蔡依琳，朱樂(lè)玫，陳彬，李千喜，陳光領(lǐng)

（長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410200）

抑郁癥是最常見(jiàn)的精神障礙疾病之一，對(duì)患者的身心健康具有嚴(yán)重影響，全球約有三億人受到抑郁癥的困擾且發(fā)病率逐年上升[1]。抑郁癥具有高患病率、高復(fù)發(fā)率和高致殘率的特點(diǎn)，對(duì)患者家庭及社會(huì)帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)[2]。

目前為止，抑郁癥以藥物治療為主，盡管進(jìn)行了充分的藥物治療，仍有約1/3 的患者不能達(dá)到臨床痊愈的效果?，F(xiàn)在市場(chǎng)上代表性的抗抑郁西藥種類(lèi)有限，機(jī)制不清晰，且存在復(fù)發(fā)率較高、副作用大和停藥易復(fù)發(fā)等缺陷[3]。中藥具有資源豐富、療效準(zhǔn)確、副作用較小的優(yōu)勢(shì)，因此進(jìn)一步尋找治療抑郁癥的中藥，發(fā)揮中藥在治療抑郁方面的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)是中國(guó)醫(yī)藥事業(yè)的一項(xiàng)重任。

大黃酚（Chrysophanol，CHR）是從中藥大黃、何首烏和虎杖中提取出來(lái)的具有多方面生物治療潛力的蒽醌類(lèi)有效單體[4]，國(guó)內(nèi)外許多研究表明其具有顯著的抗腫瘤、抗氧化、抗炎、神經(jīng)保護(hù)及改善學(xué)習(xí)認(rèn)知功能障礙的作用[5]。特別是大黃酚的神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)作用在近年來(lái)備受關(guān)注，既往研究表明，大黃酚通過(guò)抗氧化、抑制膽堿酯酶活性、提升抗氧化酶活性[6-7]、抑制神經(jīng)元凋亡[8]等作用保護(hù)神經(jīng)及改善學(xué)習(xí)記憶障礙。但是，大黃酚對(duì)由慢性不可預(yù)見(jiàn)性溫和應(yīng)激（Chronic Unpredictable Mild Stress，CUMS）誘導(dǎo)抑郁癥狀的小鼠是否具有行為學(xué)的改善作用和有神經(jīng)保護(hù)功能以及其具體的分子機(jī)制，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。基于此，本研究用CUMS 法來(lái)建立小鼠的抑郁模型，探討大黃酚對(duì)抑郁癥行為學(xué)改善作用及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

H2050R 高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；EL104 萬(wàn)分之一電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；ELx800 全自動(dòng)酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek公司；3-30K 微量高速離心機(jī)，德國(guó)Sigma 公司。

大黃酚（純度＞98%，批號(hào)：AF21022853），成都埃法生物科技有限公司；Tween 80、N,N-二甲基甲酰胺（DMF），上海麥克林生化科技有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）檢測(cè)試劑盒、丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒，沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物科技股份有限公司。

清潔級(jí)BALB/c 雄性小鼠（18 ～22 g），購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，許可證號(hào)：SYXK（湘）2019-0004。實(shí)驗(yàn)前放置在動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

1.2 方法

將小鼠隨機(jī)分為5組，每組8只，分別為空白組（生理鹽水組）、抑郁組（生理鹽水）、低劑量組（TD-CHR，大黃酚給藥量0.1 mg/kg）、中劑量組（TZ-CHR，大黃酚給藥量1.0 mg/kg）和高劑量組（TG-CHR，大黃酚給藥量10.0 mg/kg）。

1.2.1 構(gòu)建CUMS 抑郁模型小鼠

參照文獻(xiàn)[9-10]的方法并進(jìn)行適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)，刺激因素：41 ℃熱水游泳5 min、4 ℃冰水游泳5 min、夾尾2 min、籠子傾斜45°（8 h）、潮濕環(huán)境（12 h）、禁水24 h、禁食24 h、徹夜光照及振蕩。除空白組外其余每組每天隨機(jī)進(jìn)行1 ～2 種刺激，保證不連續(xù)出現(xiàn)同種刺激，連續(xù)進(jìn)行42 d。

每種刺激方法的具體操作如下：（1）熱水游泳，將小鼠放入裝有41 ℃熱水的塑料箱中，水深15 cm；（2）冰水游泳，將小鼠放入裝有冰塊的4 ℃冰水的塑料箱中，水深15 cm；（3）夾尾，用燕尾夾夾住距小鼠尾根部1 cm 處，每次同時(shí)夾四只同組小鼠；（4）籠子傾斜，將鼠籠靠墻以45°放置8 h；（5）潮濕環(huán)境，在鼠籠中導(dǎo)入100 mL 清水使墊料濕透，12 h 后再替換干凈墊料；（6）禁食，暫停供給飼料24 h；（7）禁水，暫停供水24 h；（8）徹夜光照，將小鼠放置在白熾燈照射的明亮房間中，持續(xù)24 h；（9）振蕩，將小鼠置于籠中，手動(dòng)振蕩1 min。

1.2.2 動(dòng)物模型評(píng)價(jià)指標(biāo)和方法

（1）小鼠的體質(zhì)量測(cè)量

在CUMS 造模前1 d（第0 天）、開(kāi)始造模后第21天和第42 天對(duì)所有小鼠稱(chēng)量一次體重。

（2）小鼠的糖水偏好測(cè)試

測(cè)定前1 天對(duì)小鼠進(jìn)行一次糖水訓(xùn)練（每只鼠籠放置1 瓶1%蔗糖水和1 瓶普通自來(lái)水，適應(yīng)24 h）。于實(shí)驗(yàn)第1 天、第21 天以及第42 天測(cè)定小鼠的糖水偏好度。測(cè)試開(kāi)始先禁食禁水24 h，然后隨機(jī)在鼠籠放入1 瓶1%的蔗糖水和1 瓶普通飲用水，12 h 后，記錄瓶?jī)?nèi)液體的消耗量，按照公式（1）計(jì)算糖水消耗百分比。

式中：V糖和V水分別為1%蔗糖水消耗量和普通飲用水消耗量，mL。

（3）小鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測(cè)

在完成行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后（即第42 天），將小鼠麻醉，取眼眶血后采用脫頸椎法處死小鼠，在冰上剝離全腦，取海馬組織，放入EP管中，在-80 ℃冰箱凍存以備取用。檢測(cè)時(shí)稱(chēng)取一定數(shù)量海馬組織，置于玻璃勻漿器中，加入PBS 緩沖液，制備10%的組織勻漿，取上清液，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定小鼠海馬MDA 和SOD 水平。

1.2.3 給藥方法

所有藥物通過(guò)腹腔注射，以10 g 體質(zhì)量給藥0.1 mL 每天注射1 次，共42 d。

1.3 統(tǒng)計(jì)處理

應(yīng)用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析（one-way ANOVA），采用LSD 法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 大黃酚對(duì)CUMS 抑郁模型小鼠行為學(xué)的影響

圖1（a）顯示，給藥第21 天抑郁組的體重顯著低于空白組（P＜0.05），提示慢性不可預(yù)計(jì)刺激對(duì)小鼠的體重有影響；給藥第42 天后，抑郁組體重明顯低于CHR 劑量組（P＜0.05），且CHR 對(duì)體重的影響存在劑量依賴(lài)性。圖1（b）顯示，抑郁組小鼠糖水消耗百分比持續(xù)降低，與抑郁組相比，在實(shí)驗(yàn)第21 天和42 天后空白組和各CHR 劑量組糖水消耗量升高（P＜0.05）。

圖1 CHR 對(duì)CUMS 小鼠行為學(xué)的影響（n=8）

應(yīng)用CUMS 建立小鼠抑郁模型是當(dāng)前運(yùn)用最廣泛的方法，此方法主要是對(duì)動(dòng)物進(jìn)行長(zhǎng)期輕度應(yīng)激刺激以模擬人類(lèi)在生活遇到的壓力和打擊，導(dǎo)致動(dòng)物心理上的抑郁[11-12]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)42 d 一系列的不可預(yù)知溫和隨機(jī)刺激建立抑郁動(dòng)物模型，實(shí)驗(yàn)中抑郁組體重增長(zhǎng)緩慢，糖水偏好百分比顯著下降，表明小鼠心境低落、快感缺失，這些都是抑郁癥患者的核心癥狀之一，提示小鼠抑郁模型建立成功[13-14]。小鼠行為學(xué)的評(píng)估是評(píng)價(jià)藥物抗抑郁效果的重要指標(biāo)，適量CHR的治療可顯著改善CUMS 抑郁模型小鼠的抑郁行為，表明CHR 對(duì)改善小鼠抑郁行為具有一定作用。

2.2 大黃酚對(duì)CUMS 抑郁模型小鼠海馬體中MDA及SOD 水平的影響

圖2（a）顯示，與空白組相比，抑郁組及大黃酚低、中、高劑量組中小鼠海馬體中SOD 活力顯著降低（P＜0.05）；與抑郁組相比，大黃酚中、高劑量組小鼠海馬體中SOD 活力顯著升高（P＜0.05）。圖2（b）顯示，與空白組相比，抑郁組及大黃酚低、中劑量組小鼠海馬中MDA 含量顯著增加（P＜0.05）；與抑郁組相比，大黃酚高劑量組小鼠海馬中MDA 含量顯著降低（P＜0.05）。

圖2 CHR 處理對(duì)CUMS 小鼠腦組織SOD 活力和MDA 含量的影響（n=8）

抑郁癥的發(fā)生與神經(jīng)系統(tǒng)的氧化應(yīng)激失衡關(guān)系緊密[15]。氧化應(yīng)激失衡產(chǎn)生的過(guò)量氧自由基（Reactive Oxygen Species，ROS）能作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，造成神經(jīng)細(xì)胞RNA、DNA 斷裂以及脂質(zhì)的損傷，從而誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，并影響其信息傳遞、細(xì)胞修復(fù)等功能[16-18]。表明抑郁癥患者認(rèn)知功能受損的重要原因之一可能是氧化應(yīng)激系統(tǒng)的激活。人體內(nèi)抗氧化酶以超氧化物歧化酶（SOD）為主，其功能受到影響，會(huì)造成自由基大量堆積[19]。MDA 是脂質(zhì)過(guò)氧化的重要代謝產(chǎn)物，其能衡量氧化應(yīng)激的損傷程度[20]。研究表明，當(dāng)發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，MDA 水平顯著升高，SOD水平顯著降低[21]。基于此，本實(shí)驗(yàn)用小鼠腦中海馬體SOD 活力和MDA 含量變化來(lái)揭示大黃酚可能的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，患有抑郁障礙小鼠大腦中的氧化應(yīng)激系統(tǒng)存在顯著的失衡現(xiàn)象。給予大黃酚干預(yù)后，大腦組織中SOD 活力升高、MDA 水平降低，表明大黃酚能有效改善小鼠氧化應(yīng)激系統(tǒng)，有助于小鼠認(rèn)知功能恢復(fù)。

3 結(jié)論

綜上，大黃酚能改善CUMS模型小鼠的抑郁行為，其機(jī)制可能與改善小鼠海馬體的氧化應(yīng)激系統(tǒng)平衡狀態(tài)有關(guān)。