劉瑞娜,奚文韜,趙東,張?zhí)靾A,鄭佳,張京濤,姚粟*,翟磊*

1(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司,中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心,北京,100015)2(宜賓五糧液股份有限公司,四川 宜賓,644000)

白酒在中國(guó)有著悠久的釀造和飲用歷史,是中國(guó)各種傳統(tǒng)酒類(lèi)(除果酒、米酒外)的統(tǒng)稱(chēng)。1979年全國(guó)第三屆評(píng)酒大會(huì)根據(jù)不同釀造工藝、制曲方式和風(fēng)味特征等首次正式提出并確立了濃香型、清香型、醬香型、米香型和其他香型5種白酒香型[1-2]。目前市場(chǎng)上的白酒香型主要是以4種基礎(chǔ)香型為主的12種香型,其中作為行業(yè)占比第一大香型的濃香型白酒因其“窖香濃郁、綿柔甘冽、香味協(xié)調(diào)、尾凈余長(zhǎng)”的風(fēng)味特點(diǎn)被譽(yù)為“中國(guó)白酒典范”[2-4]。2021年濃香型白酒最新標(biāo)準(zhǔn)GB/T 10781.1—2021《白酒質(zhì)量要求 第1部分:濃香型白酒》正式發(fā)布,對(duì)濃香型白酒給出明確定義:以糧谷為原料,采用濃香大曲為糖化發(fā)酵劑,經(jīng)泥窖固態(tài)發(fā)酵,固態(tài)蒸餾、陳釀、勾調(diào)而成的,不直接或間接添加食用酒精及非自身發(fā)酵產(chǎn)生的呈色呈香呈味物質(zhì)的白酒。濃香型白酒采用泥窖作為發(fā)酵載體,已有研究表明在“泥窖生香”的微生態(tài)機(jī)制中主要包含2個(gè)發(fā)酵體系:酒醅發(fā)酵體系和窖泥發(fā)酵體系。2個(gè)優(yōu)勢(shì)菌群全然不同的體系中,微生物在發(fā)酵過(guò)程中發(fā)生了菌群的遷移富集和代謝產(chǎn)物的傳遞交換,共同影響著濃香型白酒典型“窖香”的形成。老窖出好酒,在連續(xù)不斷的生產(chǎn)過(guò)程中,窖泥中的營(yíng)養(yǎng)成分和特征特性不斷發(fā)生變化,微生物的群落結(jié)構(gòu)不斷的進(jìn)行演替,形成了適合于白酒釀造的特有的微生物群落,并最終決定了濃香型白酒的品質(zhì)[5-8]。目前對(duì)濃香型白酒釀造過(guò)程中窖池微生物體系與其酒體品質(zhì)及風(fēng)味特征相關(guān)機(jī)理的研究有了一定的進(jìn)展,但三者之間的互作機(jī)制和內(nèi)在關(guān)聯(lián)仍未完全解析。

濃香型白酒窖池中微生物群落結(jié)構(gòu)的解析以及特征微生物資源的發(fā)掘?qū)沂景拙漆勗祜L(fēng)味機(jī)理、提升白酒品質(zhì)、加強(qiáng)質(zhì)量管理具有重要意義。目前白酒窖池中微生物群落結(jié)構(gòu)研究主要采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)變性梯度凝膠電泳(PCR-denatured gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)[9]、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(PCR-single strand conformation polymorphism,PCR-SSCP)[10]、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)[11]、宏基因組學(xué)和宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)[12-14]及高通量測(cè)序[5,15]等非培養(yǎng)技術(shù),該類(lèi)技術(shù)可以獲得窖泥微生物菌群的定性及相對(duì)定量信息[16],但對(duì)其中功能微生物的篩選與作用機(jī)制解析仍需獲得微生物純培養(yǎng)物?？膳囵B(yǎng)組學(xué)(culturomics)是綜合利用多種培養(yǎng)條件進(jìn)行微生物菌種的分離培養(yǎng),并通過(guò)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)和16S rDNA基因測(cè)序技術(shù)對(duì)分離菌種進(jìn)行大規(guī)模鑒定,盡可能多地獲得在常規(guī)培養(yǎng)條件下不可培養(yǎng)微生物的一種技術(shù)[17-18]。本研究依據(jù)濃香型白酒窖池中微生物群落結(jié)構(gòu)特征,設(shè)計(jì)和優(yōu)化了7種篩選培養(yǎng)基,開(kāi)展了窖池中功能微生物,尤其是難培養(yǎng)厭氧微生物資源的發(fā)掘。根據(jù)不同分離篩選條件和分離生境的可培養(yǎng)細(xì)菌種類(lèi)和豐度,確定了濃香型白酒窖池特征菌,并解析特征菌的生物學(xué)特性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 儀器與試劑

HG-50高壓滅菌鍋,日本平山制作所株式會(huì)社;移液器(100 μL、1 mL、5 mL),德國(guó)Eppendorf公司;AC2-4S1生物安全柜,新加坡藝思高科技有限公司;DG-250厭氧工作站,英國(guó)Don Whitley Scientific公司;DLQ120-B智能厭氧制備儀,北京愛(ài)思普科技有限公司;BHG-8082型恒溫培養(yǎng)箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;LX-165T2R醫(yī)用離心機(jī),青島海特生物醫(yī)療有限公司;MALDI-TOF MS基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀,德國(guó)Bruker Daltonik GmbH公司;全自動(dòng)革蘭氏染色儀,青島瀾澈生物科技有限公司;厭氧盒,日本三菱化學(xué)公司;ECLIPSE 80i光學(xué)顯微鏡,尼康儀器(上海)有限公司。

0.85%生理鹽水,北京君立康科技發(fā)展有限責(zé)任公司;厭氧產(chǎn)氣袋,日本三菱化學(xué)公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、dNTPs、TaqDNA聚合酶、DNA Marker,天根生化科技(北京)有限公司;溶菌酶、瓊脂糖,北京全式金生物技術(shù)有限公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基的選擇和制備

通過(guò)對(duì)濃香型白酒窖池中微生物群落結(jié)構(gòu)和窖池中特征菌種生理代謝特征研究相關(guān)文獻(xiàn)的調(diào)研[5,19-20],參考KOMODO(Known Media Database)網(wǎng)站(http://komodo.modelseed.org/)中對(duì)不同種屬厭氧微生物培養(yǎng)基配制的建議要求[21],最終選擇了7種培養(yǎng)基進(jìn)行濃香型白酒窖池中可培養(yǎng)細(xì)菌的分離培養(yǎng)研究。TSA培養(yǎng)基和R2A瓊脂培養(yǎng)基作為好氧微生物分離培養(yǎng)基,其中TSA培養(yǎng)基主要用于分離常見(jiàn)好氧菌和不動(dòng)桿菌屬;R2A瓊脂培養(yǎng)基則用于分離苛養(yǎng)好氧菌。改良MRS瓊脂培養(yǎng)基、強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基、苛養(yǎng)厭氧菌瓊脂培養(yǎng)基、改良PYG培養(yǎng)基和蛋白瘤胃球菌培養(yǎng)基作為厭氧微生物分離培養(yǎng)基,分別用于片球菌屬/乳桿菌屬、梭菌屬、苛養(yǎng)厭氧菌、喜熱菌屬/普雷沃氏菌屬和瘤胃球菌屬等厭氧或兼性厭氧微生物的選擇性分離。7種培養(yǎng)基的配方如下,滅菌條件均為121 ℃、15 min。

TSA培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨15.0,大豆蛋白胨5.0,NaCl 5.0,瓊脂15.0。

R2A瓊脂培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨0.5,酵母粉0.5,酪蛋白胨0.5,葡萄糖0.5,可溶性淀粉0.5,K2HPO40.3,丙酮酸鈉 0.3,MgSO40.024,瓊脂15.0加熱溶解。

改良MRS瓊脂培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10.0,牛肉膏10.0,酵母粉5.0,葡萄糖20.0,檸檬酸銨2.0,吐溫80 1.0 mL,半胱氨酸鹽酸鹽0.5,CH3COONa 5.0,K2HPO42.0,MgSO47H2O 0.1,MnSO40.05,瓊脂 15.0。

強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10.0,牛肉膏10.0,酵母粉3.0,葡萄糖5.0,NaCl 5.0,可溶性淀粉1.0,CH3COONa 5.0,半胱氨酸鹽酸鹽0.5,瓊脂15.0。

苛養(yǎng)厭氧菌瓊脂培養(yǎng)基(g/L):混合蛋白胨23.0,NaCl 5.0,可溶性淀粉1.0,葡萄糖1.0,C3H3NaO31.0,L-精氨酸1.0,琥珀酸鈉0.5,半胱氨酸鹽酸鹽0.5,NaHCO30.4,可溶性焦磷酸0.25,氯化血紅素0.01,維生素K 0.001,瓊脂15.0。

改良PYG培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨 5.0,蛋白胨 5.0,酵母粉 10.0,牛肉膏 5.0,葡萄糖 5.0,K2HPO42.0,吐溫-80 1.0 mL,NaHCO30.4,NaCl 0.08,KH2PO40.04,MgSO47H2O 0.02,CaCl22H2O 0.01,刃天青 1.0 mg/L。加熱煮沸3～5 min,冷卻后添加氯化血紅素5 mg/L、維生素K11 mg/L、半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g/L和瓊脂15.0 g/L,pH 7.2。

蛋白瘤胃球菌培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨 5.0,酵母粉 2.0,葡萄糖 3.0,纖維二糖 2.0,(NH4)2SO40.8,NaCl 0.48,KH2PO40.24,K2HPO40.24, MgSO47H2O 0.1,CaCl27H2O 0.064,刃天青 1.0 mg/L。加熱煮沸3～5 min,冷卻后添加Na2CO34.0 g/L、脂肪酸溶液1 mL/L、半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g/L和瓊脂15.0 g/L,pH 7.0。

1.1.3 樣品采集

樣品采集自四川省宜賓市某濃香型白酒生產(chǎn)企業(yè)3個(gè)車(chē)間的窖池,3個(gè)窖池的窖齡分別為30年、20年和15年,樣品來(lái)源包括窖泥和酒醅。窖泥樣品分別從距地面約0.3、1、2 m的窖池四壁和底部采集,3個(gè)窖池的窖泥樣品混勻作為窖泥待檢樣品;酒醅樣品采用五點(diǎn)取樣法,從四周和中間采集,3個(gè)窖池的酒醅樣品混勻作為酒醅待檢樣品。窖泥和酒醅樣品均從出池當(dāng)天(2022年1月13日)的一批窖池中采樣獲得,采集后的樣品密封,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

設(shè)計(jì)7種不同篩選分離培養(yǎng)基,采用好氧和厭氧的培養(yǎng)方式,結(jié)合MALDI-TOF MS和16S rDNA基因測(cè)序技術(shù)對(duì)濃香型白酒窖泥和酒醅樣品中的細(xì)菌進(jìn)行大規(guī)模分離篩選和鑒定,本實(shí)驗(yàn)建立的白酒窖池中可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性研究的技術(shù)路線(xiàn)如圖1所示。

圖1 濃香型白酒窖池中可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性研究技術(shù)路線(xiàn)Fig.1 Technical route of culturable bacteria diversity research in strong-flavor Baijiu cellars

1.2.1 好氧微生物的分離純化

在生物安全柜中分別稱(chēng)取25 g窖泥待檢樣品和酒醅待檢樣品于225 mL無(wú)菌生理鹽水中,充分混勻制備成1∶10樣品稀釋液,吸取1 mL稀釋液加入9 mL無(wú)菌生理鹽水,充分混勻制備成1∶100樣品稀釋液,重復(fù)上述操作對(duì)樣品進(jìn)行梯度稀釋,取2～3個(gè)合適濃度的稀釋液分別涂布于TSA培養(yǎng)基和R2A瓊脂培養(yǎng)基平板上,37 ℃培養(yǎng)3 d。從2種培養(yǎng)基平板上選取菌落形態(tài)不同的單菌落,在對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基平板上四區(qū)劃線(xiàn)分純,37 ℃培養(yǎng)3 d。重復(fù)上述操作對(duì)分離菌株進(jìn)行純化,根據(jù)菌落形態(tài)和革蘭氏染色鏡檢確認(rèn),將純化后的分離菌株編號(hào)并轉(zhuǎn)移至含15%無(wú)菌甘油的甘油管中,-80 ℃冰箱保藏備用。

1.2.2 厭氧微生物的分離純化

為最大限度地分離獲得濃香型白酒窖池中不同生長(zhǎng)特性的厭氧微生物,對(duì)厭氧菌的分離采用2種方法:平板涂布法和滾管法。

平板涂布法:試驗(yàn)前一天將無(wú)菌生理鹽水、5種厭氧微生物分離培養(yǎng)基放置于厭氧工作站中過(guò)夜置換除氧,刃天青作為指示劑確認(rèn)氧氣除凈。試驗(yàn)當(dāng)天,在厭氧操作臺(tái)分別稱(chēng)取25 g窖泥待檢樣品和酒醅待檢樣品于225 mL無(wú)菌生理鹽水中,充分混勻制備成1∶10樣品稀釋液,吸取1 mL稀釋液加入9 mL無(wú)菌生理鹽水,充分混勻制備成1∶100樣品稀釋液,重復(fù)上述操作對(duì)樣品進(jìn)行梯度稀釋,取2～3個(gè)合適濃度的稀釋液分別涂布于5種厭氧培養(yǎng)基平板上,37 ℃厭氧培養(yǎng)3 d后參考好氧微生物純化及保藏方法在厭氧操作臺(tái)中對(duì)厭氧分離菌株四區(qū)劃線(xiàn)分純和-80 ℃冰箱甘油管保藏。

滾管法:5種分裝到厭氧管中的厭氧微生物分離培養(yǎng)基經(jīng)智能厭氧制備儀置換除氧后高溫滅菌,將滅菌后的液態(tài)瓊脂培養(yǎng)基厭氧管于50 ℃水浴鍋中保溫備用。用無(wú)菌注射器吸取100 μL于厭氧工作站中稀釋至適宜梯度的樣品稀釋液加入到厭氧管中,平放至盛有碎冰塊的容器中迅速滾動(dòng),使帶菌培養(yǎng)基在厭氧管內(nèi)壁形成均勻的薄膜,完全凝固的厭氧管置于厭氧袋中37 ℃厭氧培養(yǎng)3 d。在厭氧工作站中用無(wú)菌針頭挑取厭氧管內(nèi)壁上菌落形態(tài)不同的單菌落,轉(zhuǎn)接至相應(yīng)的液體培養(yǎng)基厭氧管中37 ℃厭氧培養(yǎng)2 d。將梯度稀釋后的厭氧管中的菌液用無(wú)菌注射器再次加入到液態(tài)瓊脂培養(yǎng)基厭氧管中冰浴滾管。重復(fù)上述操作對(duì)厭氧管分離菌株進(jìn)行純化,至觀察菌落和菌體形態(tài)均一后編號(hào)保藏于-80 ℃冰箱備用。

1.2.3 分離菌株MALDI-TOF MS鑒定

采用MALDI-TOF MS鑒定系統(tǒng)對(duì)分離菌株進(jìn)行快速鑒定,以初步確定分離菌株的分類(lèi)學(xué)地位[22]。該方法主要通過(guò)采集微生物穩(wěn)定表達(dá)的核糖體蛋白指紋圖譜,與已知微生物菌種蛋白指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析后,得到待測(cè)菌株的鑒定結(jié)果及置信水平,實(shí)現(xiàn)微生物菌種的快速鑒定[23-24]。本研究使用的MALDI-TOF MS鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)包括10 833株菌,其中革蘭氏陰性菌4 318株,革蘭氏陽(yáng)性菌5 572株,酵母菌和絲狀真菌943株。

根據(jù)GB/T 33682—2017《基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒別微生物方法通則》中甲酸提取法對(duì)分離菌株進(jìn)行MALDI-TOF MS鑒定:分別挑取各待測(cè)菌株菌落于盛有300 μL超純水的1.5 mL離心管中,充分混勻后加入900 μL無(wú)水乙醇(色譜純),旋渦振蕩1 min離心菌體細(xì)胞(13 000 r/min,2 min),棄去上清液,重復(fù)離心操作,用移液器吸凈上清液后向沉淀中加入50 μL 70%的甲酸水溶液,旋渦振蕩重懸菌體,再加入50 μL乙腈混合均勻,13 000 r/min離心2 min,吸取1 μL上清液點(diǎn)樣在樣品靶板孔中,待室溫下晾干后滴加1 μL α-氰基-4-羥基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid,HCCA)基質(zhì)溶液覆蓋在每個(gè)樣本上,室溫下自然晾干。將點(diǎn)樣完成的靶板放入儀器中,按照儀器操作規(guī)程設(shè)置參數(shù)后采集待測(cè)菌株蛋白指紋圖譜。采集到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入本地微生物指紋圖譜庫(kù),在鑒定系統(tǒng)中得到待測(cè)菌株的鑒定結(jié)果。

1.2.4 分離菌株DNA提取和16S rDNA及功能基因測(cè)序

對(duì)于MALDI-TOF MS鑒定未得到結(jié)果的菌株,則采用16S rDNA及功能基因測(cè)序技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。按照TIANGEN細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作步驟提取各分離菌株的基因組DNA,-20 ℃保存?zhèn)溆?。分離菌株的16S rDNA測(cè)序PCR擴(kuò)增以27F和1492R為引物,功能基因gyrB測(cè)序PCR擴(kuò)增以gyrB-F(5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′)和gyrB-R(5′-AG-CAGGATACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTC-NGTCAT-3′)為上下游引物,反應(yīng)體系參考文獻(xiàn)[25]的方法。PCR完成后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,以檢測(cè)DNA提取質(zhì)量。將條帶清晰且無(wú)雜帶的擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.2.5 特征菌種系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)不同分離篩選條件和分離生境的可培養(yǎng)細(xì)菌種類(lèi)和豐度,結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研確定6株濃香型白酒窖池潛在特征菌并對(duì)特征菌種進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析。將測(cè)序得到的各菌株序列整理拼接后提交至GenBank,運(yùn)用Clusta-X軟件對(duì)序列進(jìn)行校正[26],通過(guò)NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)后利用MEGA軟件中的鄰接法(Neighbor-Joining)開(kāi)展序列同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建,自展值(bootstrap value)設(shè)置重復(fù)取樣1 000次。

1.2.6 特征菌種形態(tài)學(xué)特征和生理生化試驗(yàn)

將純化后的6株濃香型白酒窖池特征菌種代表菌株接種于相應(yīng)分離培養(yǎng)基上,觀察不同菌株菌落形態(tài)特征。同時(shí)將分離株菌落通過(guò)戊二醛固定、無(wú)菌水漂洗、乙醇梯度脫水、干燥及離子濺射儀噴金后固定于樣品臺(tái)上,利用掃描電鏡觀察菌株菌體微觀形態(tài)。結(jié)合宏觀和微觀形態(tài)特征參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[27],按照梅里埃API 50 CHB和API 20A鑒定試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)分離菌株進(jìn)行碳源利用等生理生化指標(biāo)檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 濃香型白酒窖池中可培養(yǎng)細(xì)菌分離純化結(jié)果

經(jīng)多次劃線(xiàn)分純及菌落菌體形態(tài)特征排重后,從濃香型白酒窖池中共分離得到來(lái)自21個(gè)屬44個(gè)種的124株細(xì)菌,包括芽胞桿菌屬(Bacillussp.)、淚珠狀產(chǎn)孢菌屬(Lacrimisporasp.)、嗜蛋白菌屬(Proteiniphilumsp.)、類(lèi)芽胞桿菌屬(Paenibacillussp.)和互營(yíng)球菌屬(Syntrophococcussp.)在內(nèi)的9株潛在細(xì)菌新種。厭氧條件分離得到100株分離株,其中PYG培養(yǎng)基35株,蛋白瘤胃球菌培養(yǎng)基18株,苛養(yǎng)厭氧菌培養(yǎng)基18株,強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基13株,MRS培養(yǎng)基16株。在好氧條件下2種好氧培養(yǎng)基分離出24株可培養(yǎng)菌株:富集培養(yǎng)基TSA分離出14株,寡營(yíng)養(yǎng)的R2A培養(yǎng)基分離出10株。厭氧條件下分離得到的微生物數(shù)量顯著高于有氧環(huán)境,表現(xiàn)出更高的豐度。在窖泥和酒醅2種不同的分離生境中,獲得的可培養(yǎng)微生物在數(shù)量方面相差不大,分別分離到60株和64株。

2.2 分離菌株MALDI-TOF MS及16S rDNA鑒定結(jié)果

采用甲酸提取法通過(guò)MALDI-TOF MS快速鑒定系統(tǒng)對(duì)濃香型白酒窖池中分離到的124株可培養(yǎng)微生物進(jìn)行分類(lèi)學(xué)地位確認(rèn)。結(jié)果顯示81株分離株得到種水平的鑒定結(jié)果,占待檢菌株的65.3%。采用16S rDNA測(cè)序技術(shù)對(duì)經(jīng)MALDI-TOF MS鑒定未得到結(jié)果的43株細(xì)菌進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。鑒定分析結(jié)果表明,124株分離菌株均得到種屬水平的鑒定結(jié)果(表1),所有分離株分屬于21個(gè)屬的44種,包括Bacillussp.,Lacrimisporasp.,Proteiniphilumsp.,Paenibacillussp.和Syntrophococcussp.在內(nèi)的9株潛在細(xì)菌新種。

表1 濃香型白酒窖池分離菌株鑒定結(jié)果Table 1 Identification results of strains isolated from the cellars of strong-flavor baijiu

2.3 濃香型白酒窖池中可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性分析

2.3.1 不同分離條件可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性分析

從濃香型白酒窖池中分離得到的124株分離株中,厭氧環(huán)境分離到的100株包含16個(gè)屬的34種。其中PYG培養(yǎng)基分離效果最好,共獲到8個(gè)屬17個(gè)種的共35株細(xì)菌,包括梭菌屬(Clostridiumsp.)、芽胞桿菌屬(Bacillussp.)、淚珠狀產(chǎn)孢菌屬(Lacrimisporasp.)、鼠伴菌屬(Muricomessp.)、嗜熱芽胞桿菌屬(Caldibacillussp.)、嗜蛋白菌屬(Proteiniphilumsp.)、氨基酸桿狀菌屬(Aminobacteriumsp.)、互營(yíng)球菌屬(Syntrophococcussp.)和3株潛在細(xì)菌新種,梭菌屬和芽胞桿菌屬為該培養(yǎng)基中的優(yōu)勢(shì)分離菌種,分別占該培養(yǎng)基總分離株的22.9%和34.3%;蛋白瘤胃球菌培養(yǎng)基分離到6個(gè)屬10個(gè)種的共18株分離株,包括芽胞桿菌屬、淚珠狀產(chǎn)孢菌屬、互營(yíng)球菌屬、腸球菌屬(Enterococcussp.)、類(lèi)芽胞桿菌屬(Paenibacillussp.)、魏茨曼氏菌屬(Weizmanniasp.)和3株潛在新種微生物,芽胞桿菌屬為該培養(yǎng)基中的優(yōu)勢(shì)分離菌種,占該培養(yǎng)基總分離株的44.4%;苛養(yǎng)厭氧菌培養(yǎng)基分離到7個(gè)屬的11種共18株分離株,包括芽胞桿菌屬、淚珠狀產(chǎn)孢菌屬、梭菌屬、嗜熱芽胞桿菌屬、鼠伴菌屬、嗜蛋白菌屬、魏茨曼氏菌屬和1株潛在細(xì)菌新種,芽胞桿菌屬和淚珠狀產(chǎn)孢菌屬為該培養(yǎng)基中的優(yōu)勢(shì)分離菌種,均占該培養(yǎng)基總分離株的22.2%;強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基分離到7個(gè)屬的9種共13株可培養(yǎng)細(xì)菌,包括梭菌屬、芽胞桿菌屬、淚珠狀產(chǎn)孢菌屬、嗜熱芽胞桿菌屬、鼠伴菌屬、魏茨曼氏菌屬、沉積物桿菌屬(Sedimentibactersp.)和1株潛在新種,梭菌屬和鼠伴菌屬為該培養(yǎng)基中的優(yōu)勢(shì)分離菌種,均占該培養(yǎng)基總分離株的23.1%;MRS培養(yǎng)基分離到7個(gè)屬的11種共16株分離株,包括梭菌屬、芽胞桿菌屬、魏茨曼氏菌屬、醋乳桿菌屬(Acetilactobacillussp.)、乳桿菌屬(Lactobacillussp.)、鏈球菌屬(Streptococcussp.)和魏斯氏菌屬(Weissellasp.),乳桿菌屬和鏈球菌屬為該培養(yǎng)基中的優(yōu)勢(shì)分離菌種,分別占該培養(yǎng)基總分離株的37.5%和18.8%。厭氧條件下獲得的分離株中窖池優(yōu)勢(shì)微生物種屬芽胞桿菌屬、梭菌屬及同屬于梭菌目(Clostridiales)的淚珠狀產(chǎn)孢菌屬分離株數(shù)量均占比較大:芽胞桿菌屬分離到4個(gè)種共27株,占厭氧分離株總數(shù)的27%;梭菌屬分離到8個(gè)種共16株,占厭氧分離總數(shù)的16%;淚珠狀產(chǎn)孢菌屬得到4種共12株,占總數(shù)的12%。其他如嗜熱芽胞桿菌屬[28]、乳桿菌屬[29]、鏈球菌屬[30]和嗜蛋白菌屬[31]等濃香型白酒窖池中已報(bào)道的常見(jiàn)微生物菌屬也均獲得了不同數(shù)量的分離株。

好氧條件下的2種培養(yǎng)基分離到9個(gè)屬14個(gè)種的24株可培養(yǎng)菌株。其中TSA培養(yǎng)基分離到9個(gè)屬的11種共14株可培養(yǎng)細(xì)菌,包括梭菌屬、芽胞桿菌屬、鼠伴菌屬、氨基酸桿狀菌屬、棒桿菌屬(Corynebacteriumsp.)、土壤芽胞桿菌屬(Solibacillussp.)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobactersp.)、丙酸桿菌屬(Propionibacteriumsp.)和埃希氏菌屬(Escherichiasp.),梭菌屬和芽胞桿菌屬為該培養(yǎng)基中的優(yōu)勢(shì)分離菌種,均占該培養(yǎng)基總分離株的21.4%;寡營(yíng)養(yǎng)的R2A培養(yǎng)基分離到芽胞桿菌屬的4種共10株分離株,包括1株潛在芽胞桿菌屬新種。有氧條件下分離到的24株可培養(yǎng)細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌屬與厭氧條件分離株相似,數(shù)量較多的也為芽胞桿菌屬和梭菌屬,前者得到5個(gè)種的13株,后者包含2個(gè)種共3株。此外丙酸桿菌屬、土壤芽胞桿菌屬、棒桿菌屬等可培養(yǎng)微生物菌屬在有氧分離培養(yǎng)條件下也均得到了一定數(shù)量的分離菌株。

比較不同分離篩選條件下獲得的可培養(yǎng)細(xì)菌種類(lèi)和豐度,可以發(fā)現(xiàn)在厭氧條件下分離到的細(xì)菌種屬類(lèi)型及數(shù)量均高于有氧環(huán)境,表現(xiàn)出更高的豐度和多樣性。值得注意的是,在有氧和厭氧2種分離培養(yǎng)環(huán)境下獲得的窖池分離菌株數(shù)量最多的均為芽胞桿菌屬和梭菌屬。表明可以通過(guò)優(yōu)化和改良培養(yǎng)基等方式獲得在有氧條件下較難培養(yǎng)的梭菌屬微生物,也可以在厭氧環(huán)境中分離得到部分需氧或兼性厭氧的芽胞桿菌屬微生物。但不同種類(lèi)培養(yǎng)基對(duì)微生物分離篩選能力仍存在一定差異:淚珠狀產(chǎn)孢菌屬在除MRS培養(yǎng)基外的4種厭氧培養(yǎng)基中均獲得一定數(shù)量的分離株;魏茨曼氏菌屬則在除PYG培養(yǎng)基外的4種厭氧培養(yǎng)基中均有分離株出現(xiàn);嗜熱芽胞桿菌屬和鼠伴菌屬在蛋白瘤胃球菌培養(yǎng)基和MRS培養(yǎng)基中未有分離株獲得,但在其余3種培養(yǎng)基中均得到了可培養(yǎng)菌株。而部分種屬的微生物只在特定培養(yǎng)基中有所分離:類(lèi)芽胞桿菌屬和腸球菌屬只在蛋白瘤胃球菌培養(yǎng)基中分離出,分別為1株和2株;氨基酸桿狀菌屬僅在PYG培養(yǎng)基中分離到1株;沉積物桿菌屬只在強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基中分離到2株;醋乳桿菌屬、乳桿菌屬、鏈球菌屬和魏斯氏菌屬則僅在MRS培養(yǎng)基中得到一定數(shù)量的分離株。與R2A相比,TSA培養(yǎng)基由于營(yíng)養(yǎng)成分更豐富,體現(xiàn)出了更優(yōu)良的細(xì)菌分離效果:棒桿菌屬、土壤芽胞桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、丙酸桿菌屬和埃希氏菌屬均僅在該培養(yǎng)基上得到了分離株。

2.3.2 不同分離生境可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性分析

濃香型白酒窖池的窖泥和酒醅分離得到的124株可培養(yǎng)菌株中,60株來(lái)源于窖泥樣品,包括15個(gè)屬的29個(gè)種:芽胞桿菌屬、梭菌屬、淚珠狀產(chǎn)孢菌、醋乳桿菌屬、氨基酸桿狀菌屬、嗜熱芽胞桿菌屬、棒桿菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬、鼠伴菌屬、嗜蛋白菌屬、沉積物桿菌屬、土壤芽胞桿菌屬、鏈球菌屬和魏茨曼氏菌屬。其中分離株數(shù)量占比較大的優(yōu)勢(shì)菌種芽胞桿菌屬有5種16株,占窖泥分離株總數(shù)的26.7%;淚珠狀產(chǎn)孢菌屬有4種11株,占窖泥分離株的18.3%;梭菌屬有6種10株,占窖泥分離株的16.7%。除腸球菌屬和乳桿菌屬有2種分離株外,其余10個(gè)屬分離的可培養(yǎng)細(xì)菌均僅有1種分離株出現(xiàn),且有4株淚珠狀產(chǎn)孢菌屬疑似新種和1株嗜蛋白菌屬疑似新種,表現(xiàn)出較高的微生物種屬多樣性。

酒醅樣品中共得到18個(gè)屬30個(gè)種的64株分離株,包括芽胞桿菌屬、梭菌屬、淚珠狀產(chǎn)孢菌、醋乳桿菌屬、氨基酸桿狀菌屬、嗜熱芽胞桿菌屬、乳桿菌屬、鼠伴菌屬、沉積物桿菌屬、土壤芽胞桿菌屬、鏈球菌屬、魏茨曼氏菌屬、不動(dòng)桿菌屬、埃希氏菌屬、丙酸桿菌屬、類(lèi)芽胞桿菌屬、互營(yíng)球菌屬和魏斯氏菌屬。其中菌株數(shù)量較多的優(yōu)勢(shì)分離菌種芽胞桿菌屬有6種24株,占酒醅分離株總數(shù)的37.5%;梭菌屬有4種9株,占酒醅分離株的14.1%,鼠伴菌屬有1種6株,占酒醅分離株的9.4%。酒醅樣品中4株乳桿菌屬分離株分屬于4個(gè)種,在種類(lèi)和數(shù)量上較其他非優(yōu)勢(shì)分離菌種微生物均呈現(xiàn)出一定的多樣性。其他14個(gè)屬的可培養(yǎng)微生物分離株在種和株的數(shù)量上相差不大,同時(shí)酒醅樣品分離得到1株芽胞桿菌屬疑似新種、1株類(lèi)芽胞桿菌屬疑似新種和2株互營(yíng)球菌屬疑似新種。

比較不同分離生境獲得的可培養(yǎng)細(xì)菌種類(lèi)和豐度,可以發(fā)現(xiàn)在窖泥和酒醅樣品中分離到的細(xì)菌種屬類(lèi)型及數(shù)量均有較高的相似性,且2種樣品獲得的分離株中芽胞桿菌屬和梭菌屬均有較高豐度,表明在2個(gè)采樣位置的微生物數(shù)量及優(yōu)勢(shì)菌種差異較小,與前人研究結(jié)果一致,即在白酒釀造過(guò)程中窖泥和酒醅2個(gè)發(fā)酵體系之間可以通過(guò)黃水實(shí)現(xiàn)微生物代謝產(chǎn)物和不同菌種的傳遞和遷移,2個(gè)發(fā)酵體系中的微生物在酒體風(fēng)味成分的形成過(guò)程中存在一定的協(xié)同效應(yīng)[6-7,20]。其中,分離得到的梭菌屬菌種種類(lèi)最為豐富,主要包括酪丁酸梭菌(Clostridiumtyrobutyricum)、科氏梭菌(Clostridiumkluyveri)、丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)、永達(dá)爾氏梭菌(Clostridiumljungdahlii)、柔嫩梭菌(Clostridiumleptum)和酒梭菌(Clostridiumliquoris)等。梭菌屬菌種是窖泥中優(yōu)勢(shì)微生物,通常能夠利用底物等有機(jī)物代謝產(chǎn)生己酸、丁酸、乙酸等重要風(fēng)味香味物質(zhì)。分離得到的芽胞桿屬菌種種類(lèi)也較為豐富,主要包括地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)、副地衣芽胞桿菌(Bacillusparalicheniformis)、貝萊斯芽胞桿菌(Bacillusvelezensis)、卡夫里亞萊斯氏芽胞桿菌(Bacilluscabrialesii)、暹羅芽胞桿菌(Bacillussiamensis)、白色芽胞桿菌(Bacillusalbus)和沙福芽胞桿菌(Bacillussafensis)等。芽胞桿菌具有發(fā)達(dá)的水解酶系統(tǒng),在白酒釀造過(guò)程中能夠充分利用底物,產(chǎn)生吡嗪類(lèi)、丁二醇、3-羥基-2-丁酮、有機(jī)酸等白酒中重要的香味成分。此外,梭菌屬和芽胞桿菌屬菌種的代謝產(chǎn)物還能促進(jìn)窖泥中微生物的相互作用,調(diào)節(jié)窖泥中微生物群落結(jié)構(gòu),進(jìn)而影響濃香型白酒的香氣成分。但窖泥和酒醅2種樣品的分離株在種屬水平上還是有一定差異:棒桿菌屬、腸球菌屬和嗜蛋白菌屬3個(gè)屬的微生物僅在窖泥樣品中分離獲得;而不動(dòng)桿菌屬、埃希氏菌屬、類(lèi)芽胞桿菌屬、丙酸桿菌屬、互營(yíng)球菌屬和魏斯氏菌屬則僅在酒醅樣品中分離到。側(cè)面證實(shí)了窖池中2種發(fā)酵體系通過(guò)物質(zhì)交換和微生物轉(zhuǎn)移共同決定和影響著濃香型白酒典型風(fēng)味物質(zhì)的形成,以及酒體品質(zhì)的改善提升。

綜合來(lái)看,芽胞桿菌屬為濃香型白酒窖池中分離數(shù)量最多的微生物種類(lèi),包含8種40株,約占總分離菌株數(shù)的32%;梭菌屬包含9種19株,約占總分離株的15%;淚珠狀產(chǎn)孢菌屬共有4種12株,約占總數(shù)的10%。對(duì)于文獻(xiàn)報(bào)道較多的乳桿菌屬、鼠伴菌屬、魏茨曼氏菌屬、氨基酸桿狀菌屬及魏斯氏菌屬等在濃香型白酒釀造過(guò)程中對(duì)白酒中特定風(fēng)味物質(zhì)的形成、維持窖泥微生物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定等方面發(fā)揮重要作用的微生物菌屬也獲得了一定數(shù)量的分離株。如乳桿菌屬分離到4種共6株,鼠伴菌屬和魏茨曼氏菌屬分別有11株和7株。此外,在除TSA和MRS培養(yǎng)基外的其余5種培養(yǎng)基中,共有9株分離株16S rDNA測(cè)序結(jié)果顯示與已知分類(lèi)學(xué)地位模式菌株的16S rDNA序列相似性均低于98.65%[32],為潛在疑似新種,后續(xù)需進(jìn)一步通過(guò)全基因組測(cè)序等分子生物學(xué)鑒定技術(shù)確定其分類(lèi)學(xué)地位。

2.4 特征菌種鑒定及生物學(xué)特性分析

濃香型白酒釀造體系中微生物的種類(lèi)、數(shù)量、種群間的相互作用以及代謝的多樣性對(duì)白酒質(zhì)量具有重要影響,是白酒香型和風(fēng)格呈現(xiàn)多樣化的主要原因。梭菌屬和芽胞桿菌屬作為濃香型白酒窖池中的優(yōu)勢(shì)微生物類(lèi)群,在白酒釀造過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。梭菌多為專(zhuān)性厭氧微生物,在厭氧發(fā)酵狀態(tài)下能合成多種短鏈脂肪酸、醇類(lèi)等風(fēng)味物質(zhì)。已有大量報(bào)道證實(shí)白酒窖池中的部分梭菌代謝產(chǎn)物乙酸、己酸、丁酸、正丁醇等是濃香型白酒重要的香氣物質(zhì)前體或本體[33]。此外,在濃香型白酒釀造過(guò)程中某些梭菌屬菌株能產(chǎn)生異味物質(zhì)[11],可能會(huì)直接影響濃香型白酒的品質(zhì)。芽胞桿菌的種類(lèi)和數(shù)量直接影響著窖池微生物群落結(jié)構(gòu)和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)合成及酒的風(fēng)格特征。該類(lèi)菌種能水解淀粉、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì),并利用糟醅浸潤(rùn)到窖泥中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生丁酸和己酸等有機(jī)酸,有的菌種還能形成雙乙酰等芳香類(lèi)物質(zhì),因此是重要的產(chǎn)酸和產(chǎn)香菌[34]。為解析濃香型白酒窖池中功能菌的生物學(xué)特性,確定了6株潛在特征菌種開(kāi)展系統(tǒng)發(fā)育和生物學(xué)特性分析。

2.4.1 特征菌種系統(tǒng)發(fā)育分析

6株(P1-3、P1-6、P2-1、K1-1、P3-5、R2-2-3)濃香型白酒窖池中可培養(yǎng)特征菌種代表菌株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后,在1 500 bp左右處有明亮單一條帶,滿(mǎn)足測(cè)序要求,送擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。將得到的測(cè)序結(jié)果通過(guò)EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),尋找數(shù)據(jù)庫(kù)中與目的基因序列同源性最高的已知分類(lèi)學(xué)地位的菌種,從而確定目的基因歸屬。

結(jié)果表明菌株P(guān)1-3的16S rDNA序列與1株腸鼠伴菌(Muricomesintestini)的模式菌株序列相似性最高,為99.64%。以海氏梭菌(Clostridiumhylemonae)TN-271T序列為外群構(gòu)建菌株P(guān)1-3與相關(guān)近緣模式菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2-a),結(jié)果顯示通過(guò)16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析可將菌株P(guān)1-3鑒定為腸鼠伴菌。菌株P(guān)1-6的16S rDNA序列與酪丁酸梭菌(Clostridiumtyrobutyricum)的模式菌株序列相似性最高,為100%。以瘤胃解蛋白質(zhì)菌(Proteiniclasticumruminis)D3RC-2T序列為外群構(gòu)建菌株P(guān)1-6與相關(guān)近緣模式菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2-b),結(jié)果顯示通過(guò)16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析可將分離株P(guān)1-6鑒定為酪丁酸梭菌。菌株K1-1的16S rDNA序列與2株淚珠狀產(chǎn)孢菌屬(Lacrimisporasp.)的模式菌株序列相似性均高于99%。通過(guò)對(duì)淚珠狀產(chǎn)孢菌屬菌種功能基因相關(guān)文獻(xiàn)檢索調(diào)研,發(fā)現(xiàn)目前沒(méi)有該種屬微生物功能基因相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。以EnteroclosteraldensisRMA 9741T序列為外群構(gòu)建菌株K1-1與相關(guān)近緣模式菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2-c),結(jié)果表明通過(guò)16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析可將菌株K1-1鑒定為淚珠狀產(chǎn)孢菌屬。菌株P(guān)2-1的16S rDNA序列與芽胞桿菌屬(Bacillussp.)的6株模式菌株序列相似性均高于99%(圖2-d)。對(duì)菌株P(guān)2-1的gyrB基因通過(guò)NCBI的BLAST軟件進(jìn)行比對(duì),結(jié)果表明P2-1的gyrB基因序列與地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)的相似性最高,為99.8%。以嗜鹽喜鹽芽胞桿菌(Halobacillushalophilus)DSM 2266T序列為外群構(gòu)建菌株P(guān)2-1與相關(guān)近緣模式菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2-g),gyrB基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析表明菌株P(guān)2-1為地衣芽胞桿菌。菌株P(guān)3-5的16S rDNA序列與芽胞桿菌屬(Bacillussp.)的10株模式菌株序列相似性均高于99%(圖2-e)。對(duì)菌株P(guān)3-5的gyrB基因通過(guò)BLAST軟件進(jìn)行比對(duì),結(jié)果表明P3-5的gyrB基因序列與枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)的相似性最高,為99.3%。以嗜鹽喜鹽芽胞桿菌(Halobacillushalophilus)DSM 2266T序列為外群構(gòu)建菌株P(guān)3-5與相關(guān)近緣模式菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2-h),gyrB基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析表明菌株P(guān)3-5為枯草芽胞桿菌。菌株R2-2-3的16S rDNA序列與芽胞桿菌屬(Bacillussp.)的10株模式菌株序列相似性均高于99%(圖2-f)。對(duì)菌株R2-2-3的gyrB基因通過(guò)BLAST軟件進(jìn)行比對(duì),結(jié)果表明R2-2-3的gyrB基因序列與貝萊斯芽胞桿菌(Bacillusvelezensis)的相似性最高,為98.6%。以嗜鹽喜鹽芽胞桿菌(Halobacillushalophilus)DSM 2266T序列為外群構(gòu)建菌株R2-2-3與相關(guān)近緣模式菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2-i),gyrB基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析表明菌株R2-2-3為貝萊斯芽胞桿菌。

圖2 特征菌種系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2 Phylogenetic analysis of the characteristic strains

2.4.2 特征菌種生物學(xué)特征分析

將6株濃香型白酒窖池特征菌種代表菌株接種于相應(yīng)分離培養(yǎng)基上,觀察不同菌株菌落形態(tài)特征(表2)。

表2 特征菌種菌落形態(tài)特征Table 2 Colony morphological characteristics of the characteristic strains

同時(shí)對(duì)各分離菌株進(jìn)行掃描電鏡觀察,菌體微觀形態(tài)特征如圖3所示。芽胞桿菌屬分離株P(guān)2-1、P3-5和R2-2-3菌體形態(tài)特征為短桿狀,單個(gè)或成對(duì)排列,部分菌體表面被覆代謝產(chǎn)生的膜,符合芽胞桿菌屬菌株菌體形態(tài)特點(diǎn);梭菌目菌株P(guān)1-3、P1-6和K1-1菌體形態(tài)特征為桿狀,部分菌體呈梭狀,單個(gè)或成對(duì)排列。

a-菌株P(guān)1-3;b-菌株P(guān)1-6;c-菌株K1-1;d-菌株P(guān)2-1;e-菌株P(guān)3-5;f-菌株R2-2-3圖3 特征菌種掃描電鏡菌體形態(tài)Fig.3 The scanning electron microscope of the characteristic strains

芽胞桿菌屬分離株P(guān)2-1、P3-5和R2-2-3選用API 50 CHB試劑條進(jìn)行生理生化特性測(cè)試,結(jié)果見(jiàn)表3。株菌在對(duì)L-山梨糖、L-鼠李糖、D-乳糖、菊糖、D-土倫糖、D-塔格糖和葡萄糖酸鉀利用方面存在一定差異,其他生理生化項(xiàng)結(jié)果則均相同,在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用方面表現(xiàn)出了種屬相似性和一定的菌株差異性。梭菌目厭氧菌株P(guān)1-3、P1-6和K1-1采用API 20A試劑條開(kāi)展生理生化特性試驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表4。3株試驗(yàn)菌都能水解明膠,菌株K1-1除對(duì)色氨酸和脲素為陰性,其他檢測(cè)項(xiàng)均呈陽(yáng)性或弱陽(yáng)性;菌株P(guān)1-3和P1-6則相反,對(duì)試劑條大部分生理生化項(xiàng)都為陰性,推測(cè)3株分離菌雖然同屬于厚壁菌門(mén)的梭菌目(Clostridiales),但在分類(lèi)學(xué)水平上是完全不同的菌種,由此導(dǎo)致菌株生理生化特性的差異。

表4 特征菌種生理生化特性(API 20A)Table 4 Physiological and biochemical characteristics of the characteristic strains(API 20A)

3 結(jié)論

本研究利用可培養(yǎng)組學(xué)技術(shù),通過(guò)增加培養(yǎng)基種類(lèi)和采用不同樣品分離條件,對(duì)濃香型白酒窖泥和酒醅樣品中可培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行了大量的分離培養(yǎng)及鑒定,同時(shí)開(kāi)展了濃香型白酒釀造過(guò)程中特征菌種代表菌種的系統(tǒng)發(fā)育分析及菌株特性研究。通過(guò)5種特定的厭氧培養(yǎng)基和2種好氧培養(yǎng)基,從濃香型白酒窖池中共分離得到了來(lái)自21個(gè)屬44個(gè)種的124株細(xì)菌,包括9株潛在細(xì)菌新種。其中,厭氧條件分離得到100株,好氧條件分離得到24株;窖泥樣品分離得到60株,酒醅樣品分離得到64株。芽胞桿菌屬(Bacillussp.)和梭菌屬(Clostridiumsp.)是窖池樣品中分離的優(yōu)勢(shì)菌種。比較了不同分離篩選條件和分離生境的可培養(yǎng)細(xì)菌種類(lèi)和豐度,并解析了6株濃香型白酒窖池潛在功能菌的生物學(xué)特性。本研究為濃香型白酒窖池中潛在新種的挖掘、特征性菌種資源的定向篩選、互作機(jī)制解析、功能性研究開(kāi)發(fā)及產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。