肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常見的原發(fā)性肝癌類型。在世界范圍內(nèi),乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是HCC的主要病因。近年來,盡管分子靶向治療和免疫治療等新的治療方法不斷出現(xiàn)并逐步應(yīng)用于臨床,HCC患者5 a總體生存期(overall survival,OS)并不理想[1]。因此,在分子水平上更好地了解HBV相關(guān)HCC(HBV-HCC)的發(fā)病機(jī)制可以促進(jìn)新的診斷和治療方法的開發(fā)。細(xì)胞衰老是指由多種因素,如DNA損傷、原癌基因異常激活等誘發(fā),使增殖細(xì)胞發(fā)生周期停滯的一種機(jī)制。越來越多的研究證據(jù)表明,衰老細(xì)胞在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的作用。衰老細(xì)胞在腫瘤組織內(nèi)大量累積,分泌多種炎癥細(xì)胞因子和蛋白酶等,又被稱為“衰老相關(guān)的分泌表型”(senescence-associated secretory phenotype,SASP)[2,3]。SASP可以通過維持干細(xì)胞特征、創(chuàng)造免疫抑制環(huán)境、誘導(dǎo)耐藥性產(chǎn)生等方式,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移[4]。ARHGAP18基因是一個(gè)細(xì)胞衰老相關(guān)基因,通過誘導(dǎo)細(xì)胞衰老和抗炎表型,調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡,參與了多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程[5-7]。目前,關(guān)于ARHGAP18基因是否參與HBV-HCC的發(fā)生和進(jìn)展,尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。本研究評(píng)估了數(shù)據(jù)庫(kù)HBV-HCC癌組織ARHGAP18水平變化,從轉(zhuǎn)錄組和甲基化層面探索了ARHGAP18水平與HCC發(fā)生的分子機(jī)制,為其作為HCC潛在的治療靶點(diǎn)和預(yù)后指標(biāo)提供證據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)集獲取 從基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)(gene expression omnibus,GEO)中獲得GSE55092、GSE62232、GSE77276和GSE83148共4個(gè)公開數(shù)據(jù)集。在GSE83148數(shù)據(jù)集,使用基因芯片(Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array)對(duì)122例HBV感染者肝組織(HBsAg或血清HBV-DNA陽(yáng)性)和6例正常肝組織進(jìn)行RNA水平分析;GSE62232數(shù)據(jù)集使用同樣的基因芯片,對(duì)81例HCC患者腫瘤組織和10例正常肝組織進(jìn)行RNA水平分析;GSE55092數(shù)據(jù)集使用同樣的基因芯片研究HBV-HCC患者整個(gè)肝臟分子異質(zhì)性。研究者在11例HCC患者獲得了120份樣本,其中39份來自腫瘤中心或腫瘤外圍,81份來自癌旁組織;GSE77276數(shù)據(jù)集是HCC患者的多組學(xué)分析數(shù)據(jù)集,使用高通量測(cè)序和基因芯片對(duì)19例HCC患者腫瘤組織、癌旁組織和門靜脈血栓進(jìn)行拷貝數(shù)變異、DNA 甲基化、微小RNA和轉(zhuǎn)錄組分析。

1.2 差異表達(dá)基因分析 以ARHGAP18水平中位數(shù)作為截?cái)帱c(diǎn),將GSE77509中HBV-HCC患者分為高水平組和低水平組。應(yīng)用R軟件進(jìn)行繪圖和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。應(yīng)用Limma包分析ARHGAP18高水平組與低水平組間差異表達(dá)的基因[8]。P<0.05且log2FC> 1被認(rèn)為是鑒定差異基因表達(dá)的閾值。

1.3 功能富集分析 對(duì)差異表達(dá)基因(DEmRNA)進(jìn)行注釋,應(yīng)用基因注釋和分析數(shù)據(jù)庫(kù)(Metascape,https://metascape.org/)進(jìn)行功能富集分析,包括GO途徑分析[9]。

1.4 甲基化分析 應(yīng)用ChaMP包對(duì)Illumina公司Human Methylation 450K甲基化芯片進(jìn)行數(shù)據(jù)分析[10]。通過β值鑒定每個(gè)樣品的差異甲基化探針(DMP),P<0.05且|△β|> 0.1被認(rèn)為是鑒定差異甲基化位點(diǎn)的閾值。

1.5 UALCAN在線分析 UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu)系應(yīng)用癌癥基因組圖譜(TCGA)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和來自31種癌癥類型的臨床數(shù)據(jù),可對(duì)TCGA基因數(shù)據(jù)進(jìn)行深入分析[11]。應(yīng)用UALCAN分析不同臨床和病理學(xué)特征的HCC組織ARHGAP18相對(duì)水平以及對(duì)預(yù)后的影響。

1.6 GEPIA在線分析 基因表達(dá)譜交互分析網(wǎng)站是一個(gè)基于TCGA和基因型-組織表達(dá)計(jì)劃(GTEx)數(shù)據(jù)提供快速且可自定義功能的在線網(wǎng)站[12]。GEPIA可以提供關(guān)鍵的交互式和可自定義功能,包括差異表達(dá)分析、相似基因檢測(cè)和降維分析。

2 結(jié)果

2.1 HBV-HCC ARHGAP18水平異常升高 為了解ARHGAP18是否參與了HBV-HCC發(fā)生發(fā)展,我們應(yīng)用4個(gè)GEO數(shù)據(jù)集從不同角度比較了ARHGAP18的水平變化。在GSE83148數(shù)據(jù)集,發(fā)現(xiàn)HBV感染者肝組織ARHGAP18 RNA水平為(5.62±0.66),顯著高于正常肝組織[(5.04±0.21),P<0.05];在GSE62232數(shù)據(jù)集,發(fā)現(xiàn)HBV-HCC腫瘤組織ARHGAP18水平為(77.20±50.82),顯著高于正常肝組織[(20.00±5.52),P<0.05];在GSE77509數(shù)據(jù)集,發(fā)現(xiàn)HBV-HCC腫瘤組織ARHGAP18水平為(3988.63±1701.17),顯著高于癌旁組織[(1976.34±531.32),P<0.05];進(jìn)一步比較距離HBV-HCC腫瘤中心不同距離組織ARHGAP18水平變化,發(fā)現(xiàn)在肝臟邊緣癌旁組織(37個(gè)樣本,區(qū)域1)、距腫瘤2～3 cm處癌旁組織(19個(gè)樣本,區(qū)域2)、腫瘤邊緣癌旁組織(25個(gè)樣本,區(qū)域3)、腫瘤外圍區(qū)域組織(26個(gè)樣本,區(qū)域4)和腫瘤中心區(qū)域組織(13個(gè)樣本,區(qū)域5)ARHGAP18水平分別為(7.06±0.61)、(6.83±0.47)、(6.82±0.42)、(7.75±0.56)和(8.38±0.79),提示向腫瘤中心靠近時(shí)ARHGAP18水平存在異常升高的趨勢(shì)(P<0.05,圖1)。

圖1 距離HBV-HCC患者腫瘤中心不同位置ARHGAP18水平變化

2.2 不同臨床和病理學(xué)特征的HCC組織ARHGAP18水平變化 應(yīng)用UALCAN在線分析網(wǎng)站進(jìn)行TCGA-HCC數(shù)據(jù)分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)HCC組織ARHGAP18水平異常升高;不同腫瘤分期、腫瘤分級(jí)和TP53是否突變的HCC組織ARHGAP18水平存在顯著性差異;HCC組織ARHGAP18高水平者OS顯著縮短。

2.3 全基因組表達(dá)譜與ARHGAP18水平之間的關(guān)聯(lián) 對(duì)GSE77509數(shù)據(jù)集中轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析,以ARHGAP18水平中位數(shù)為截?cái)帱c(diǎn)將其分為高/低水平組,每組各9例,共鑒定出661個(gè)上調(diào)基因和330個(gè)下調(diào)基因(P<0.05,|log2FC|>1,圖2A);在上調(diào)基因中發(fā)現(xiàn)有抑制細(xì)胞凋亡基因(如CAPN6等)、HBV-HCC潛在標(biāo)靶基因(PTN)、代謝異常相關(guān)基因(如GSTP1等);下調(diào)的基因中包括協(xié)調(diào)增殖停滯和肝細(xì)胞分化的重要轉(zhuǎn)錄因子(如CEBPA)、鈣粘蛋白家族基因(如CDH7和CDH12);應(yīng)用Metascape在線數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行差異基因功能富集分析,進(jìn)一步探索在HBV-HCC發(fā)生和進(jìn)展過程中重要的信號(hào)通路。GO生物學(xué)通路分析表明,差異表達(dá)的上調(diào)基因主要富集于炎癥相關(guān)途徑(如炎癥反應(yīng)、炎癥反應(yīng)的正調(diào)控、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)等)、免疫相關(guān)途徑(激活免疫反應(yīng)、免疫效應(yīng)過程的調(diào)節(jié)、先天性免疫反應(yīng)、適應(yīng)性免疫反應(yīng)等,圖2B);下調(diào)基因富集通路相對(duì)零散,主要富集于細(xì)胞形態(tài)發(fā)生、離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)等通路(圖2D)。令人感興趣的是,在ARHGAP18高水平組基因富集結(jié)果提示多條炎癥和免疫相關(guān)途徑被異常激活。應(yīng)用GEPIA在線分析網(wǎng)站對(duì)TCGA中HCC數(shù)據(jù)進(jìn)行ARHGAP18與CD274(PDL1)水平相關(guān)性分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ARHGAP18與CD274水平呈正相關(guān)(圖2C)。

圖2 HCC組織ARHGAP18水平與全基因組轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)A:ARHGAP18高低水平組差異基因火山圖;B:ARHGAP18高水平組上調(diào)的20條GO通路; C:TCGA-HCC組織ARHGAP18與CD274(PDL1)水平相關(guān);D:ARHGAP18高水平組下調(diào)的20條GO通路

2.4 與ARHGAP18水平相關(guān)的全基因組甲基化改變情況 為鑒定ARHGAP18高/低水平組甲基化差異基因,對(duì)基因啟動(dòng)子區(qū)域的全基因組DNA甲基化進(jìn)行了分析。在405488個(gè)甲基化位點(diǎn)共確定了2603個(gè)差異甲基化位點(diǎn)(|△β|>0.1,P<0.05)。與ARHGAP18低水平組比,ARHGAP18高水平組中有1234個(gè)位點(diǎn)顯示出高甲基化,而1369個(gè)位點(diǎn)顯示為低甲基化;高甲基化基因富集于細(xì)胞形態(tài)發(fā)生和細(xì)胞周期的正調(diào)控等通路,而低甲基化基因富集于腺苷酸環(huán)化酶調(diào)節(jié)的G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路和Wnt信號(hào)通路的調(diào)控等通路;對(duì)轉(zhuǎn)錄組與甲基化數(shù)據(jù)聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn),有28個(gè)基因高表達(dá)/啟動(dòng)子低甲基化,4個(gè)基因低表達(dá)/啟動(dòng)子高甲基化,高表達(dá)/啟動(dòng)子低甲基化基因包括免疫和炎癥相關(guān)因子TGFBI和CD40等。

3 討論

細(xì)胞衰老在腫瘤發(fā)生過程中起到至關(guān)重要的作用[13]。細(xì)胞衰老通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和激活免疫監(jiān)視可以在早期抑制腫瘤發(fā)生。然而,衰老細(xì)胞可以通過維持干細(xì)胞特征、創(chuàng)造免疫抑制環(huán)境、誘導(dǎo)耐藥性和刺激上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等,間接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移,給臨床早期診斷提出了很大的挑戰(zhàn)[14,15]。

ARHGAP18是近年來發(fā)現(xiàn)的與細(xì)胞衰老相關(guān)的基因。ARHGAP18也被稱為SENEX,是RhoGAP蛋白家族成員。該蛋白家族在調(diào)節(jié)小Rho GTP酶活性方面起作用。ARHGAP18對(duì)不同的Rho GTP酶表現(xiàn)出不同的特異性。在內(nèi)皮細(xì)胞,ARHGAP18優(yōu)先作用于RhoC[16],而在癌細(xì)胞,它主要對(duì)RhoA表現(xiàn)出特異性[17]。通過抑制RHoA信號(hào),ARHGAP18可以在三陰性乳腺癌和肝細(xì)胞癌細(xì)胞促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[18,19],并間接調(diào)控MAPK信號(hào)通路。

本研究表明,ARHGAP18在多個(gè)HBV-HCC的GEO數(shù)據(jù)集中水平異常升高,與疾病進(jìn)展密切相關(guān),并可能預(yù)測(cè)了不良的臨床結(jié)局。為了進(jìn)一步探索ARHGAP18基因在HBV-HCC發(fā)生發(fā)展過程中的生物學(xué)作用,我們從轉(zhuǎn)錄組學(xué)等多個(gè)層面進(jìn)行了探索性分析。對(duì)GEO中GSE77509數(shù)據(jù)集轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),在差異上調(diào)的基因中發(fā)現(xiàn)免疫反應(yīng)、先天性免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等多條重要的免疫和炎癥相關(guān)通路顯著上調(diào),并發(fā)現(xiàn)ARHGAP18與PDL1水平呈正相關(guān),提示ARHGAP18可能與腫瘤微環(huán)境中免疫抑制作用相關(guān)。

DNA甲基化異常改變是癌癥的一個(gè)特征性的表現(xiàn)。多項(xiàng)研究報(bào)道了HBV-HCC組織異常的DNA甲基化[20]。我們使用ChAMP包對(duì)ARHGAP18高/低水平組進(jìn)行甲基化位點(diǎn)差異分析,進(jìn)一步將全基因組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與甲基化數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析,結(jié)果共有32個(gè)基因在ARHGAP18高水平組和低水平組之間表現(xiàn)出明顯的表觀遺傳和表達(dá)模式改變,并且發(fā)現(xiàn)高表達(dá)/啟動(dòng)子低甲基化基因包括TGFBI和CD40等免疫和炎癥明星因子,提示在ARHGAP18高水平組存在免疫和炎癥相關(guān)通路的異常激活。