蘇芳，蘇明德

（1.近海流域緩解測(cè)控治理福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福清 350300；2.福建技術(shù)師范學(xué)院 海洋學(xué)院，福建福清 350300；3.宸鴻科技（廈門）有限公司，福建廈門 361000）

近年來，微塑料污染作為一種新興有機(jī)污染物備受環(huán)保領(lǐng)域研究者的關(guān)注[1]。微藻作為水體中的初級(jí)生產(chǎn)者，是食物鏈的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)，對(duì)水體的生產(chǎn)力與自凈能力有很大的影響，是重要的水體污染的指示生物[2]。目前研究主要集中在微塑料對(duì)微藻的毒性效應(yīng)方面[3]，關(guān)于微藻響應(yīng)微塑料脅迫過程中的自我保護(hù)機(jī)制的研究較少。已有的報(bào)道稱藻細(xì)胞能通過藻-微塑料的異聚集作用來抵御脅迫，恢復(fù)種群生長(zhǎng)[4]。這提示，在微藻的細(xì)胞外有能與微塑料結(jié)合的物質(zhì)或者位點(diǎn)。

細(xì)胞外聚合物（EPS）是微生物和藻類分泌的復(fù)雜高分子聚合物，主要由蛋白質(zhì)和多糖組成，具有羧基、磷酸基、羥基、硫酸鹽、氨基和疏水鏈等多種官能團(tuán)[5]，是污染物接觸細(xì)胞的第一道屏障，能在一定程度上抑制重金屬、納米金屬顆粒等常規(guī)污染物的毒性效應(yīng)[5]。但在微塑料的脅迫下，EPS 是否能參與藻類的抗逆境脅迫，以及它是如何起抗逆境的作用機(jī)制還不明確，亟待開展相應(yīng)的研究。本實(shí)驗(yàn)通過研究微塑料脅迫下，EPS 有無對(duì)藻類的生長(zhǎng)及光合生理的影響來探尋藻類的抗逆生理機(jī)制，可為藻類的胞外聚合物的抗逆境脅迫、抵御污染機(jī)制研究提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

DM500 型三目生物顯微鏡，德國(guó)徠卡公司；UV-2600 型紫外分光光度計(jì)，島津儀器（蘇州）有限公司；TGL-16M 型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；HANDYPEA 型植物效率分析儀，英國(guó)漢莎科學(xué)儀器有限公司。

培養(yǎng)基和色素提取所用試劑均為分析純，除VB1、VB12購(gòu)自福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司外，其余試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。海水小球藻（Chlorella vulgaris）由福建技術(shù)師范學(xué)院近海流域環(huán)境測(cè)控治理福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室微藻庫(kù)提供。聚丙烯腈聚合物微塑料（PAN-MPS），粒徑為0.05 ～0.20 μm，由福建師范大學(xué)聚合物資源綠色循環(huán)利用教育部工程研究中心提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)條件

使用L1 培養(yǎng)基培養(yǎng)小球藻，溫度（25±0.5）℃，光照強(qiáng)度為4 000 lx，光暗比為12 h ∶12 h[6]。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

（1）EPS 去除組。采用高速離心法提取小球藻的EPS。將培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)后期藻液，在4 ℃、4 000 r/min條件下離心15 min 后取出，棄上清液后用0.6% NaCl重懸，再在4 ℃、10 000 r/min下離心15 min后棄上清液，剩余藻細(xì)胞即為無胞外聚合物的藻細(xì)胞（EPS-F）。

（2）EPS 保留組。取同批次藻細(xì)胞在4 ℃、4 000 r/min 條件下離心10 min 后棄上清液，獲得的藻細(xì)胞即為EPS 保留的藻細(xì)胞（EPS-C）。

（3）微塑料脅迫處理。分別向EPS-F 組和EPS-C 組的各培養(yǎng)瓶中添加PAN-MPS 儲(chǔ)備液，使得體系中PAN-MPS 的最終濃度為0 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、500 mg/L，每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)，共24 個(gè)培養(yǎng)瓶，起始藻細(xì)胞密度約為3.0×106cell/mL。

1.2.3 測(cè)定方法

（1）采用血球計(jì)數(shù)板顯微計(jì)數(shù)法測(cè)定生物量。

（2）每天定時(shí)取樣后3 800 r/min 離心10 min 棄上清，加入5 mL 的乙醇溶液重懸，置于冰箱4 ℃過夜后3 800 r/min 離心5 min 獲得色素提取液，隨后使用分光光度法測(cè)定在470 nm、666 nm 和653 nm 處的吸光值。利用公式（1）～（3）計(jì)算出葉綠素和類胡蘿卜素的含量[7-8]。

式中，Ca、Cb和Cl分別表示葉綠素a、葉綠素b和總類胡蘿卜素含量，mg/L；A666、A653、A470分別表示色素提取液在666 nm 、653 nm 和 470 nm 處的吸光度值。

（3）每天定時(shí)取樣，暗適應(yīng)20 min 后，根據(jù)ZHANG 等[9]的方法用植物效率分析儀測(cè)定樣品葉綠素?zé)晒鈪?shù)。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2021 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；通過軟件SPSS 26.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)的差異顯著性分析，使用Origin 2021 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度PAN-MPS 對(duì)小球藻種群生長(zhǎng)的影響

由圖1 可知，PAN-MPS 的添加，顯著抑制了小球藻的生長(zhǎng)，且抑制效果隨著微塑料暴露濃度的增加而加強(qiáng)。對(duì)比EPS-C 和EPS-F 小球藻的生長(zhǎng)表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)由于EPS 的缺失，EPS-F 組的球藻細(xì)胞少了抵御緩解微塑料的污染侵害的第一道防線，受到微塑料的毒害更加嚴(yán)重，不僅細(xì)胞總量低于EPS-C 組，且指數(shù)期也比EPS-C 組晚。

圖1 不同濃度PAN-MPS 脅迫下EPS-C 和EPS-F 小球藻種群數(shù)量增長(zhǎng)曲線

2.2 不同濃度PAN-MPS 脅迫對(duì)小球藻光合色素含量的影響

圖2 是不同濃度PAN-MPS 脅迫下，EPS-C 和EPS-F 小球藻光合色素含量變化情況。（1）EPS-C 組，在PAN-MPS 暴露的前48 h，各實(shí)驗(yàn)組光合色素的含量顯著上升，最大值出現(xiàn)50 mg/L PAN-MPS 添加組。（2）EPS-F 組，PAN-MPS 添加后，整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期中光合色素的積累均受到抑制，最小值出現(xiàn)在500 mg/L PAN-MPS 添加組。（3）對(duì)比EPS-C 和EPS-F 組的數(shù)據(jù)，可以發(fā)現(xiàn)去除EPS 后，藻細(xì)胞中的葉綠素a 和總類胡蘿卜素的含量均顯著下降，但葉綠素b 的含量在實(shí)驗(yàn)后期有顯著提升。此外，所有處理組的葉綠素a 和總類胡蘿卜素含量的組間差異隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而縮小。

圖2 不同濃度PAN-MPS 脅迫下EPS-C 和EPS-F 小球藻的光合色素含量變化

2.3 不同濃度PAN-MPS 脅迫對(duì)小球藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

由圖3 可以看出，不同濃度PAN-MPS 脅迫后，小球藻的PSII 潛在活性（Fv/Fo）以及最大光量子效率（Fv/Fm）有著不同程度的變化。（1）EPS-C 組，隨著PAN-MPS 濃度的增加，F(xiàn)v/Fo 和Fv/Fm 大體呈下降趨勢(shì)，且差異隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而逐漸顯著。（2）EPS-F 組，F(xiàn)v/Fo 和Fv/Fm 的變化趨勢(shì)與EPS-C組基本一致，但從數(shù)值上來看，EPS-F 組的Fv/Fo 和Fv/Fm 值顯著高于EPS-C 組。同時(shí)隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，EPS-F 組的葉綠素?zé)晒鈪?shù)值均有不同程度的提升，說明小球藻在通過調(diào)節(jié)光合作用相關(guān)活性來對(duì)抗微塑料的脅迫。

圖3 不同濃度PAN-MPS 脅迫下EPS-C 和EPS-F 小球藻的葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化

3 結(jié)論

聚丙烯腈微塑料（PAN-MPS）會(huì)抑制小球藻的生長(zhǎng)，且存在濃度依賴效應(yīng)。對(duì)比EPS-C 和EPS-F的各個(gè)實(shí)驗(yàn)組小球藻的光合色素含量，EPS-F 的藻細(xì)胞中光合色素含量下降更為明顯。在PAN-MPS 脅迫下，小球藻的Fv/Fm 和Fv/Fo 不管EPS 存在與否都會(huì)被抑制，但是EPS-F 組的Fv/Fo 和Fv/Fm 值顯著高于EPS-C 組。