陳青青,董墨思,石巖,張雨婷,楊宇峰,李蘇紅*

1(沈陽農(nóng)業(yè)大學 食品學院,遼寧 沈陽,110866)2(遼寧中醫(yī)藥大學 中西醫(yī)結(jié)合學院、中醫(yī)學院,遼寧 沈陽,110847)

糖尿病是由于胰島素代謝異?；蛞葝u素分泌不足而導致的慢性高血糖疾病,僅次于惡性腫瘤、心腦血管疾病,是危害人類健康的第三大疾病[1]。長期的高血糖會增加心血管疾病、視網(wǎng)膜病變及神經(jīng)性病變的風險,同時會導致患者產(chǎn)生糖尿病足、創(chuàng)口不愈合潰瘍等現(xiàn)象[2-4]。目前糖尿病尚無治愈的方法,因此控制血糖對預(yù)防糖尿病及并發(fā)癥具有重要作用,日常生活中人們食用具有調(diào)節(jié)血糖功效的功能性食品具有廣闊的應(yīng)用前景。

食用植物酵素是以可用于食品加工的植物為主要原料,經(jīng)酵母菌、乳酸菌和霉菌等益生菌發(fā)酵制得含有特定功能性成分可供人體食用的產(chǎn)品[5]。益生菌發(fā)酵能在改善產(chǎn)品風味的同時產(chǎn)生新的次級代謝產(chǎn)物和活性成分,增加酵素的保健功能。近年來,酵素的市場需求量日益增大,市售酵素種類逐漸增多,其研究主要集中在降脂減肥[6]、改善腸道菌群[7]、提高免疫力[8]、增強消化功能和胃腸道吸收[9]及抗氧化[10]等方面,調(diào)節(jié)血糖的酵素產(chǎn)品研究相對較少,且進口食用酵素售價普遍昂貴。故本研究以紅參、玉竹、馬齒莧、枸杞、柚子、南瓜、生姜、芹菜、山藥為原料,復(fù)合乳酸菌為菌種,α-淀粉酶抑制率為評價指標,通過星點設(shè)計-響應(yīng)面試驗優(yōu)化發(fā)酵工藝,旨在探討乳酸菌發(fā)酵對酵素α-淀粉酶抑制率的影響,為開發(fā)具有調(diào)節(jié)血糖功效的功能型食用酵素提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

柚子、南瓜、生姜、芹菜、山藥,市售;紅參、玉竹、馬齒莧,同仁堂;枸杞,安徽藥知源中藥飲片有限公司;復(fù)合乳酸菌Novum F312(活菌數(shù)為1×1010CFU/g,包含乳雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌),山東中科嘉億生物工程有限公司;低聚果糖,河南旗諾食品配料有限公司;豬胰α-淀粉酶、鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ),Sigma公司;糖化酶,上海瑞恩生物科技有限公司;可溶性淀粉、無水乙醇、3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid, DNS)(均為分析純),國藥集團化學試劑有限公司;中藥復(fù)方益糖康[紅參、黃芪、黃精、甘草、白術(shù)、丹參、枸杞子、葛根、三七、茯苓、五味子、黃連(10∶10∶13∶4∶3∶3∶3∶3∶3∶3∶3∶3)],遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院。

試驗動物信息:SPF級雄性Wistar大鼠[體質(zhì)量(200±20) g,許可證號:SCXK(遼)2020-0001],遼寧長生生物技術(shù)有限公司。

電熱式壓力蒸汽滅菌鍋,浙江新豐醫(yī)療器械有限公司;超凈工作臺,蘇州凈化醫(yī)療器械有限公司;HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋,常州智博瑞儀器制造有限公司;數(shù)顯高速分散均質(zhì)機,上海標本模型廠制造;UV-5100紫外分光光度計,上海元析儀器有限公司;電腦控溫恒溫培養(yǎng)箱,寧波樂電儀器制造有限公司;SC-3614低速離心機,安徽中科中佳科學儀器有限公司;ACCU-CHEK血糖儀,中國羅氏制藥有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 酵素發(fā)酵工藝流程

原料→粉碎→調(diào)配→均質(zhì)→滅菌→冷卻→接種→發(fā)酵→離心→成品

操作要點:選取干燥的紅參(30 g)、玉竹(40 g)、馬齒莧(40 g)、枸杞(30 g)與新鮮的柚子(40 g)、南瓜(40 g)、生姜(30 g)、芹菜(40 g)、山藥(40 g)進行粉碎,原料與蒸餾水按3∶10(質(zhì)量比)的比例于榨汁機中磨漿,之后12 000 r/min均質(zhì)5 min。將均質(zhì)后的樣品于115 ℃條件下滅菌30 min,冷卻至室溫后接入復(fù)合乳酸菌進行發(fā)酵,最后于4 500 r/min離心3 min,即得到復(fù)合植物酵素。由于酵素原液含量較高,試驗測定時將其稀釋至不同含量,稀釋后酵素含量的計算如公式(1)所示:

(1)

1.2.2 單因素試驗設(shè)計

考察發(fā)酵時間(0、12、24、36、48、60 h)、發(fā)酵溫度(28、31、34、37、40 ℃)、復(fù)合乳酸菌添加量(0、0.025%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%,質(zhì)量分數(shù),下同)、低聚果糖添加量(0、2%、4%、6%、8%、10%,質(zhì)量分數(shù),下同)對酵素α-淀粉酶抑制率的影響。

1.2.3 星點設(shè)計-響應(yīng)面優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果,利用Design-expert 8.0.6分析軟件設(shè)計響應(yīng)面試驗,優(yōu)化酵素的發(fā)酵工藝。以發(fā)酵時間(h)、發(fā)酵溫度(℃)及復(fù)合乳酸菌添加量(%)為自變量,以α-淀粉酶抑制率為響應(yīng)值,試驗設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Response surface test factors and levels

1.2.4 α-淀粉酶抑制率的測定及IC50的測定

參照LI等[11]的方法略做修改。取28 μL 25 mL/L的酵素溶液、1 mL的PBS(pH 6.8,0.1 mol/L)、100 μL α-淀粉酶(29 U)溶液依次加入到10 mL離心管中,混合均勻,37 ℃反應(yīng)20 min后,加入5 mL 1%(質(zhì)量分數(shù))可溶性淀粉溶液,5 min后立刻取1 mL于試管中沸水浴,冷卻后加入1 mL蒸餾水和1.5 mL DNS溶液,沸水浴中反應(yīng)5 min,冷卻后加蒸餾水補至10 mL,于540 nm處測定吸光度,用PBS代替酵素作為空白組,用PBS代替α-淀粉酶作為樣品對照,用PBS代替酵素和α-淀粉酶作為空白對照。分別取12.5、16.7、20、25、33.3 mL/L的酵素28 μL,計算抑制率和IC50。抑制率的計算如公式(2)所示:

(2)

式中:A,空白吸光度;A0,空白對照吸光度;Ax,樣品吸光度;Ax0,樣品對照吸光度。

1.2.5 酵素對α-葡萄糖苷酶抑制率及IC50的測定

試驗參照劉雪蕊[12]的方法。取40 μL不同濃度的酵素(33.3、50、66.6、100、200 mL/L),分別與40 μL葡萄糖苷酶(0.02 U)溶液于37 ℃加熱10 min后,加入20 μL 7.5 mmol/L 4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside,pNPG)溶液,混合液反應(yīng)10 min后加入100 μL 0.1 mol/L NaCO3溶液終止反應(yīng),于405 nm處測定吸光度,用0.1 mol/L pH 6.8的PBS代替酵素作為空白組,用PBS代替α-葡萄糖苷酶溶液作為樣品對照。計算抑制率和IC50。抑制率的計算如公式(3)所示:

(3)

式中:A,空白吸光度;Ax,樣品吸光度;Ax0,樣品對照吸光度。

1.2.6 酵素的指標測定

pH的測定:采用pH計;總酸(以乳酸計)的測定參考GB 12456—2021《食品安全國家標準 食品中總酸的測定》;乳酸菌的測定參考GB 4789.35—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》;大腸菌群的測定參考GB 4789.3—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸菌群計數(shù)》;霉菌的測定參考GB 4789.15—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數(shù)》;金黃色葡萄球菌的測定參考GB 4789.10—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》;沙門氏菌的測定參考GB 4789.4—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》。

1.2.7 糖尿病大鼠造模方法

選取SPF級健康Wistar大鼠40只,隨機設(shè)定10只大鼠作為正常組,普通飲食喂養(yǎng),其余30只大鼠連續(xù)喂養(yǎng)高脂飲食(在飼料中加入豬油、蔗糖、膽固醇、膽酸鈉等成分)。維持上述喂養(yǎng)方法2周后,禁食16 h,稱重后,腹腔注射鏈脲佐菌素,劑量為45 mg/kg,建立2型糖尿病大鼠模型,以隨機血糖值>16.7 mmol/L作為造模標準?？瞻捉M大鼠根據(jù)體重注射同等體積的檸檬酸鈉緩沖液(0.1 mmol/L)。

1.2.8 實驗分組和給藥

造模成功后的大鼠隨機分為模型組、中藥組(中藥復(fù)方益糖康)、酵素組,每組10只。各組大鼠采用每日經(jīng)口灌胃方式給藥1次,連續(xù)8周。正常組和模型組每日10 mL/(kg·d)的生理鹽水灌胃,中藥組以每日10 mL/(kg·d)的中藥復(fù)方益糖康灌胃,酵素組以每日10 mL/(kg·d)的酵素灌胃。

1.2.9 大鼠空腹血糖測定

大鼠禁食16 h后尾尖取血,使用血糖儀測量各組大鼠的空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 2019b和Excel 2019軟件進行作圖,Design-Expert.V 8.0.6進行響應(yīng)面分析。使用SPSS 11.6進行二次多項式回歸分析,P<0.05表示具有顯著性差異。所有實驗均重復(fù)3次,數(shù)值用平均值±標準偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

如圖1-a所示,隨著發(fā)酵時間在0～60 h增加,酵素的α-淀粉酶抑制率逐漸增大。48 h內(nèi)的α-淀粉酶抑制率增長較快,超過48 h趨于平穩(wěn);24 h內(nèi)的pH急劇下降,48 h的pH降至最低,說明乳酸菌在發(fā)酵前24 h代謝旺盛,產(chǎn)酸速率快,到48 h時發(fā)酵基本完成。因此確定最適發(fā)酵時間為48 h。

a-發(fā)酵時間對α-淀粉酶抑制率的影響;b-發(fā)酵溫度對α-淀粉酶抑制率的影響;c-菌添加量對α-淀粉酶抑制率的影響;d-低聚果糖添加量對α-淀粉酶抑制率的影響圖1 單因素試驗結(jié)果Fig.1 Single-factor test results注:不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05),相同代表差異不顯著。

如圖1-b所示,28～37 ℃內(nèi),酵素的α-淀粉酶抑制率逐漸增大,超過37 ℃呈下降趨勢。37 ℃時pH降至最低,說明溫度過高或過低都會影響乳酸菌的生長,導致發(fā)酵能力差,不利于抑制酶活性的功能性成分生成[13]。故選擇37 ℃作為最適發(fā)酵溫度。

由圖1-c可知,隨著復(fù)合乳酸菌添加量的增加,α-淀粉酶抑制率出現(xiàn)先增大后平穩(wěn)的趨勢。當添加量大于0.1%,α-淀粉酶抑制率基本保持不變,且酵素pH值趨于平穩(wěn),說明發(fā)酵完成。故選擇0.1%作為最適復(fù)合乳酸菌添加量。

為探究低聚果糖對酵素α-淀粉酶抑制率的影響,將發(fā)酵時間調(diào)整為30 h。由圖1-d所示,不添加低聚果糖時,酵素的α-淀粉酶抑制率約為60%。為提高α-淀粉酶抑制率,繼續(xù)添加2%、4%、6%、8%、10%的低聚果糖。結(jié)果發(fā)現(xiàn),0～10%的低聚果糖對α-淀粉酶抑制率和pH均無顯著差異(P>0.05),說明添加低聚果糖不影響酵素的發(fā)酵速度及對α-淀粉酶的抑制作用。由此說明乳酸菌依靠原料中的碳源能夠完成發(fā)酵,并不需要額外添加。因此選擇不添加低聚果糖,且響應(yīng)面試驗中去掉該因素。

2.2 星點設(shè)計-響應(yīng)面試驗優(yōu)化結(jié)果

星點設(shè)計-響應(yīng)面試驗優(yōu)化發(fā)酵工藝結(jié)果見表2。以α-淀粉酶抑制率(Y)為響應(yīng)值,利用Design Expert.V8.0.6對試驗結(jié)果進行分析,建立發(fā)酵時間(A)、發(fā)酵溫度(B)、復(fù)合乳酸菌添加量(C)3因素的二次多項回歸方程為:

表2 星點設(shè)計-響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Central composite design-response surface test design and results

Y=95.28+11.18A-3.46B+16.96C+4.49AB+4.21AC-8.46BC-10.55A2-20.54B2-12.27C2

表3 回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 Regression model ANOVA results

2.3 酵素的質(zhì)量評價

以復(fù)合乳酸菌為菌種制備酵素,可提高發(fā)酵速度,顯著降低酵素的pH值,提高總酸含量[14]。由表4知,各項理化指標均符合QB/T 5323—2018《植物酵素》的要求。酵素發(fā)酵前對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶均有抑制作用,經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后抑制率顯著提高,可能是原料本身保留了營養(yǎng)成分的同時,乳酸菌發(fā)酵有利于2種酶活性抑制成分的生成。且最佳發(fā)酵工藝制備的酵素色澤良好,甘苦味適中,口感細膩無異味,質(zhì)地均勻,無致病菌檢出。

表4 酵素的指標Table 4 Indicators of Jiaosu

2.4 酵素對α-淀粉酶與α-葡萄糖苷酶的抑制作用

如表5所示,酵素對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制呈濃度依賴性特征,計算得出酵素對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的IC50值分別為(16.54±0.40)和(46.54±6.50) mL/L,表明酵素對α-淀粉酶的抑制率達到50%所需要的濃度低于同等酶活力時α-葡萄糖苷酶抑制率達到50%所需要的濃度,即在同濃度下,酵素對α-淀粉酶的抑制強于α-葡萄糖苷酶。

表5 酵素對α-淀粉酶與α-葡萄糖苷酶的抑制作用Table 5 Inhibition of α-amylase and α-glucosidase by Jiaosu

2.5 酵素對大鼠空腹血糖的影響

酵素干預(yù)糖尿病大鼠的空腹血糖變化結(jié)果如表6所示,造模成功后,與正常組相比,喂食高脂飼料的3組大鼠在干預(yù)前空腹血糖值顯著升高(P<0.01)。干預(yù)2周后,與模型組相比,中藥組大鼠的FBG明顯降低(P<0.05);從第4周開始,中藥組和酵素組的FBG顯著降低(P<0.01)。干預(yù)8周的中藥組和酵素組大鼠血糖水平分別降低了44.64%和37.12%,說明酵素組效果接近于中藥組,能明顯改善大鼠的空腹血糖。

表6 各組大鼠空腹血糖值 單位:mmol/LTable 6 Fasting blood glucose values of rats in each group

3 討論

與化學合成物相比,天然產(chǎn)物更加經(jīng)濟、安全,利用天然產(chǎn)物開發(fā)調(diào)節(jié)血糖的功能性產(chǎn)品已成為預(yù)防和治療糖尿病的新趨勢[15-17]。發(fā)酵能在改善產(chǎn)品風味的同時提高其功能性,故發(fā)酵產(chǎn)品的研制已成為研究熱點。研究顯示,水果酵素對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制率分別為99.57%和81.67%,酶抑制率較高,其中多酚對α-淀粉酶有抑制效果[18],但該酵素為自然發(fā)酵,發(fā)酵周期長,易受多種微生物影響,需要嚴格控制發(fā)酵條件以保證品質(zhì)[19];紫薯汁發(fā)酵后對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制率分別為63.5%和70.9%,且發(fā)酵后提高了多糖、總酚、總酮含量[20];由乳酸菌發(fā)酵制備出富含多酚的接骨木果汁,其對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制率分別為68.62%和72.39%[21]。大量研究表明,發(fā)酵可提高多糖含量[22],釋放黃酮[23]和多酚物質(zhì)[24],且植物中的黃酮、多酚、多糖等高活性物質(zhì)是天然降血糖提取物的研究熱點[25]。結(jié)合上述研究,推測酵素中含黃酮、多酚或多糖類物質(zhì),并具有改善血糖的效果。

本研究酵素碳源充足,制備工藝簡單,發(fā)酵周期短,微量酵素抑制酶活性效果顯著,經(jīng)發(fā)酵后對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制率分別提高了4.86倍和3.41倍,且酵素濃度為33.3 mL/L可完全抑制α-淀粉酶活性。該酵素可改善糖尿病大鼠的空腹血糖,可能與其抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性有關(guān),或酵素發(fā)酵過程中提高多糖、多酚或黃酮類物質(zhì)含量,同時產(chǎn)生的有益次級代謝產(chǎn)物起協(xié)同降糖作用。本研究僅對酵素調(diào)節(jié)血糖的能力進行初步研究,還需對活性成分進行分離鑒定,這也為后期深入研究其調(diào)節(jié)血糖能力及其相關(guān)機制、發(fā)酵過程中代謝物的變化規(guī)律等研究提供參考。

4 結(jié)論

本研究采用單因素試驗及星點設(shè)計-響應(yīng)面法得出了酵素的最佳發(fā)酵工藝,最終確定發(fā)酵時間為49.5 h,發(fā)酵溫度為37 ℃,復(fù)合乳酸菌添加量為0.1%。該酵素發(fā)酵周期短,發(fā)酵工藝簡便,適合工業(yè)規(guī)?；a(chǎn),應(yīng)用此模型繼續(xù)優(yōu)化酵素的其他保健功效,與改善血糖作用相結(jié)合,具有更為廣闊的研發(fā)價值和市場潛力,并在產(chǎn)業(yè)化中具有一定的指導意義,有利于滿足國內(nèi)日益增多的糖尿病患者的需求,減少患者副作用的同時降低國民生活成本。