遲燕平,路雅雯,王景會,李達(dá),蘇穎,牛紅紅,苗新宇,孫慕白,華梅

(吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,吉林 長春,130033)

γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid, GABA)是一種非蛋白質(zhì)的天然氨基酸,動物、植物和微生物中均可產(chǎn)生,具有降血壓、抗抑郁、抗驚厥、鎮(zhèn)靜安神的作用,既有利于心腦血壓的緩解,又能促進(jìn)人體內(nèi)氨基酸代謝平衡[1-2]。GABA作為重要的抑制性神經(jīng)遞物質(zhì),參與多種代謝活動,具有很高的生理活性,越來越受到人們的關(guān)注,作為一種功能性因子,將被廣泛地用于食品、醫(yī)藥及化工等行業(yè)[3-4]。GABA化學(xué)合成法的成本高、得率低,在生產(chǎn)工藝中使用危險(xiǎn)溶劑,不是天然食品添加劑,不能應(yīng)用于食品。生物合成法相比較來說是一種既安全、又低成本的方法,合成條件溫和,安全性高,是GABA合成的理想途徑[5-7]。釀酒酵母是發(fā)酵中最常用的微生物種類,是與人類關(guān)系最密切的一種酵母,常用于釀酒及制作面包和饅頭等食品,是我國重要的微生物資源,因此,篩選產(chǎn)GABA的酵母菌株具有較好的應(yīng)用前景和較高的經(jīng)濟(jì)效益[8-10]。基因組改組技術(shù)是建立在菌株誘變和原生質(zhì)體融合基礎(chǔ)之上的菌株選育技術(shù),常被應(yīng)用于菌株的改良選育中[11-12]。通過對原始菌株誘變篩選得到正向突變體,將其作為親代菌株,利用熱處理和紫外滅活制備原生質(zhì)體,之后進(jìn)行原生質(zhì)體融合再生[13-15]。本研究通過對篩選的產(chǎn)GABA釀酒酵母進(jìn)行基因組改組選育,獲得具有穩(wěn)定遺傳性和安全性的高產(chǎn)GABA融合菌株,具有成本低、產(chǎn)率高、安全性高等優(yōu)點(diǎn),為后續(xù)的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

菌株CLNJ1由實(shí)驗(yàn)室篩選,保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心,編號:CGMCC No.23423。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖3、酵母浸3、蛋白胨10、NaCl 5,調(diào)節(jié)pH至 6.2,121 ℃滅菌20 min。

固體培養(yǎng)基:發(fā)酵培養(yǎng)基中加入瓊脂20 g/L。

再生培養(yǎng)基:用原生質(zhì)體穩(wěn)定液代替蒸餾水,按照發(fā)酵培養(yǎng)基配方配制。

磷酸緩沖液、高滲緩沖液、預(yù)處理溶液、原生質(zhì)體穩(wěn)定液、促融合劑、酶溶液的配置參照文獻(xiàn)[16-17]的方法。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 GABA的定量測定

參照方綺等[18]的方法, 采用Berthelot比色法進(jìn)行測定。

1.2.2 菌株鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定:平板培養(yǎng)觀察菌落形態(tài)大小,顏色及邊緣隆起狀況,挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色,在顯微鏡下觀察菌落形態(tài)特征。

同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建:將篩選菌株送至吉林省庫美生物科技有限公司測序,將菌株序列用BLAST與數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行比較,利用MEGA軟件進(jìn)行同源性分析并繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 菌株基因組改組

1.2.3.1 菌株生長曲線

將CLNJ1菌株活化后接入LB培養(yǎng)基中,于適宜溫度下振蕩培養(yǎng),每隔2 h取1次菌液,在600 nm波長下測定吸光度值,總計(jì)測24 h,記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.3.2 LiCl誘變

配制含有不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)LiCl的LB培養(yǎng)基,將活化后培養(yǎng)至對數(shù)期的CLNJ1菌液轉(zhuǎn)接其中培養(yǎng)24 h,以未經(jīng)LiCl誘變的為對照,涂布完成后的平板在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。待菌落長出后,計(jì)活菌數(shù),取致死率在80%～90%的時(shí)間進(jìn)行LiCl誘變。為確保誘變菌株的穩(wěn)定性,將菌株連續(xù)傳代10次后進(jìn)行液體發(fā)酵,對其GABA產(chǎn)量進(jìn)行測定,從而判斷誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性。

1.2.3.3 基因組改組

參照文獻(xiàn)[16-17]的方法,配置原生質(zhì)體菌懸液,適當(dāng)稀釋,并涂布于固體培養(yǎng)基上。再分別取1 mL菌株原生質(zhì)體細(xì)胞懸液,加入9 mL高滲緩沖溶液中,稀釋到合適濃度后,在再生固體培養(yǎng)基上涂布,培養(yǎng)48 h后,計(jì)算菌株原生質(zhì)體形成率和再生率。根據(jù)不同處理?xiàng)l件下原生質(zhì)體的形成率和再生率,選擇酶最佳的濃度和溫度,菌體生長時(shí)期制備原生質(zhì)體,獲得最適雙親滅活(熱滅活或紫外線滅活)條件。

分別取CLNJ1-Y菌株原生質(zhì)體各1 mL,混合均勻后放入無菌離心管中,用高滲緩沖液離心洗滌2次,離心后加入1 mL原生質(zhì)體穩(wěn)定溶液于上述沉淀菌體中,混勻后再加入1.8 mL 40%(體積分?jǐn)?shù))促溶劑聚乙二醇6000,搖勻,37 ℃恒溫水浴10 min,再用原生質(zhì)體穩(wěn)定溶液稀釋至適當(dāng)?shù)臐舛?。涂布于再生平板?30 ℃培養(yǎng)3～5 d,計(jì)算融合率。

將融合液涂布在再生培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng),觀察并比較親株和重組子的細(xì)胞形態(tài)。將菌株進(jìn)行純化、斜面保藏。將保藏的菌株接種至LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)1～2 d,測定改組菌株發(fā)酵液中GABA的含量。改組后菌株經(jīng)過穩(wěn)定性試驗(yàn)后保存。

1.2.4 菌株安全性評價(jià)

1.2.4.1 菌株溶血試驗(yàn)

將改組后菌株(CLNJ1-YC)在LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線活化,然后接種于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h,根據(jù)平板上是否出現(xiàn)溶血環(huán)判斷菌株安全性,α-溶血環(huán)為草綠色,β-溶血環(huán)為無色透明,本實(shí)驗(yàn)以金黃色葡萄球菌作為陽性對照菌株。

1.2.4.2 抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)

采用K-B紙片擴(kuò)散法檢測CLNJ1-YC菌株對10種抗生素的耐藥性,測量并記錄各藥敏紙片的抑菌圈直徑大小。參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(Clinical &Laboratory Standards Institute,CLSI) 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判定,結(jié)果描述為敏感、中度敏感、耐藥。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

樣品的每個(gè)指標(biāo)均設(shè)置3次重復(fù),采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行Duncan多重比較分析,采用Origin 95C進(jìn)行繪圖,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,統(tǒng)計(jì)結(jié)果以P<0.05表示差異達(dá)到顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母CLNJ1菌株鑒定

2.1.1 菌落菌體特征

由圖1-a可知,釀酒酵母CLNJ1為乳白色、圓形、邊緣規(guī)則、表面光滑、濕潤,直徑約2.9 mm。革蘭氏染色后呈現(xiàn)藍(lán)色,菌體為橢圓形,呈單個(gè)排列方式(圖1-b)。

a-菌落形態(tài);b-革蘭氏染色圖片圖1 釀酒酵母CLNJ1菌落形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of CLNJ1

2.1.2 16SrDNA和ITS序列比對分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將菌株CLNJ1送由吉林省庫美生物科技有限公司測序,選擇ITS基因序列測序(正向引物ITS1:TCCGTAGGTGAACCTGCGG,反向引物ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC),測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫序列進(jìn)行BLAST同源性檢索。結(jié)果顯示,CLNJ1菌株序列與已公布序列的釀酒酵母菌 (Saccharomycescerevisiae) 99%同源,系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果如圖2所示。

圖2 CLNJ1系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of CLNJ1

2.2 釀酒酵母CLNJ1菌株生長曲線

如圖3所示,釀酒酵母CLNJ1發(fā)酵4 h后進(jìn)入對數(shù)生長期,發(fā)酵14 h后結(jié)束對數(shù)生長期,GABA產(chǎn)量為1.72 g/L。

圖3 菌株生長曲線Fig.3 Strain growth curve

2.3 釀酒酵母CLNJ1的LiCl誘變研究

由圖4-a可知,當(dāng)LiCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%時(shí),菌株CLNJ1致死率達(dá)到90%～95%,故選擇0.3%作為菌株CLNJ1的LiCl誘變最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù),進(jìn)行多次誘變和測定后,得到一株產(chǎn)量較高的誘變菌株CLNJ1-Y,GABA產(chǎn)量為5.96 g/L,比出發(fā)菌株提高了246%。將誘變菌株 CLNJ1-Y傳代10次,進(jìn)行GABA產(chǎn)量測定,比較菌株遺傳穩(wěn)定性,LiCl誘變菌株CLNJ1-Y經(jīng)過10次傳代,GABA產(chǎn)量基本穩(wěn)定,沒有出現(xiàn)回復(fù)突變的問題(圖4-b)。

a-誘變致死率;b-誘變穩(wěn)定性圖4 LiCl誘變結(jié)果Fig.4 Results of LiCl mutagenesis

2.4 基因組改組選育高產(chǎn)GABA菌株

2.4.1 原生質(zhì)體的再生比率

CLNJ1-Y菌株在培養(yǎng)8 h,預(yù)處理時(shí)間15 min,溶菌酶和蝸牛酶酶解時(shí)間3 h條件下原生質(zhì)體的再生比率為99.66%,得到的原生質(zhì)體己經(jīng)比較純凈。

2.4.2 原生質(zhì)體滅活條件的確定

對不同時(shí)間紫外滅活處理和熱滅活處理的再生培養(yǎng)基平板上的菌落進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),按滅活率公式計(jì)算,結(jié)果見圖5,對于菌株CLNJ1-Y,紫外照射超過20 s后原生質(zhì)體的滅活率達(dá)到100%,熱滅活80 min時(shí)原生質(zhì)體的滅活率達(dá)到100%。

a-紫外滅活;b-熱滅活圖5 紫外處理和熱處理對菌株滅活率的影響Fig.5 Effect of UV treatment and heat treatment on the inactivation rate of strains

2.4.3 改組菌株的檢出與篩選

將制備好的原生質(zhì)體混合后用紫外和熱滅活的方式進(jìn)行滅活,然后進(jìn)行融合,適當(dāng)稀釋后涂布于高滲培養(yǎng)基中。長出菌落后按照上述所用的初篩和復(fù)篩的方法,最終篩選出一輪改組菌株,改組后菌株CLNJ1-YC的GABA產(chǎn)量為12.28 g/L,比CLNJ1-Y提高106%,比CLNJ1提高614%。

2.4.4 改組菌株的遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

為確保改組菌株的穩(wěn)定性,因此將改組菌株分別轉(zhuǎn)接10次進(jìn)行傳代,對轉(zhuǎn)接10次的菌株進(jìn)行產(chǎn)GABA能力測定,由圖6可知,CLNJ1-YC產(chǎn)量基本穩(wěn)定,沒有出現(xiàn)回復(fù)突變的問題。

圖6 基因組改組菌株遺傳穩(wěn)定性Fig.6 Genetic stability of genome shuffling strains

2.5 重組菌株CLNJ1-YC安全性評價(jià)

2.5.1 菌株溶血試驗(yàn)

將重組菌株CLNJ1-YC和金黃色葡萄球菌分別劃線接種于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上,培養(yǎng)后觀察,結(jié)果如圖7所示。金黃色葡萄球菌菌落周圍出現(xiàn)了透明圈,發(fā)生了β-溶血現(xiàn)象,而CLNJ1菌落周圍無溶血環(huán)出現(xiàn),說明CLNJ1-YC不是溶血性細(xì)菌,不存在引起敗血癥的風(fēng)險(xiǎn)。

a-CLNJ1-YC;b-金黃色葡萄球菌圖7 菌株溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.7 Results of strain hemolysis test

2.5.2 抗生素敏感性試驗(yàn)

菌株安全性評價(jià)的首要指標(biāo)是菌株對抗生素的敏感性,本實(shí)驗(yàn)選取青霉素、氨芐西林、頭孢曲松、慶大霉素、四環(huán)素、紅霉素、環(huán)丙沙星、林可霉素、復(fù)方新諾明、氯霉素10種抗生素對菌株進(jìn)行研究,根據(jù)CLSI的方法測定菌株抑菌環(huán)直徑,菌株敏感性結(jié)果如表1所示。CLNJ1-YC對10種常見的抗生素表現(xiàn)均為敏感性,證明菌株安全性好。

表1 菌株對10種抗生素的敏感性檢測結(jié)果Table 1 Sensitivity test results of strains to 10 antibiotics

3 討論與結(jié)論

釀酒酵母是傳統(tǒng)發(fā)酵中應(yīng)用最廣泛的微生物,其在發(fā)酵過程可以產(chǎn)生GABA,選育高產(chǎn)GABA酵母菌株在工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中具有重要意義。菌株誘變是一種操作簡便、容易獲得的誘變方式,可以有效地得到高質(zhì)量突變菌株。沙見宇等[19]利用紫外誘變篩選獲得2株高產(chǎn)莫納可林K突變株M7、M8,產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高了26%、27%。吳崢等[20]利用紫外誘變獲得產(chǎn)胞外谷胱甘肽突變菌株UV3-10,產(chǎn)量是出發(fā)菌株的2.52倍。ELHUSSIENY等[21]利用溴化乙啶誘變釀酒酵母,獲得突變體EtB20b的乙醇產(chǎn)量 (19.5%) 高于原始菌株 (18.0%)。本實(shí)驗(yàn)中LiCl誘變后菌株CLNJ1-Y的GABA產(chǎn)量為5.96 g/L,比出發(fā)菌株CLNJ1(1.72 g/L)產(chǎn)量提高了246%,證明LiCl對CLNJ1菌株的誘變效果好,提高菌株產(chǎn)GABA的能力。基因組改組是將傳統(tǒng)育種和原生質(zhì)體融合相結(jié)合的一種高效育種方法,是將誘變后的菌株制備成原生質(zhì)體進(jìn)行融合,使菌株的細(xì)胞基因組進(jìn)行重排。GHOSH等[22]通過基因組改組篩選出具有明顯培養(yǎng)特性的融合子 F2-19,黃色素、橙色素和紅色素的含量分別比野生型高67%、70%和76%。ABD等[23]采用基因組改組方法,顯著提高了植物乳桿菌的抗菌活性,金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、銅綠假單胞菌和大腸桿菌的抑制區(qū)增加1.34、1.31、1.37和1.37倍。王曉潔等[24]利用基因組改組技術(shù),獲得融合子F2-24的短桿菌素產(chǎn)量是出發(fā)菌株的1.92倍。本實(shí)驗(yàn)獲得的融合菌株CLNJ1-YC的GABA產(chǎn)量為12.28 g/L,比誘變菌株CLNJ1-Y提高了106%,比出發(fā)菌株CLNJ1提高了614%,因此,基因組改組能夠更有效地提高菌株產(chǎn)GABA的能力。

改組菌株進(jìn)行菌株溶血試驗(yàn)和抗生素敏感性試驗(yàn),CLNJ1-YC沒有溶血環(huán)出現(xiàn),無溶血性,對大多數(shù)抗生素均敏感,菌株安全性良好,可以廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品生產(chǎn)中。