沈淑琳，李 會(huì)，張曉梅，徐建國(guó)，史勁松，許正宏*

（1. 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2. 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；3. 江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；4. 無(wú)錫福祈制藥有限公司，江蘇 無(wú)錫 214122）

西索米星（sisomicin）是一種含有雙鍵的多元弱堿性第二代氨基糖苷類抗生素，中文別名西蘇霉素和紫蘇霉素等，為小單孢菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物[1-2]，它對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性和部分如金黃色葡萄球菌等的革蘭氏陰性菌有很強(qiáng)的抗菌作用。 以西索米星為前體可以合成抗菌活性強(qiáng)、毒性小、抗耐藥性的奈替米星和plazomicin 等，市場(chǎng)需求較大。西索米星最先由美國(guó)先令公司W(wǎng)einstein 等在1970 年從伊尼奧 小 單 孢 菌 （Micromonospora inyoensis，M.inyoensis）中取得[3]。小單孢菌是其主要產(chǎn)生菌[4-5]，但由于其野生菌株發(fā)酵西索米星效價(jià)低 （最高只有400 U/mL），國(guó)內(nèi)外研究者一直嘗試采用不同的誘變方法來(lái)選育西索米星高產(chǎn)菌株，以滿足抗生素市場(chǎng)需求。 Testa 等用亞硝基胍、硫酸二乙酯和紫外復(fù)合誘變處理西索米星產(chǎn)生菌（M. inyoensis），得到一定條件下能合成西索米星的菌株[6]。廖愛芳等對(duì)伊尼奧小單孢菌澄江變種T-125（M. inyoensis var.dengjiangensis T-125） 進(jìn)行紫外和亞硝基胍誘變[7]，獲得一株比原始菌株效價(jià)提高了17 倍的高產(chǎn)菌株NS8-30。趙敏等用紫外結(jié)合氯化鋰和甲胺等誘變棘孢小單孢菌JIM-202 變株，得到一株西索米星單組分阻斷型新菌株JIM-121[8]。利用紫外誘變和化學(xué)誘變等傳統(tǒng)誘變選育方法可有效提高西索米星的效價(jià)，但由于長(zhǎng)期重復(fù)地使用相同誘變因子，誘變效果降低，而且由于小單孢菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)特殊，誘變研究進(jìn)展不大，迫切需要尋找一種提高西索米星效價(jià)的有效誘變方法。

伊尼奧小單孢菌屬于放線菌的小單孢菌屬[9]，其形態(tài)為菌絲體，無(wú)氣生菌絲，其菌絲分散不均勻，直接誘變處理效果不佳。 此外，孢子壁結(jié)構(gòu)致密牢固，不利于誘變劑進(jìn)入核內(nèi)起作用，進(jìn)而導(dǎo)致孢子誘變假陽(yáng)性較多，給后期誘變菌株的篩選帶來(lái)干擾。 原生質(zhì)體作為單個(gè)的分散細(xì)胞，接觸誘變劑的面積更大，有利于誘變劑向核內(nèi)滲透，而且誘變后稀釋涂布于培養(yǎng)基能形成單個(gè)菌落，有利于分離篩選。 管玉霞等對(duì)慶大霉素產(chǎn)生菌絳紅色小單孢菌的原生質(zhì)體進(jìn)行紫外和硫酸二乙酯誘變和融合[10]，結(jié)合慶大霉素抗性篩選獲得一株效價(jià)較原始菌株提高了73.49%的高產(chǎn)菌株。洪文榮應(yīng)用單親滅活種內(nèi)原生質(zhì)體融合技術(shù)[11]，并施加西索米星壓力的篩選手段，從伊尼奧小單孢菌細(xì)胞融合研究中篩選到菌株S96，西索米星效價(jià)達(dá)到1 600 U/mL，較原始菌株提高了近30 倍。 因此，采用原生質(zhì)體選育方法是解決誘變效率低的有效方法之一[12]。

常壓室溫等離子體 （atmospheric and room temperature plasma，ARTP） 是一種新開發(fā)的誘變工具，其致突變效率高于紫外線或化學(xué)誘變劑[13-14]。ARTP 誘變除誘變率高外，還有操作簡(jiǎn)單、安全且對(duì)環(huán)境無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)。 鄭明坤等利用ARTP 誘變結(jié)合巴龍霉素抗性篩選，獲得一株比原始菌株西索米星效價(jià)提高38.18%的高產(chǎn)菌株M.inyoensis SAAP22[15]。余飛對(duì)新霉素產(chǎn)生菌弗氏鏈霉菌進(jìn)行6 輪ARTP 誘變，結(jié)合鏈霉素抗性篩選，最終獲得一株新霉素高產(chǎn)菌株，搖瓶效價(jià)比原始菌株高出1.45 倍[16]。 因此ARTP 誘變成為工業(yè)微生物的菌種選育的一種有效且常用的方法[17-18]。 M. inyoensis OG-1 是無(wú)錫福祈制藥有限公司保藏的一株能夠生產(chǎn)西索米星的菌株，但其生產(chǎn)西索米星的效價(jià)偏低（約1 026 U/mL），制約著其進(jìn)一步工業(yè)利用，作者采用ARTP 對(duì)伊尼奧小單孢菌原生質(zhì)體進(jìn)行誘變以取得西索米星生物效價(jià)提高的菌株；進(jìn)而對(duì)篩選獲得的高效菌株進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化并初步探究其高產(chǎn)西索米星的機(jī)制，為西索米星生產(chǎn)條件的進(jìn)一步優(yōu)化和工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

原始菌伊尼奧小單孢菌（Micromonospora inyoensis OG-1）和指示菌短小芽孢桿菌：由無(wú)錫福祈制藥有限公司保存；溶菌酶（20 000 U/mg）：購(gòu)于麥克林生化科技有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

斜面、分離培養(yǎng)基（組分g/L）：可溶性淀粉10，蔗 糖 5，KNO31，NaCl20.5，K2HPO40.5，CaCO33，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.5，瓊脂粉20，麩皮30；pH 7.2~7.3。

種子培養(yǎng)基（組分g/L）：玉米淀粉30，經(jīng)熱處理的黃豆餅粉20，玉米漿1，CaCO33，MgSO4·7H2O 1；pH 7.2~7.4。

發(fā)酵培養(yǎng)基（組分g/L）：玉米淀粉20，白糊精40，黃豆餅粉40，玉米漿干粉6，DL-蛋氨酸2.5，MgSO4·7H2O 0.3，CoCl2·6H2O 0.02，K2HPO40.5，CaCO33；pH 7.0~7.2。

肉湯培養(yǎng)基（組分g/L）：蛋白胨5.0，牛肉浸取物3.0，NaCl 5.0。

再生培養(yǎng)基（組分g/L）：可溶性淀粉10，蔗糖68.46，KNO31，NaCl20.5，K2HPO40.5，CaCO33，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.5，CaCl2·2H2O 3.67，MgCl2·6H2O 5，瓊脂粉20。

西索米星鑒定培養(yǎng)基（組分g/L）：蛋白胨5.0，牛肉浸取物3.0，NaCl 5.0。

P 緩沖液：蔗糖103 g、K2SO40.25 g 和MgCl2·6H2O 2.02 g 加入800 mL 的水中，分裝成10 等分樣品，然后高溫滅菌。 使用前加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的KH2PO41 mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.68%的CaCl2·2H2O 10 mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)5.73%的TES 緩沖液10 mL。

1.3 方法

1.3.1 原生質(zhì)體ARTP 誘變 原生質(zhì)體的制備[19]：按體積分?jǐn)?shù)10%將菌液接種到含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%的甘氨酸的肉湯培養(yǎng)基中，在260 r/min、34 ℃的條件下培養(yǎng)48 h。 培養(yǎng)好的菌液轉(zhuǎn)移至離心管中于3 000 r/min 離心10 min，收集菌體。用0.3 mol/L 的蔗糖溶液和P 緩沖液分別洗滌菌體2 次，3 000 r/min 離心5 min。 收集菌體并加入一定濃度的溶菌酶（用P 緩沖液配制）重懸，將重懸液放置在水浴鍋中恒溫酶解一定時(shí)間，4 000 r/min 離心10 min，收集原生質(zhì)體，洗滌重懸于P 緩沖液中。

取10 μL 伊尼奧小單孢菌的原生質(zhì)體懸浮液均勻涂布于金屬載片上，采用氦氣作為ARTP 的工作氣體，設(shè)置處理參數(shù)：電源的功率為100 W，照射距離為2 mm，通氣量為10 L/min。 選擇不同的處理時(shí)間（0、30、60、120、150、180、210 s），誘變結(jié)束后將金屬載片放入盛有1 mL P 緩沖液的1.5 mL 無(wú)菌離心管中，充分振蕩洗脫1 min，將洗脫液稀釋涂布于含1 mg/mL 西索米星抗性的再生培養(yǎng)基，34 ℃培養(yǎng)14 d，計(jì)算致死率，繪制致死率曲線[20-21]。

1.3.2 誘變株的篩選 瓊脂擴(kuò)散法初篩：選取再生的單菌落轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基加瓊脂配制成的固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行密集劃線培養(yǎng)，待菌體長(zhǎng)滿區(qū)域后，分別用5 mm 的打孔器挑取相同大小的菌塊進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)，將菌塊轉(zhuǎn)接到帶有短小芽孢桿菌孢子液的篩選培養(yǎng)基平板上，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14~16 h 后，測(cè)量抑菌圈直徑大小。

搖瓶復(fù)篩：選取初篩中抑菌圈相對(duì)較大的菌株接種到種子培養(yǎng)基中，并進(jìn)行揺瓶水平的西索米星發(fā)酵，用生物鑒定法測(cè)定效價(jià)[22]。

1.3.3 遺傳性穩(wěn)定性驗(yàn)證 將復(fù)篩中獲得的高產(chǎn)菌株進(jìn)行斜面保藏，經(jīng)過連續(xù)5 代搖瓶發(fā)酵，檢測(cè)西索米星生物效價(jià)，考察高產(chǎn)菌株的遺傳穩(wěn)定性。

1.3.4 碳氮源優(yōu)化 在原始發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，使用等量（40 g/L）碳源（可溶性淀粉、玉米淀粉、蔗糖和葡萄糖）分別代替白糊精制備發(fā)酵培養(yǎng)基，其他成分不變，考察不同碳源對(duì)西索米星發(fā)酵的影響。

在原始發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，使用等量（6 g/L）氮源（牛肉粉、蛋白胨、酵母粉和花生餅粉）分別代替玉米漿干粉制備發(fā)酵培養(yǎng)基，其他成分不變，考察不同氮源對(duì)西索米星發(fā)酵的影響。

1.3.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基組分 在碳氮源優(yōu)化的培養(yǎng)基組分基礎(chǔ)上，利用Design-Expert 8.0 軟件，設(shè)計(jì)Plaekett-Burman 實(shí)驗(yàn)，篩選重要影響因素[23]，根據(jù)PB 實(shí)驗(yàn)結(jié)論，進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)，確定西索米星發(fā)酵效價(jià)最高范圍后，采用中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（central composite design，CCD）方法設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，并對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，擬合得到一個(gè)二次模型，并預(yù)測(cè)和驗(yàn)證西索米星發(fā)酵最優(yōu)培養(yǎng)基組分。

1.3.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 收集不同發(fā)酵時(shí)期的發(fā)酵液，收集菌絲體，分別提取RNA，進(jìn)行濃度測(cè)定并 稀 釋 至40 ng/μL 備 用。 利 用 軟 件Beacon Designer 7 設(shè)計(jì)用于RT-qPCR 的引物，見表1。 以16s rDNA 為管家基因，以RNA 逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA為模板，檢驗(yàn)引物特異性，結(jié)果顯示特異性良好后可繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)RT-qPCR 研究。 將上述逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA 進(jìn)行RT-qPCR，實(shí)驗(yàn)步驟及結(jié)果的計(jì)算方法參考文獻(xiàn)[24] 。 每次實(shí)驗(yàn)各組設(shè)3 個(gè)平行樣，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.7 西索米星生物效價(jià)的檢測(cè) 用質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%的濃硫酸調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH 至1.5~2.0，靜置20 min 后過濾取濾液，參照中國(guó)藥典[22]，采用管碟法測(cè)定西索米星的生物效價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ARTP 誘變選育

2.1.1 最佳ARTP 誘變時(shí)間的確定 將伊尼奧小單孢菌OG-1 的原生質(zhì)體進(jìn)行不同時(shí)間的ARTP 誘變，然后稀釋涂布于再生培養(yǎng)基計(jì)算其致死率。 由圖1 可見，隨著ARTP 誘變時(shí)間的增長(zhǎng)，致死率逐漸升高，當(dāng)誘變時(shí)間為210 s 時(shí)，致死率達(dá)100%。當(dāng)致死率在80%~90%時(shí)，更容易發(fā)生正向突變[24]，因此選擇處理時(shí)間為150 s（致死率為85%）的誘變菌株進(jìn)行后續(xù)誘變研究。

圖1 ARTP 不同處理時(shí)間的致死率曲線Fig. 1 Lethality curve of ARTP for different treatment time

2.1.2 ARTP 誘變菌株的選育 將ARTP 誘變處理后的原生質(zhì)體懸液稀釋涂布于再生培養(yǎng)基上，34 ℃培養(yǎng)14 d。 挑選300 多株誘變菌株單菌落進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散法初篩，挑選抑菌圈相對(duì)較大的14 株突變菌株進(jìn)行復(fù)篩。 如圖2 所示，在14 株突變株中，M.inyoensis I4-10 的西索米星生物效價(jià)最高，達(dá)到（1 389±32） U/mL，較原始菌株提高了35.4%。

圖2 ARTP 誘變菌株與對(duì)照菌株的搖瓶復(fù)篩結(jié)果對(duì)比Fig. 2 Comparison of shake flask rescreening results between ARTP mutagenic strain and control strain

2.1.3 高產(chǎn)菌株的遺傳穩(wěn)定性研究 為了檢驗(yàn)突變菌株I4-10 的遺傳穩(wěn)定性，采用斜面?zhèn)鞔姆椒ǎB續(xù)進(jìn)行5 次傳代，檢測(cè)每代搖瓶發(fā)酵的西索米星效價(jià),結(jié)果如圖3 所示。 突變菌株I4-10 株經(jīng)5 次傳代后的西索米星搖瓶發(fā)酵效價(jià)基本穩(wěn)定，生物效價(jià)穩(wěn)定在（1 389±67） U/mL，表明突變菌株I4-10 遺傳穩(wěn)定性良好，最終將其命名為M. inyoensis I4-10。

圖3 突變菌株I4-10 的遺傳穩(wěn)定性Fig. 3 Genetic stability of mutant strain I4-10

2.2 碳源氮源的優(yōu)化

2.2.1 碳源種類對(duì)西索米星發(fā)酵的影響 發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源為伊尼奧小單孢菌的生長(zhǎng)以及產(chǎn)物代謝提供能量，為西索米星的合成輸送碳骨架。 采用不同的碳源，對(duì)西索米星的效價(jià)具有較大影響。 因此篩選了不同種類的碳源如白糊精、 玉米淀粉、可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖對(duì)伊尼奧小單孢菌發(fā)酵產(chǎn)西索米星生物效價(jià)的影響進(jìn)行研究。 如圖4 所示，當(dāng)采用可溶性淀粉作為伊尼奧小單孢菌的碳源時(shí)，西索米星的生物效價(jià)最高，達(dá)到（1 476±38） U/mL。

圖4 不同碳源對(duì)西索米星發(fā)酵的影響Fig. 4 Effects of different carbon sources on the fermentation of sisomicin

2.2.2 氮源種類對(duì)西索米星發(fā)酵的影響 培養(yǎng)基的氮源對(duì)于微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成具有較大影響。作者篩選了不同種類的氮源如玉米漿干粉、 牛肉粉、蛋白胨、酵母粉、花生餅粉對(duì)伊尼奧小單孢菌發(fā)酵產(chǎn)西索米星生物效價(jià)的影響進(jìn)行研究。 如圖5 所示，當(dāng)采用花生餅粉作為氮源時(shí)西索米星的生物效價(jià)最低，蛋白胨作為氮源時(shí)西索米星的生物效價(jià)也較低。 當(dāng)采用牛肉粉替代玉米漿干粉作為伊尼奧小單孢菌的氮源時(shí)，西索米星的生物效價(jià)最高，達(dá)到（1 419±60） U/mL，說明牛肉粉作為氮源可以滿足伊尼奧小單孢菌的生長(zhǎng)所需及合成西索米星的需要。

圖5 不同氮源對(duì)西索米星發(fā)酵的影響Fig. 5 Effects of different nitrogen sources on the fermentation of sisomicin

碳源和氮源單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，突變菌株I4-10 發(fā)酵培養(yǎng)基的最適碳源、 氮源分別為可溶性淀粉和牛肉粉。 優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵西索米星效價(jià)為（1 597±48）U/mL，較對(duì)照提高了15%。 菌種選育和發(fā)酵工藝優(yōu)化是提高抗生素效價(jià)的重要手段，在選育得到的高產(chǎn)菌株的基礎(chǔ)上對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵工藝的優(yōu)化可明顯提高效價(jià)[25-26]。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基

2.3.1 Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn) 以優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基組分為基礎(chǔ)，對(duì)玉米淀粉（A）、可溶性淀粉（B）、黃豆餅粉（C）、牛肉粉（D）、DL-蛋氨酸（E）、MgSO4·7H2O （F）、CaCO3（G）、K2HPO2（H） 和CoCl2·6H2O（I）9 個(gè)因素進(jìn)行考察，選用N=12 的PB 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)因素取高、低兩個(gè)水平，響應(yīng)值為西索米星生物效價(jià)。PB 實(shí)驗(yàn)具體設(shè)計(jì)和各因素水平與效應(yīng)見表2 和表3。由表3 中顯示的P 值大小可知，黃豆餅粉（熱）和DL-蛋氨酸質(zhì)量濃度是對(duì)西索米星生物效價(jià)有顯著影響的兩個(gè)重要因素，兩者皆存在顯著的負(fù)效應(yīng)。 在西索米星發(fā)酵工藝優(yōu)化的相關(guān)文獻(xiàn)中可以看出選用優(yōu)質(zhì)的黃豆餅粉對(duì)西索米星的發(fā)酵至關(guān)重要[27]，DL-蛋氨酸也是影響西索米星發(fā)酵的重要因素。 陳劍鋒等發(fā)現(xiàn)蛋氨酸在西索米星發(fā)酵中處于高消耗狀態(tài)[28]，其具有作為甲基化輔因子的特殊作用，所以添加適量蛋氨酸有助于提高西索米星效價(jià)。

表2 Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)與結(jié)果（N=12）Table 2 Experimental and results of the Plackett-Burman design for 12 trials

表3 Plackett-Burman 設(shè)計(jì)各因素水平及效應(yīng)Table 3 Levels and effect of variables for Plackett-Burman design

2.3.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn) 在以上PB 實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)，確定黃豆餅粉和DL-蛋氨酸的最優(yōu)質(zhì)量濃度。 由PB 實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，黃豆餅粉和DL-蛋氨酸質(zhì)量濃度對(duì)西索米星的效價(jià)具有顯著影響，兩者質(zhì)量濃度過高時(shí)西索米星的生物效價(jià)反而下降，故應(yīng)降低發(fā)酵培養(yǎng)基中兩者的質(zhì)量濃度。 根據(jù)表3 中設(shè)計(jì)的這兩個(gè)顯著影響因素的水平和西索米星效應(yīng)值，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4。 實(shí)驗(yàn)4中西索米星效價(jià)最高，為1 728 U/mL，此時(shí)黃豆餅粉和DL-蛋氨酸的質(zhì)量濃度為30 g/L 和1.5 g/L，因此選取第4 組實(shí)驗(yàn)為中心點(diǎn)設(shè)計(jì)下一步實(shí)驗(yàn)。

表4 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Experimental design of steepest ascent and the corresponding results

2.3.3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化培養(yǎng)基組分 根據(jù)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取第4 組實(shí)驗(yàn)為中心點(diǎn)進(jìn)行二因素五水平的中心復(fù)合法實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)，表5 是具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及響應(yīng)值。 根據(jù)研究結(jié)果，用Design-Expert 8.0 軟件進(jìn)行擬合獲得黃豆餅粉 （熱）（A）、DL-蛋氨酸（B）和西索米星生物效價(jià)（Y）間二次回歸方程為Y =1 811 +59.67A -2.21B +41.00AB -90.00A2-23.50B2。 利用軟件對(duì)二次回歸方程進(jìn)行方差分析：該模型P 值小于0.001，說明該模型顯著性好，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；校正決定系數(shù)Radj2=1，表示該模型能較準(zhǔn)確反映西索米星的響應(yīng)值變化；相關(guān)系數(shù)R2=1，說明該模型的擬合度好。綜上所述，該模型可以用來(lái)預(yù)測(cè)西索米星的生物效價(jià)。 利用Design-Expert 8.0 軟件分析可知，當(dāng)黃豆餅粉質(zhì)量濃度為32.78 g/L、蛋氨酸質(zhì)量濃度為1.75 g/L 時(shí)，西索米星的生物效價(jià)的理論預(yù)測(cè)值最高，為1 834 U/mL。 圖6 是黃豆餅粉（熱）和DL-蛋氨酸影響西索米星生物效價(jià)的響應(yīng)面及等高線圖。

圖6 黃豆餅粉和DL-蛋氨酸對(duì)西索米星生物效價(jià)影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig. 6 Surface and contour plots of mutual-influence for tuna Ottelia alismoides concentration and DL-mertioninon the titer of sisomicin

表5 中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及其響應(yīng)值Table 5 Experimental design and the actual and predicted values of sisomicin by CCD

進(jìn)一步對(duì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化得到的最適發(fā)酵培養(yǎng)基配方進(jìn)行驗(yàn)證，以最適發(fā)酵培養(yǎng)基組分重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次。 在此條件下實(shí)際西索米星的平均生物效價(jià)達(dá)到（1 849±61） U/mL，與理論預(yù)測(cè)值99%符合。 驗(yàn)證該模型準(zhǔn)確性較好，可用于西索米星發(fā)酵工藝優(yōu)化。 鄭明坤等將伊尼奧小單孢菌（M.inyoensis-12）作為出發(fā)菌株，經(jīng)誘變后西索米星在搖瓶水平的生物效價(jià)達(dá)到1 658 U/mL[15]。 洪文榮應(yīng)用單親滅活種內(nèi)原生質(zhì)體融合技術(shù)篩選到突變菌株S96，使西索米星在搖瓶水平的生物效價(jià)由52 U/mL 提高到1 600 U/mL[11]。 本研究中篩選獲得的誘變菌I4-10 產(chǎn)西索米星的生物效價(jià)在國(guó)內(nèi)外同類研究報(bào)道中處于較高水平。

2.4 突變株高產(chǎn)西索米星的機(jī)制探索

為了探究誘變菌株高產(chǎn)西索米星的機(jī)理，以原始菌株伊尼奧小單孢菌OG-1 為對(duì)照，采用RT-qPCR 法對(duì)表6 所示的西索米星合成途徑相關(guān)的酶基因及菌株生長(zhǎng)代謝相關(guān)的關(guān)鍵酶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平差異分析。 分別在發(fā)酵過程的48、72、96、120 h 時(shí)取樣提取菌株RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，將其作為RT-qPCR 的模板，以16s rDNA 為管家基因，使用表1 中各酶基因引物進(jìn)行RT-qPCR 研究。

表6 西索米星代謝途徑轉(zhuǎn)錄水平差異分析相關(guān)基因Table 6 Genes of sterol metabolism pathways of sisomicin metabolic pathway

圖7 是突變菌與原始菌西索米星代謝途徑相關(guān)酶的轉(zhuǎn)錄水平分析熱圖。與原始菌OG-1 相比，在高產(chǎn)菌株I4-10 發(fā)酵西索米星過程中，2-脫氧青蟹肌糖合成酶、2-脫氧青蟹肌糖氨基轉(zhuǎn)移酶、 甲基轉(zhuǎn)移酶、3’，4’-脫羥基的磷酸轉(zhuǎn)移酶、SAM 依賴性N-甲基轉(zhuǎn)移酶等西索米星合成途徑關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)。其中2-脫氧青蟹肌糖氨基轉(zhuǎn)移酶基因sis10 在發(fā)酵中的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)最顯著。 而戊糖磷酸途徑的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因g6pd 在發(fā)酵過程中轉(zhuǎn)錄水平明顯下調(diào)，表明在高產(chǎn)菌株中此途徑減弱。 2-脫氧青蟹肌糖氨基轉(zhuǎn)移酶與葡萄糖-6-磷酸脫氫酶具有相同的底物葡萄糖-6-磷酸，推測(cè)磷酸戊糖途徑的減弱使更多的葡萄糖-6-磷酸用于次級(jí)代謝產(chǎn)物西索米星的合成，繼而在2-脫氧青蟹肌糖氨基轉(zhuǎn)移酶催化作用下產(chǎn)生更多的西索米星合成前體2-脫氧青蟹肌糖，這可能是突變菌株高產(chǎn)西索米星的原因。此外突變菌中TCA 循環(huán)的兩個(gè)關(guān)鍵酶基因idh1 和kgdh 均表現(xiàn)為轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，該途徑的增強(qiáng)可能加快了高產(chǎn)菌株的生長(zhǎng)，進(jìn)而促進(jìn)了西索米星的合成。 基于以上分析，推測(cè)2-脫氧青蟹肌糖合成酶、2-脫氧青蟹肌糖氨基轉(zhuǎn)移酶、甲基轉(zhuǎn)移酶、3’，4’-脫羥基的磷酸轉(zhuǎn)移酶、SAM 依賴性N-甲基轉(zhuǎn)移酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶和ɑ-酮戊二酸脫氫酶可能是影響菌株合成西索米星的關(guān)鍵酶。

圖7 突變菌與原始菌西索米星代謝途徑相關(guān)酶的轉(zhuǎn)錄水平分析熱圖Fig. 7 Heat map of transcription levels of enzymes related to metabolic pathways of mutant and original sisomicin

3 結(jié) 語(yǔ)

作者以M. inyoensis OG-1 為原始菌株，對(duì)其原生質(zhì)體進(jìn)行ARTP 誘變及工藝優(yōu)化。 結(jié)果表明，當(dāng)ARTP 誘變的處理時(shí)間為150 s 時(shí)，誘變效果最好。經(jīng)過多輪篩選獲得了高產(chǎn)且遺傳穩(wěn)定性良好的菌株M. inyoensis I4-10，西索米星的生物效價(jià)達(dá)到（1 389±67） U/mL，較原始菌株提高了34.7%。 進(jìn)一步通過對(duì)高產(chǎn)菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基組分優(yōu)化，西索米星在搖瓶水平上的生物效價(jià)得到明顯提高，最終達(dá)到（1 849±61）U/mL。本研究中獲得的菌株M.inyoensis I4-10 在西索米星高效合成方面呈現(xiàn)出了較大潛力，今后可繼續(xù)對(duì)該菌株進(jìn)行發(fā)酵罐規(guī)模放大研究，以促進(jìn)其在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。 此外，原始菌和高產(chǎn)菌株中西索米星合成及與菌株生長(zhǎng)相關(guān)酶基因轉(zhuǎn)錄水平差異分析表明，2-脫氧青蟹肌糖合成酶、2-脫氧青蟹肌糖氨基轉(zhuǎn)移酶、 甲基轉(zhuǎn)移酶、3’，4’-脫羥基的磷酸轉(zhuǎn)移酶、SAM 依賴性N-甲基轉(zhuǎn)移酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶和ɑ-酮戊二酸脫氫酶可能是影響菌株合成西索米星的關(guān)鍵酶，未來(lái)可基于這些關(guān)鍵酶對(duì)突變菌株I4-10 進(jìn)行代謝工程改造，從分子水平提升菌株的西索米星合成能力。