?；跍y序的數(shù)據(jù)，采用mothur 軟件計算Alpha 多樣性、Chao、Shannon指數(shù)等，采用Wilxocon 秩和檢驗進行Alpha 多樣性的組間差異分析；采用Wilxocon 秩和檢驗在屬水平進行組間差異顯著性檢驗，確定豐度顯著差異的微生物。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同年份黃芪根際土壤微生物測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計

本次測序共得到細菌有效序列290 249 條，平均長度約為415 bp，測序質(zhì)量值Q30 為93.38%～93.40%，Q20 為97.77%～97.81%；真菌有效序列321 885 條，平均長度約為235 bp，測序質(zhì)量值Q30 為99.00%～99.43%，Q20 為99.50%～99.72%。細菌、真菌根際樣本經(jīng)過最小樣本序列數(shù)標(biāo)準均一化處理后，分別得到185 538、259 554 條有效序列，在97%的序列相似度水平上，獲得細菌、真菌OTU 數(shù)分別為3 875 個、1 082 個。

2.2 不同年份黃芪根際土壤微生物Alpha 多樣性指數(shù)分析

細菌多樣性指數(shù)中，Ⅱ-TYB 的Chao、Shannon、Simpson 指數(shù)分別為2 883.2、6.186 8、0.008 3，Ⅲ-TYA的Chao、Shannon、Simpson 指數(shù)分別為2 996.5、6.191 0、0.008 9，Ⅲ-TYA 的3 個指數(shù)均高于Ⅱ-TYB，說明細菌群落豐度隨著生長年限的增加而增加，但不同年份黃芪根際細菌多樣性指數(shù)無顯著差異。

真菌多樣性指數(shù)中，不同年份黃芪根際真菌Chao指數(shù)存在顯著差異，隨著時間推移，Chao 指數(shù)升高，真菌群落多樣性增加?？傮w來說，隨著黃芪種植時間的增加，根際微生物豐富度升高。不同年份黃芪根際土壤細菌和真菌覆蓋度均在0.97 以上，說明本研究中測序量和測序深度合理。

2.3 不同生長年限黃芪根際土壤微生物群落組成

2.3.1 細菌群落組成分析

從門水平上看，2 組樣品優(yōu)勢門類主要是放線菌門（Actinobacteriota）、變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteriota），合計占比在80%以上，其中放線菌門與變形菌門所占比例最高，如圖1（a）所示。隨著黃芪年限的增加，土壤中不同細菌門類的相對豐度發(fā)生變化，放線菌門、變形菌門占比相對增加，綠彎菌門與酸桿菌門占比相對降低。屬水平上，主要優(yōu)勢菌屬為節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、芽生球菌屬（Blastococcus）、norank_f__JG30-KF-CM45、微枝形桿菌屬（Microvirga）與類諾卡氏屬（Nocardioides），如圖1（b）所示。各屬在不同生長年限中豐度不同，其中節(jié)桿菌屬與芽生球菌屬在Ⅲ-TYA 樣品中相對豐度最高，分別占5.58%、5.39%，在Ⅱ-TYB 中分別占比5.37%、3.93%。對比可知，隨著黃芪年限增長，節(jié)桿菌屬、芽生球菌屬與微枝形桿菌屬在黃芪根際土壤中比例增加，可能是這3個屬菌株與黃芪植株形成了相對長久穩(wěn)定的關(guān)系。

圖1 黃芪根際細菌在門屬水平上的相對豐度

2.3.2 真菌群落組成分析

從門水平上看，根際土壤真菌優(yōu)勢門類有子囊菌門（Ascomycota）、被孢霉門（Mortierellomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota），如圖2（a）所示。子囊菌門在二年生與三年生黃芪根際土壤真菌中占比分別為82.87%、92.73%，被孢霉門占比分別為11.18%、1.67%，擔(dān)子菌門占比分別為3.97%、4.41%。對比可知，子囊菌門與擔(dān)子菌門豐度呈逐年遞增趨勢，被孢霉門豐度變化則相反。屬水平上，Ⅲ-TYA 中相對豐度較大的物種分別為刺孢屬（Phaeomycocentrospora）、新刺毛莖點霉屬（Neosetophoma）、鏈格孢屬（Alternaria）、赤霉屬（Gibberella），相對豐度依次為24.93%、9.93%、9.08%、7.89%，Ⅱ-TYB 中排名較前的為赤霉屬（Gibberella）、刺孢屬（Phaeomycocentrospora），被孢霉屬（Mortierella）、毛殼霉屬（Chaetomium），相對豐度依次為18.14%、11.67%、11.05%、6.81%，如圖2（b）所示。由此可知，兩組樣品真菌豐度存在較大差異，隨著黃芪的生長，土壤根際真菌的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生一定改變。

圖2 黃芪根際真菌在門屬水平上的相對豐度

2.3.3 組間差異顯著性檢驗

對不同年份黃芪根際土壤樣本中細菌和真菌在屬水平進行組間差異分析（置信區(qū)間為95%，P＜0.05）。如圖3 所示，就細菌而言，未命名屬（norank_f__norank_o__211ds20）僅存在于三年生黃芪根際土壤樣本，存在顯著性差異；二年生黃芪根際土壤中異短鏈球孢菌屬（Allocatelliglobosispora）的豐度顯著高于三年生。真菌方面，三年生黃芪根際土壤組中，Udeniomyces豐度顯著高于二年生同屬的豐度，為三年生黃芪根際土壤獨有，但多孢囊霉屬（Diversispora）的豐度則相反。

圖3 黃芪根際微生物組間差異（屬水平）

3 討論

土壤微生物是陸地生態(tài)系統(tǒng)中植物生產(chǎn)力的關(guān)鍵驅(qū)動因素，研究黃芪根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和豐度變化，對黃芪的種植具有重要意義。本文首次研究了內(nèi)蒙古包頭市固陽縣不同生長年限黃芪根際土壤微生物多樣性的變化規(guī)律，結(jié)果表明，隨著黃芪生長年份的增加，黃芪根際細菌與真菌多樣性均呈增加趨勢，這與康寶玲等[1]研究結(jié)果相似。本研究發(fā)現(xiàn)，不同年限黃芪根際土壤細菌優(yōu)勢門類主要為放線菌門、變形菌門。真菌優(yōu)勢門最豐富的是子囊菌門，其次為被孢霉門、擔(dān)子菌門。牟建平等[3]在研究甘肅的6 個黃芪種植區(qū)根際土中也發(fā)現(xiàn)了同樣的規(guī)律，由此可見不同產(chǎn)地的黃芪根際土壤微生物優(yōu)勢菌門組成具有共性。LI 等[4]在研究陜西省5 個不同種植年限的黃芪根際土中發(fā)現(xiàn)，除變形菌門外，擬桿菌門也為根際主要優(yōu)勢細菌門，且擬桿菌門豐度在1 ～4 年生黃芪根際土中表現(xiàn)出增加趨勢。本研究中放線菌門、變形菌門的占比隨著黃芪生長年限增加均發(fā)生小幅度增加。以往研究表明，放線菌門可參與有機質(zhì)的分解，在植物生長、土壤代謝中發(fā)揮重要作用，變形菌門為藥用植物根際微生物主要類群，且有助于提升藥用植物質(zhì)量和產(chǎn)量，可見此類菌門根際微生物顯著富集可能有利于該地區(qū)黃芪的生長及有效成分積累。本研究發(fā)現(xiàn)子囊菌門、被孢霉門、擔(dān)子菌門是黃芪根際土壤中豐度最大的真菌類群，子囊菌門與擔(dān)子菌門豐度在土壤中呈逐年遞增趨勢，被孢霉門豐度變化則相反。LI 等[4]的研究也發(fā)現(xiàn)子囊菌門在1 ～4 年生的黃芪根際土中呈現(xiàn)出逐年增加趨勢，不同的是，本試驗還發(fā)現(xiàn)擔(dān)子菌門的豐度也會隨年份增加，被孢霉門豐度隨年份減少。眾多研究顯示[5]，子囊菌門與擔(dān)子菌門菌株為關(guān)鍵的真菌分解者，二者比例可影響土壤抗性，抑制枯萎病。可見這些微生物隨年份發(fā)生波動變化，對本地區(qū)黃芪的生長發(fā)育可能具有較大影響。

本研究中，兩樣品根際土壤細菌的主要優(yōu)勢細菌屬均為節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、芽生球菌屬（Blastococcus）、未命名屬（norank_f__JG30-KF-CM45）、微枝形桿菌屬（Microvirga）與類諾卡氏屬（Nocardioides），隨著黃芪種植年限增加，節(jié)桿菌屬、芽生球菌屬與微枝形桿菌屬在黃芪根際土壤中比例增加。前人大量研究已表明[6-7]，節(jié)桿菌屬、類諾卡氏屬與微枝形桿菌屬的菌株均為有益菌。節(jié)桿菌屬具有較強的環(huán)境適應(yīng)性，在環(huán)境污染物的分解代謝中扮演重要角色，具有固氮促生的能力；微枝形桿菌屬為根瘤菌，與植物共生可結(jié)瘤，具有顯著的固氮活性[6]；類諾卡氏屬可用于降解原油、污水治理、生物防護。此外，本研究中，不同樣品存在顯著差異的還有多孢囊霉屬，其在二年生黃芪根際土壤中豐度顯著高于三年生。已有研究發(fā)現(xiàn)[8]，多孢囊霉屬是一類叢枝菌根真菌，菌根真菌可與植物形成菌根互惠共生體，誘導(dǎo)激發(fā)植物體內(nèi)的防御機制，減輕病害對植物造成的傷害。肖龍敏等[9]研究發(fā)現(xiàn)，該菌屬還存在于種植10 年及24 年的枸杞根際土壤中，由此可見此類微生物與植物生長發(fā)育過程有密切聯(lián)系，但對其是否可與固陽黃芪建立共生體系及對黃芪生長和藥用成分的積累有無促進作用仍需要深入研究。

綜上可以看出，固陽黃芪根際微生物中，一些微生物與黃芪的生長發(fā)育可能密切相關(guān)，這些微生物群組具有潛在研究價值，未來可深入研究此類微生物的功能及其影響黃芪根內(nèi)有效成分積累的作用機制。

4 結(jié)論

本文對內(nèi)蒙古包頭市固陽縣不同生長年限黃芪根際土壤微生物多樣性進行研究，發(fā)現(xiàn)隨著黃芪生長年份推移，黃芪根際細菌與真菌多樣性均呈增加趨勢，且兩組樣品真菌豐度存在較大差異。不同生長年限黃芪根際土壤中主要優(yōu)勢細菌均為放線菌門、變形菌門；優(yōu)勢真菌為子囊菌門、被孢霉門、擔(dān)子菌門。放線菌門、變形菌門、子囊菌門與擔(dān)子菌門豐度隨著黃芪生長年限增加均發(fā)生增大。不同生長年限黃芪根際土壤的主要優(yōu)勢細菌屬為節(jié)桿菌屬、芽生球菌屬、未命名屬、微枝形桿菌屬與類諾卡氏屬。二年生黃芪根際土壤優(yōu)勢真菌屬為赤霉屬、刺孢屬、被孢霉屬、毛殼霉屬，三年生優(yōu)勢真菌屬包括刺孢屬、新刺毛莖點霉屬、鏈格孢屬、赤霉屬。刺孢屬豐度隨黃芪生長年份的增加而增加，赤霉屬變化卻相反。