孟才云，孫 妍，肖志剛，李鐵晶，趙鳳芹，王 娜,

（1.遼寧大學(xué)輕型產(chǎn)業(yè)學(xué)院，遼寧 沈陽 110036；2.沈陽師范大學(xué)糧食學(xué)院，遼寧 沈陽 110034；3.營口理工學(xué)院，遼寧 營口 115014）

據(jù)調(diào)查，目前市場上廣泛使用的食品包裝材料大多為石油基制成的塑料包裝，這主要是因?yàn)樗芰喜牧蟽r(jià)格比較低廉，具有機(jī)械性能強(qiáng)、阻隔性和熱密封能力較好等優(yōu)勢，然而，因其不可降解、較低的回收利用率等原因，對生態(tài)環(huán)境造成了嚴(yán)重負(fù)擔(dān)[1-2]。與之相比，生物質(zhì)薄膜因具有來源廣泛、營養(yǎng)安全、制備簡單，安全環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)受到廣泛關(guān)注[3-4]。目前，蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、多糖及其衍生物或其復(fù)合材料是生物質(zhì)可食性膜的主要原料。生物質(zhì)薄膜作為一種新型、安全環(huán)保的材料，可將應(yīng)用于果蔬、肉制品、速食食品調(diào)料包、油炸及烘焙食品等方面[5-6]。

蛋白質(zhì)內(nèi)部具有較強(qiáng)的氫鍵、二硫鍵、疏水相互作用等作用力，因此具有較好的成膜特性，且膜結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定[7]。近年來，米糠蛋白（rice bran protein，RBP）因其良好的抗癌、抗氧化等功能性質(zhì)和營養(yǎng)價(jià)值被廣泛的應(yīng)用于成膜材料中。Adebiyi等[8-9]研究了RBP的成膜特性，發(fā)現(xiàn)RBP可用于可降解蛋白基薄膜的制備且具有一定的功能特性。但RBP的低溶解性導(dǎo)致其功能性質(zhì)較差，限制了其應(yīng)用，且單一RBP薄膜機(jī)械性能和阻隔性能等較差。因此，用適當(dāng)?shù)母男苑椒▽Φ鞍踪|(zhì)進(jìn)行處理[10]，可以得到具有良好機(jī)械性能和阻隔性能的蛋白膜[11-12]。眾多研究表明糖基化改性可以有效改善蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)[13-14]，從而提升蛋白膜的性能[15-16]。蔣麗梅[15]的研究結(jié)果顯示木糖糖基化改性花生蛋白膜的抗拉強(qiáng)度和斷裂伸長率分被提高了45.75%、42.70%。郭浩等[16]的研究證明糖基化改性可以使得玉米醇溶蛋白膜具備更強(qiáng)的抗拉強(qiáng)度和熱穩(wěn)定性。陳又銘等[17]發(fā)現(xiàn)經(jīng)菊粉糖基化改性后的玉米醇溶蛋白膜的透光率和阻隔性得到顯著提升。

將蛋白質(zhì)與多糖兩種基材共混制膜可進(jìn)一步提高薄膜的致密度，其阻隔性能和滲透率均優(yōu)于單一蛋白膜，對食品品質(zhì)具有更好的保護(hù)效果[18]。此外，多糖的添加也可以加強(qiáng)溶液體系的黏稠度和凝膠特性，從而使成膜溶液更加穩(wěn)定[19]。殼聚糖（chitosan，CS）作為自然界中來源廣泛的天然堿性氨基多糖，其抗菌性、陽離子性和成膜性使其成為醫(yī)療、食品等行業(yè)的熱門材料，同時(shí)因其具有抗氧化和抑菌等功能特性，以其成膜后用于食品包裝可起到防腐保鮮的效果。Hosseini等[20]發(fā)現(xiàn)將CS納米粒子與魚皮明膠作用制成的復(fù)合膜彈性模量、抗拉強(qiáng)度和阻水性明顯增強(qiáng)。Samsalee等[21]發(fā)現(xiàn)CS可以顯著改善豬血漿蛋白膜的透明度、溶解性、機(jī)械性能和熱性能。Wang Lingling等[22]利用超聲技術(shù)制備的大米蛋白水解物-CS可食性復(fù)合膜的斷裂伸長率提高了125%。

本研究首先利用小分子葡萄糖（G）對RBP進(jìn)行糖基化改性后制備糖基化RBP膜，利用糖基化反應(yīng)促進(jìn)蛋白分子的交聯(lián)從而改善RBP膜性能；繼而將糖基化RBP與CS復(fù)配，制備葡萄糖糖基化RBP-CS復(fù)合（glucoseglycosylated rice bran protein-chitosan composite，RBP-GCS）膜，以進(jìn)一步克服單一基材薄膜在物理性能方面的缺點(diǎn)?？疾霨與RBP質(zhì)量比、糖基化RBP與CS質(zhì)量比對薄膜機(jī)械性能的影響，對比分析上述薄膜材料的耐水性、阻隔性、熱特性等物理性能，并利用掃描電子顯微鏡和傅里葉變換紅外光譜儀對薄膜進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，以期拓寬RBP的應(yīng)用范圍，為開發(fā)新型食品包裝膜提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂米糠 沈陽奧達(dá)油脂有限公司；G、氫氧化鈉、鹽酸（均為分析純）天津化學(xué)試劑一廠；CS（脫乙酰度80.0%～95.0%，分子質(zhì)量100 kDa）上海源葉生物科技有限公司；丙三醇、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、無水氯化鈣、鄰苯二甲醛（1,2-phthalic dicarboxaldehyde，OPA）、硼砂、甲醇、十二烷基硫酸鈉（均為分析純）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；β-巰基乙醇 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JD2000-2L電子分析天平 沈陽龍騰電子有限公司；RT10恒溫磁力攪拌器 德國IKA公司；HH-S4電熱恒溫水浴鍋 北京市科偉永型儀器有限公司；UV-9000紫外-可見分光光度計(jì) 上海市元析儀器有限公司；Dhg-9240A烘箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；BK-302電子數(shù)顯卡尺 上海鼎冷實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；NS-800色差儀深圳市三恩時(shí)科技有限公司；CT34500質(zhì)構(gòu)儀 美國博勒飛公司；Q200差示掃描量熱儀 美國TA公司；S4800掃描電鏡 日本日立公司；FENSOR II傅里葉變換紅外光譜儀 德國布魯克有限公司。

1.3 方法

1.3.1 RBP的提取

采用堿溶酸沉法[23]于脫脂米糠中提取RBP。以料液比1∶9（g/mL）的比例將脫脂米糠與蒸餾水混合，使用1 mol/L NaOH或HCl溶液將混合物pH值調(diào)至9.5，50 ℃攪拌2 h后，過濾除去米糠渣后濾液經(jīng)6000 r/min離心15 min，將離心后上清液調(diào)pH 4.5，再次6000 r/min離心30 min，收集沉淀稀釋并調(diào)pH 7.0，冷凍干燥即得RBP（蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)87.13%、溶解度17.59%）。

1.3.2 RBP-G的制備

參考Zhu Dan等[24]的方法并加以改進(jìn)，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%稱取RBP溶于pH 9、50 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液中，再分別按G和RBP不同質(zhì)量比（1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1）稱取G溶于溶液中，充分?jǐn)嚢?，在pH 9、90 ℃水浴攪拌60 min后，取出立即冰浴，于4 ℃透析24 h，凍干成粉末，備用。

1.3.3 薄膜樣品的制備

采用澆鑄成膜的方式制備薄膜。稱取一定量RBP-G溶于蒸餾水配制成6 g/100 mL的蛋白溶液，1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 11，添加甘油至1.25 g/100 mL，室溫下磁力攪拌30 min，量取15 mL成膜溶液澆鑄到內(nèi)徑為9 cm的無菌塑料培養(yǎng)皿上，50 ℃干燥6～10 h后取出，并將膜放入25 ℃、相對濕度58%的干燥器中保存48 h后得到RBP-G膜，用于后續(xù)各項(xiàng)性能的測定。以未經(jīng)處理的RBP在相同條件下，80 ℃磁力攪拌后制備對照膜（RBP膜）。

分別配制4 g/100 mL的RBP-G溶液（G∶RBP=1∶1）和2 g/100 mL的CS冰乙酸溶液，將RBP-G置于磁力攪拌器上，邊攪拌邊緩慢滴加CS，得到不同固形物質(zhì)量比（RBP-G與CS質(zhì)量比6∶1、4∶1、2∶1、1∶1、2∶3）的RBP-G-CS混合溶液，使用1 mol/L NaOH或HCl溶液將混合液調(diào)pH 4.0，室溫下攪拌4 h，滴加甘油至1.25 g/100 mL后繼續(xù)攪拌30 min，量取15 mL成膜溶液澆鑄到內(nèi)徑為9 cm的無菌塑料培養(yǎng)皿上。將盛有膜液的培養(yǎng)皿水平放入50 ℃的烘箱中，干燥6～10 h后取出，并回軟48 h后得到RBP-G-CS膜，用于后續(xù)各項(xiàng)性能的測定。

1.3.4 接枝度的測定

采用OPA法[25]測定樣品接枝度，稱取40 mg的OPA溶于1 mL甲醇中，分別加入2.5 mL 20 g/100 mL的SDS溶液，25 mL 0.1 mol/L硼砂溶液，100 μLβ-巰基乙醇，定容至50 mL混勻，得到OPA試劑。于試管中加入4 mL OPA試劑，再加入200 μL 5 mg/mL樣品液，混合均勻后于35 ℃水浴2 min，在340 nm波長處測定溶液吸光度，接枝度按下式計(jì)算：

式中：A0為原蛋白質(zhì)自由氨基總量；A1為糖基化蛋白質(zhì)自由氨基的含量。

1.3.5 機(jī)械性能的測定

參照Liu Jun等[26]的測試方法并適當(dāng)修改，采用質(zhì)構(gòu)儀測定薄膜的抗拉強(qiáng)度和斷裂伸長率。將回軟48 h的薄膜樣品裁剪成長條狀（70 mm×15 mm），固定于TA-DGA探頭進(jìn)行拉伸測試，設(shè)定目標(biāo)值為50 mm，觸發(fā)點(diǎn)負(fù)載為0.1 N，測試速率為0.5 mm/s，每個(gè)樣品重復(fù)5 次?？估瓘?qiáng)度和斷裂伸長率按下式計(jì)算：

式中：F為峰值負(fù)載/N；W為薄膜樣品寬度/mm；d為薄膜樣品厚度/mm；ΔL為峰值負(fù)載變形量；L0為樣品初始長度。

1.3.6 顏色的測定

采用色差儀對薄膜的色澤進(jìn)行測定。在薄膜樣品上隨機(jī)選取5 處測定并記錄樣品的L*、a*、b*及ΔE值，取其平均值。

1.3.7 不透明度的測定

參考Noshirvani等[27]的方法使用紫外分光光度計(jì)測定薄膜的不透明度。將薄膜樣品裁剪成矩形（1 cm×4 cm），將其貼于比色皿內(nèi)表面，以空比色皿為空白對照，分別測定樣品在600 nm波長處的吸光度，每個(gè)膜樣品重復(fù)測定3 次，取平均值。按式（4）計(jì)算膜的不透明度：

式中：A600nm為薄膜在600 nm波長處的吸光度；x為薄膜厚度/mm。

1.3.8 膨脹率的測定

將每組薄膜樣品裁剪出3 塊2 cm×2 cm的正方形，分別將其在105 ℃烘箱中干燥至質(zhì)量恒定（M1）后，放于50 mL、20 ℃的蒸餾水中浸泡5 min，取出后用濾紙吸干薄膜表面水分，準(zhǔn)確稱量記為M2，薄膜膨脹率按式（5）計(jì)算：

1.3.9 水溶性的測定

將每組薄膜樣品裁剪出3 塊2 cm×2 cm的正方形，分別將其在105 ℃烘箱中干燥至質(zhì)量恒定（W1）后，放于50 mL、20 ℃的蒸餾水中持續(xù)攪拌24 h，將不溶物取出后再次放于105 ℃烘箱中干燥至質(zhì)量恒定（W2），薄膜水溶性按式（6）計(jì)算：

1.3.10 水蒸氣透過率的測定

參照GB 1037—70《塑料透濕性試驗(yàn)方法》和Liu Jun等[28]的方法，本實(shí)驗(yàn)采用“擬杯子法”進(jìn)行。將薄膜樣品密封（確保水分僅通過薄膜遷移）在裝滿無水氯化鈣的25 mL燒杯口，稱量后放于盛有蒸餾水的干燥器中，相對濕度為100%，溫度為20 ℃。每隔12 h稱量杯子的質(zhì)量，持續(xù)7 d，每組樣品測量3 個(gè)平行。薄膜水蒸氣透過率按式（7）計(jì)算：

式中：m為燒杯質(zhì)量增量/g；d為薄膜厚度/m；t為稱量時(shí)間間隔/ s ；A為水分有效遷移面積（12.56×10-4m2）；ΔP為測試溫度下薄膜兩側(cè)蒸汽壓差（20 ℃，2.339 kPa）。

1.3.11 熱特性分析

利用差示掃描量熱儀對薄膜進(jìn)行熱特性分析，準(zhǔn)確稱取5 mg蛋白膜樣品于坩堝中壓片，以空坩堝為對照，放置在差示掃描量熱儀中樣品臺上，采用氮?dú)猓∟2）保護(hù)，以10 ℃/min的升溫速率在25～250 ℃范圍內(nèi)掃描，通過TA Universal Analysis軟件分析得出樣品的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（Tg）、變性溫度（Tm）和熱焓值（ΔH）。

1.3.12 微觀結(jié)構(gòu)測定

采用掃描電子顯微鏡對薄膜樣品的表面及橫截面結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。將薄膜樣品于50 ℃條件下放置12 h烘干，再采用液氮冷凍將薄膜破碎，取適當(dāng)大小的樣品固定于樣品臺上并噴金鍍膜，在1.0 kV電壓下觀察薄膜結(jié)構(gòu)。

1.3.13 傅里葉紅外光譜分析

采用紅外光譜衰減全反射法對薄膜樣品進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜。測試范圍為4000～400 cm-1，以同條件下空氣作為掃描背景。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 薄膜機(jī)械性能分析

2.1.1 糖基化改性條件對RBP-G膜機(jī)械性能的影響

將RBP糖基化改性后制備薄膜，以期達(dá)到提高RBP膜性能的目的。而機(jī)械性能體現(xiàn)了膜材料在食品包裝、運(yùn)輸及貯藏過程中的應(yīng)力承載能力和耐用性，是評價(jià)生物質(zhì)包裝材料最重要的一項(xiàng)指標(biāo)，其可用抗拉強(qiáng)度和斷裂伸長率衡量。前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，糖基化改性條件中G與RBP質(zhì)量比對薄膜的成膜性影響最大，改變反應(yīng)時(shí)間薄膜的抗拉強(qiáng)度僅提升22.97%～77.00%，改變反應(yīng)pH值抗拉強(qiáng)度僅升高1.16%～55.81%。故本實(shí)驗(yàn)僅對G與RBP質(zhì)量比進(jìn)行探討，G與RBP質(zhì)量比對RBP-G膜機(jī)械性能影響如圖1所示。同時(shí)，測定不同質(zhì)量比得到的糖基化改性RBP的接枝度，結(jié)果如圖2所示。

圖1 G與RBP質(zhì)量比對RBP-G膜機(jī)械性能的影響Fig.1 Effect of mass ratio of glucose to RBP on mechanical properties of RBP-G films

圖2 G與RBP質(zhì)量比對接枝度的影響Fig.2 Effect of mass ratio of glucose to RBP on grafting degree

由圖2可知，當(dāng)G與RBP質(zhì)量比低于1∶2時(shí)，接枝度較低，這主要是因?yàn)榈鞍诐舛容^大導(dǎo)致體系黏度較大，從而使得糖基化反應(yīng)程度較小[29]。隨著糖濃度的增大，糖分子的羰基與蛋白的氨基碰撞機(jī)會加大，糖基化程度顯著增加，在G與RBP質(zhì)量比為1∶1～3∶1范圍內(nèi)，接枝度提升至24.54%～27.87%，說明此時(shí)G對RBP有較好的修飾效果。同時(shí)，由圖1可以看出，隨改性過程中G使用量增大，RBP-G膜的斷裂伸長率不斷增大，抗拉強(qiáng)度逐漸降低，且抗拉強(qiáng)度在G與RBP質(zhì)量比高于1∶1后變化不顯著（P＞0.05）。與RBP膜相比，RBP-G膜的抗拉強(qiáng)度提升了24.00%～80.00%，而斷裂伸長率在G與RBP質(zhì)量比達(dá)到1∶1后顯著增強(qiáng)，較RBP膜提升了29.45%～45.93%，結(jié)合圖2可知此范圍內(nèi)糖基化改性蛋白的接枝度較高。由此推斷，美拉德反應(yīng)過程中蛋白質(zhì)氨基和G羰基結(jié)合能夠使薄膜內(nèi)部形成更加穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，薄膜更加堅(jiān)固柔韌、機(jī)械性能提高?；谝陨辖Y(jié)果，綜合考慮得出G與RBP質(zhì)量比為1∶1時(shí)的RBP-G膜具有較好的機(jī)械性能（抗拉強(qiáng)度和斷裂伸長率為0.96 MPa、113.05%，較RBP膜抗拉強(qiáng)度提高28.00%，斷裂伸長率提高33.13%），故選擇對其進(jìn)行后續(xù)其他物理性能的對比分析和結(jié)構(gòu)表征。

2.1.2 RBP-G與CS質(zhì)量比對RBP-G-CS膜機(jī)械性能的影響

如圖3所示，RBP-G-CS膜的抗拉強(qiáng)度隨著CS使用量的增加呈先升高后降低的趨勢，在RBP-G與CS質(zhì)量比為6∶1時(shí)僅為0.92 MPa，而兩者比例為1∶1時(shí)達(dá)到最大值（2.23 MPa），此時(shí)較RBP-G膜（G∶RBP=1∶1）提高了1.32 倍。分析原因，可能是CS的加入引入了大量羥基，羥基可與蛋白分子中的氨基和羧基結(jié)合，從而形成穩(wěn)定作用力，使薄膜的力學(xué)強(qiáng)度增強(qiáng)，抗拉強(qiáng)度變大[30-31]，而當(dāng)CS比例繼續(xù)加大，膜液流動性變差，削弱了多糖與蛋白之間的作用力[32]。而RBP-G-CS膜的斷裂伸長率隨CS占比的增加從76.68%升高至185.38%，當(dāng)RBP-G與CS質(zhì)量比為1∶1時(shí)薄膜的抗拉強(qiáng)度和斷裂伸長率較RBP膜分別提高了197.33%、84.42%，其斷裂伸長率是RBP-G膜（G∶RBP=1∶1）的1.39 倍。這可能是由于RBP-G膜中分子排列較緊密，CS的加入使得分子排列較之前松散，從而使得復(fù)合膜在拉伸過程中可產(chǎn)生較大形變，楊艷妍[33]和沈凱青[34]研究也表明CS的加入在一定范圍內(nèi)可以顯著改善生物質(zhì)薄膜的機(jī)械性能?；谝陨蠈Ρ∧C(jī)械性能的分析，RBP-G與CS質(zhì)量比為1∶1時(shí)，RBP-G-CS膜表現(xiàn)出較好的機(jī)械性能，選定其進(jìn)行后續(xù)其他物理性能的對比分析和結(jié)構(gòu)表征。

圖3 RBP-G與CS質(zhì)量比對RBP-G-CS薄膜機(jī)械性能的影響Fig.3 Effect of RBP-G to CS ratio on the mechanical properties of RBP-G-CS films

2.2 薄膜表觀分析

對優(yōu)化后的RBP膜、RBP-G膜、RBP-G-CS膜的色澤及不透明度進(jìn)行測定，結(jié)果如表1所示，樣品外觀如圖4所示。色澤是薄膜重要的感官性質(zhì)之一，會對其應(yīng)用產(chǎn)生直接影響。與RBP膜相比，RBP-G膜亮度（L*）雖有所提升，但紅度（a*）、黃度（b*）及色差值（ΔE）也有所增加，這表明經(jīng)糖基化改性后蛋白膜的色澤更深，更偏向于紅黃色，這與美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的類黑素類物質(zhì)有關(guān)[35]，此結(jié)果顯示與Cho[36]和Rocha[37]等的研究一致。相較于對照組RBP膜（圖4A），RBP-G膜（圖4B）的背景字體清晰度有所提升，且其不透明度較RBP膜降低3.94%。

表1 不同薄膜樣品的色澤和不透明度Table 1 Color and opacity of different film samples

圖4 不同薄膜樣品圖片F(xiàn)ig.4 Pictures of different film samples

添加CS后的RBP-G-CS膜的色澤較RBP膜和RBP-G膜有很大改善，L*值由61.53提升至78.02，a*、b*和ΔE*值均顯著降低（P＜0.05），這與CS膜本身較好的色澤有關(guān)，且Lee等[38]也發(fā)現(xiàn)CS的加入可以顯著改善啤酒糟蛋白膜的表觀色澤。RBP-G-CS膜的不透明度與RBP膜相比降低了16.80%，結(jié)合圖4可以看出，RBP-G-CS膜（圖4C）的背景字體清晰度顯著優(yōu)于RBP膜和RBP-G膜，即薄膜的透明度得到顯著改善，RBP與CS具備較好的相容性，同時(shí)，CS的加入使得復(fù)合膜表面更加均勻，RBP-G-CS膜具備更加優(yōu)質(zhì)的外觀。

2.3 薄膜物性分析

膨脹率和溶解度可反映出薄膜的耐水性能，所有薄膜樣品在蒸餾水中浸泡過后均可完整取出。RBP-G膜的膨脹率和水溶性較RBP膜僅分別降低了3.77%、5.19%，而RBP-G-CS膜與RBP-G膜相比，膨脹率和水溶性分別降低了76.30%、51.52%，一方面是CS本身在中性水中溶解度極低，所以復(fù)合膜的膨脹率和溶解度因CS的加入而降低；另一方面是RBP-G與CS發(fā)生交聯(lián)，親水作用位點(diǎn)減少，從而導(dǎo)致復(fù)合膜的耐水性優(yōu)于單一基質(zhì)薄膜。

水蒸氣透過率代表薄膜的阻水性，對食品品質(zhì)有直接的影響，水蒸氣透過率越低則阻水性越好。RBP經(jīng)糖基化改性后，結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，暴露出更多疏水基團(tuán)，同時(shí)，蛋白分子在成膜過程中可以交聯(lián)成致密結(jié)構(gòu)，從而使RBP-G膜的水蒸氣透過率較RBP膜降低了16.09%，即RBP經(jīng)糖基化改性后制得的薄膜阻水性明顯提高。而CS的加入可以與糖基化RBP位點(diǎn)結(jié)合形成氫鍵[34,39]，使水蒸氣分子運(yùn)動受阻，從而進(jìn)一步提高薄膜的阻水性，RBP-G-CS膜的阻水性較RBP-G膜、RBP膜分別提高了15.62%、29.20%。

本研究通過測定薄膜的Tg、Tm和ΔH比較不同薄膜樣品的熱穩(wěn)定性。由表2可以看出，RBP-G膜的Tg、Tm和ΔH較RBP膜分別提高了1.17 ℃、1.28 ℃、5.09 J/g，說明糖基化改性后RBP膜的熱穩(wěn)定性有所提高，這與郭浩等[16]的研究結(jié)果一致。這是因?yàn)樘腔男院?，RBP與G結(jié)合成了糖蛋白的形式，其空間結(jié)構(gòu)的變化導(dǎo)致了熱穩(wěn)定性的變化[40]，美拉德反應(yīng)提高了蛋白成膜后的熱穩(wěn)定性。當(dāng)加入CS后，復(fù)合膜的熱穩(wěn)定性表現(xiàn)最佳，Tg較RBP膜提高了7.30 ℃，Tm較RBP膜提高了4.77 ℃，而ΔH是RBP膜的2.35 倍、較RBP-G膜亦提高了38.97%。復(fù)合膜熱穩(wěn)定性的提高可能是因?yàn)镃S的加入引入了極性基團(tuán)，從而加強(qiáng)了蛋白分子間的交聯(lián)，增強(qiáng)了RBP-G和CS分子間的相互作用力[21]。此外，在本研究的前期實(shí)驗(yàn)測得單一CS膜的Tg為94.77 ℃、Tm為119.37 ℃、ΔH為50.59 J/g，故復(fù)合膜熱穩(wěn)定的增加一定程度上也可能與CS成膜后較好的熱特性有關(guān)。

表2 不同薄膜樣品的物理性能Table 2 Physical properties of different film samples

2.4 薄膜微觀結(jié)構(gòu)分析

如圖5所示，RBP膜表面有較多細(xì)小孔洞和凸起顆粒狀形態(tài)，內(nèi)部有較多大小不一的深邃孔洞存在。RBP-G膜表面孔洞較RBP膜明顯減少，僅有些許凸起，膜表面變的更加平整光滑，同時(shí)如圖5B2所示內(nèi)部深邃的孔洞數(shù)量明顯減少，內(nèi)部結(jié)構(gòu)更加緊致，但有較強(qiáng)的顆粒感，質(zhì)地不均勻。而RBP-G-CS膜的表面未見明顯的孔洞，僅呈現(xiàn)出較不均勻的狀態(tài)，橫截面電鏡圖顯示其內(nèi)部雖有些許孔洞，但其質(zhì)地是連續(xù)的且較RBP膜和RBP-G膜更加細(xì)膩，并未出現(xiàn)明顯的相分離或斷層現(xiàn)象，復(fù)合膜內(nèi)部結(jié)構(gòu)更加均勻致密，故而其表現(xiàn)出最佳的耐水性、水蒸氣透過率和機(jī)械強(qiáng)度。薄膜上述性能的提高也表明了糖基化RBP與CS相對兼容，其截面的某些孔洞說明兩者混合只是出現(xiàn)了微小的微相分離。

圖5 不同薄膜樣品掃描電鏡圖Fig.5 SEM images of different film samples

2.5 薄膜分子間相互作用分析

如圖6 所示，與RBP膜相比，RBP-G膜在3600～3100 cm-1范圍的—OH 吸收峰 和1100～1040 cm-1范圍的C—O吸收峰明顯增強(qiáng)，酰胺I帶（1700～1600 cm-1）、酰胺II帶（1600～1500 cm-1）和酰胺III帶（1400～1200 cm-1）的蛋白特征峰均有所減弱，表明共價(jià)結(jié)合后接枝產(chǎn)物中的羥基增加[16]，且G中的羰基和RBP中的氨基因發(fā)生了羰氨縮合反應(yīng)而被消耗，從而證實(shí)糖和蛋白之間發(fā)生了美拉德反應(yīng)[40]。當(dāng)RBP-G與CS兩種大分子物質(zhì)作用形成RBP-G-CS膜時(shí)，其圖譜相對于RBP膜產(chǎn)生了較大差異。將CS添加到RBP-G中成膜后，RBP-G-CS膜酰胺I帶和酰胺II帶的峰強(qiáng)減弱，峰位置出現(xiàn)微小變化，最明顯的變化是復(fù)合膜在3500～3100 cm-1范圍內(nèi)的—OH和—NH2伸縮振動峰寬度增加，面積增大，在2917～2850 cm-1附近—CH3的吸收峰減弱，在1156 cm-1處（C3上的—OH）的吸收峰減弱，這些變化說明RBP-G和CS形成了穩(wěn)定的分子間和分子內(nèi)的氫鍵[39,41]。

圖6 不同薄膜樣品傅里葉變換紅外光譜圖Fig.6 FTIR spectra of different film samples

2.6 薄膜二級結(jié)構(gòu)含量分析

對3 種薄膜樣品的紅外光譜圖（圖6）中的1700～1600 cm-1進(jìn)行擬合分峰，利用Peakfit和面積法得出各薄膜樣品中二級結(jié)構(gòu)的占比，擬合曲線如圖7所示，相對含量如表3所示。與RBP膜相比，RBP-G膜中的α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角相對含量增加，這是因?yàn)樘腔男允沟肦BP結(jié)構(gòu)舒展，內(nèi)部氨基酸殘基暴露，在后續(xù)成膜過程中又重新排列結(jié)合[40]，作用力有所改變，從而形成如圖5所示緊密的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。與RBP膜和RBP-G膜相比，添加CS后的RBP-G-CS膜中的β-折疊和β-轉(zhuǎn)角相對含量分別增加了5.88%～5.99%、8.74%～8.84%，而無規(guī)卷曲和α-螺旋相對含量顯著降低。有研究者表明無規(guī)卷曲會破壞薄膜內(nèi)部結(jié)構(gòu)，而β-折疊和β-轉(zhuǎn)角相對含量的升高會改善薄膜的機(jī)械性能，提升薄膜的耐水性[42-43]，而本研究所制備的薄膜物理性能變化（2.1節(jié)和2.3節(jié)）也與此觀點(diǎn)相印證。

表3 不同薄膜樣品二級結(jié)構(gòu)相對含量Table 3 Secondary structure contents of different film samples%

圖7 不同薄膜樣品傅里葉變換紅外光譜二級結(jié)構(gòu)擬合圖Fig.7 Fitting curves of FTIR spectra for secondary structure analysis of different film samples

3 結(jié)論

首先以機(jī)械性能為指標(biāo)，分析糖基化過程中原料配比和復(fù)合膜原料配比對薄膜的影響，結(jié)果顯示當(dāng)G與RBP質(zhì)量比為1∶1、RBP-G與CS質(zhì)量比為1∶1時(shí)，得到的RBP-G膜和RBP-G-CS膜具有較好的抗拉強(qiáng)度和斷裂伸長率。其次，對比分析RBP-G-CS膜、RBP-G膜與RBP膜的其他性能發(fā)現(xiàn)，糖基化改性可以顯著提高RBP膜的耐水性、阻水性和耐熱性，CS的加入對薄膜表觀色澤及各項(xiàng)性能有更顯著的改善效果，其膨脹率較RBP膜和RBP-G膜分別降低77.19%、76.30%，水溶性分別降低54.04%、51.52%，水蒸氣透過率分別降低29.20%、15.62%，熱焓值分別升高134.82%、38.97%。RBP-G膜的掃描電子顯微鏡和紅外光譜結(jié)果證實(shí)了糖基化改性后美拉德反應(yīng)對薄膜性能和微觀結(jié)構(gòu)的改善作用，RBP-G-CS膜的掃描電子顯微鏡和紅外光譜結(jié)果則顯示了RBP-G與CS存在較可觀的相容性和較強(qiáng)的氫鍵作用，分子間相互作用及二級結(jié)構(gòu)改變有效改善了薄膜的物理性能。因此，利用糖基化對蛋白進(jìn)行改性處理并與CS復(fù)配制備復(fù)合膜能夠有效改善蛋白膜的各項(xiàng)性能，本研究可為RBP的應(yīng)用及新型食品包裝材料的開發(fā)提供一定理論基礎(chǔ)。