黃 靜,商惠民,王 菁,周 娟

自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis,AIH)是自身免疫反應(yīng)介導(dǎo)的累及肝臟實質(zhì)的特發(fā)性疾病,其臨床特征包括血清自身抗體陽性、高免疫球蛋白G血癥、血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)水平升高,其組織學(xué)特征表現(xiàn)為以淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤為主的慢性炎癥。若未能及時進(jìn)行有效的診治,可導(dǎo)致肝硬化和肝衰竭的發(fā)生[1,2]。AIH臨床表現(xiàn)多樣,發(fā)病隱匿,易復(fù)發(fā),臨床控制難度較大。目前,AIH的病因和發(fā)病機制尚不清楚,但研究表明,AIH發(fā)病多與遺傳和自身免疫反應(yīng)等因素有關(guān)[3]。Toll 樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是大量表達(dá)于外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood monocytes,PBMCs)表面的免疫識別受體。有研究[4,5]表明,非特異性的肝損傷釋放TLR2/4配體,可促進(jìn)炎癥因子持續(xù)表達(dá),從而引起AIH的啟動,而阻斷TLR2/4配體則可有效抑制肝損傷和肝纖維化,表明TLR2可能參與了AIH的發(fā)生和發(fā)展過程。靶向TLR2/4信號傳導(dǎo)或可為AIH治療策略提供新方向。最新研究報道[6,7]指出,細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4,CTLA-4)基因多態(tài)性與AIH的發(fā)病有關(guān)。應(yīng)用免疫檢查點抑制劑阻斷CTLA-4表達(dá)可用于治療AIH患者。CTLA-4又稱CD152,是存在于T細(xì)胞表面的免疫球蛋白超家族基因成員,可傳遞阻止信號和負(fù)性調(diào)節(jié)T細(xì)胞增殖,在CD4+T細(xì)胞激活過程中具有關(guān)鍵性作用[7]。本研究檢測了AIH患者PBMCs TLR2和CTLA-4 mRNA水平變化,以分析其與肝組織病理學(xué)變化特征的關(guān)系,現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 病例來源 2018年6月～2022年6月我院收治的AIH患者47例,男性11例,女性36例;年齡為36～69歲,平均年齡為(52.8±10.3)歲。AIH符合《自身免疫性肝炎診斷和治療共識(2015年)》[8]的診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)存在病毒性肝炎或其他肝病;(2)存在其他自身免疫性疾病;(3)合并嚴(yán)重的心腦血管疾病:(4)血液系統(tǒng)疾病;(5)存在惡性腫瘤;(6)近期有應(yīng)用免疫抑制劑治療史;(7)既往有肝臟手術(shù)史。另選擇同期健康人50例作為對照組,男15例,女35例;年齡為35～67歲,平均年齡為(51.7±8.9)歲。兩組年齡和性別比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究獲得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn),患者簽署知情同意書。

1.2 肝活檢 常規(guī)對AIH患者行肝穿刺檢查,肝組織炎癥活動度分為G1～G4級,肝纖維化程度分為F1～F4期[9]。根據(jù)界面破壞范圍和細(xì)胞浸潤程度,分為:輕度:局部或少數(shù)門管區(qū)被破壞;中度:<50%門管區(qū)被破壞或纖維間隔形成;重度:≥50%門管區(qū)被破壞或纖維間隔形成。

1.3 PBMCs TLR2和CTLA-4 mRNA檢測 采集空腹靜脈血,使用淋巴細(xì)胞分離液(中國科學(xué)院天津試劑廠)和采用Ficoll密度梯度離心法分離得到PBMCs,4℃冷藏、備用。采用Trizol法提取PBMCs總RNA,使用紫外分光光度計(美國Thermo公司)檢測并記錄總RNA濃度和純度。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(FINNZYMES公司)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。取cDNA,建立20μL反應(yīng)體系,行PCR擴(kuò)增。TLR2上游引物(上海生工生物公司)為5′-TTTGCTGGACTTACCTTCCTTG-3′,下游為5′-CAGTATCTCGCAGTTCCAAACA-3′;CTLA-4上游引物(上海生工生物公司)為5′-GACCAGGGACTCTACATCTGC-3′,下游為5′-TCACATTCTGGCTCTGTTGG-3′。PCR 反應(yīng)如下:95℃ 5 min,94℃ 30 s,57℃ 60 s,72℃ 60 s,共35個循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠(北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司)電泳,計算TLR2和CTLA-4 mRNA相對水平,以2-△△Ct表示。

1.4 PBMCs表面TLR2和CTLA-4 表達(dá)水平檢測 使用美國貝克曼CytoFLEX流式細(xì)胞儀檢測PBMCs表面TLR2和CTLA-4表達(dá)水平,抗體均購自美國BD公司。

2 結(jié)果

2.1 兩組PBMCs和細(xì)胞表面TLR2和CTLA-4比較 AIH患者PBMCs TLR2 mRNA水平和TLR2陽性的細(xì)胞百分比顯著高于健康人,而PBMCs CTLA-4 mRNA水平和CTLA-4陽性的細(xì)胞百分比顯著低于健康人(P<0.05,表1)。

表1 兩組PBMCs和細(xì)胞表面TLR2和比較

2.2 不同病情嚴(yán)重程度的AIH患者PBMCs TLR2和CTLA-4水平及表面分子陽性細(xì)胞百分比比較 重度AIH患者PBMCs TLR2 mRNA水平和TLR2陽性的PBMCs百分比顯著高于中度或輕度患者(P<0.05),而PBMCs CTLA-4 mRNA水平和CTLA-4陽性的PBMCs百分比顯著低于中度或輕度患者(P<0.05,表2)。

表2 不同病情患者細(xì)胞TLR2和CTLA-4 mRNA水平及表面分子陽性細(xì)胞百分比比較

2.3 不同肝組織炎癥分級的AIH患者細(xì)胞TLR2和CTLA-4 mRNA水平及表面分子陽性細(xì)胞百分比比較 肝組織G3/G4級患者PBMCs TLR2 mRNA水平和TLR2陽性的PBMCs百分比顯著高于G1/G2級,而PBMCs CTLA-4 mRNA水平和CTLA-4 陽性的PBMCs百分比顯著低于G1/G2級(P<0.05,表3)。

表3 不同炎癥分級患者細(xì)胞TLR2和CTLA-4 mRNA水平及表面分子陽性細(xì)胞百分比比較

2.4 不同肝纖維化分期的AIH患者細(xì)胞TLR2和CTLA-4 mRNA水平及表面分子陽性細(xì)胞百分比比較 肝組織F3/F4期患者PBMCs TLR2 mRNA水平和TLR2陽性的PBMCs細(xì)胞百分比顯著高于F1/F2期或F0期,而PBMCs CTLA-4 mRNA水平和CTLA-4陽性的PBMCs百分比顯著低于F1/F2期或F0期(P<0.05,表4)。

表4 不同肝纖維化分期患者細(xì)胞TLR2和CTLA-4 mRNA水平及表面分子陽性細(xì)胞百分比比較

3 討論

AIH主要由患者自身免疫不耐受導(dǎo)致肝臟損傷而發(fā)病,具有淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤為主的炎癥性肝組織學(xué)特征,與慢性炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[10,11]?；贏IH的臨床和肝組織學(xué)特征,學(xué)者們多認(rèn)為自身免疫異常和持續(xù)慢性炎癥反應(yīng)參與了AIH的發(fā)病和疾病發(fā)展[12]。TLRs是先天性和適應(yīng)性免疫的單個跨膜非催化性蛋白質(zhì),在免疫反應(yīng)的激活過程中起關(guān)鍵作用,其免疫耐受的打破可誘導(dǎo)肝臟持續(xù)的炎癥反應(yīng)。TLR2、TLR3和TLR4等多種TLRs均與AIH的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[13,14]。CTLA-4為白細(xì)胞分化抗原,也是T細(xì)胞跨膜受體,可負(fù)性調(diào)節(jié)T細(xì)胞水平,抑制機體免疫應(yīng)答反應(yīng),其數(shù)量或功能異常參與了自身免疫性疾病的發(fā)病過程,被證明是癌癥和自身免疫性疾病免疫檢查點靶向治療的重要位點,近年備受臨床關(guān)注[15,16]。

本研究發(fā)現(xiàn),相較于健康人,AIH患者PBMCs TLR2 mRNA水平和TLR2陽性的PBMCs百分比顯著升高,而CTLA-4水平顯著降低,提示PBMCs TLR2和CTLA-4表達(dá)異?？纱龠M(jìn)AIH的發(fā)生。TLR2是自身免疫相關(guān)炎癥的重要調(diào)節(jié)因子,不僅可通過識別病原體驅(qū)動免疫反應(yīng),還可識別內(nèi)源性危險信號,觸發(fā)機體免疫應(yīng)答,促進(jìn)免疫細(xì)胞活化,導(dǎo)致組織炎癥反應(yīng),有利于機體對抗病原體感染,但過度活躍的炎癥反應(yīng)或TLR2信號傳導(dǎo)功能失調(diào)則可能引起無菌性炎癥和自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展,被證實在肝臟疾病炎癥、纖維化和肝硬化乃至肝細(xì)胞癌進(jìn)程過程中均發(fā)揮了重要的作用[17,18]。國外研究[19]發(fā)現(xiàn),CTLA-4基因多態(tài)性對T淋巴細(xì)胞具有不同的抑制程度,其49A>G位點基因多態(tài)性與AIH易感性有關(guān),可能與CTLA4基因突變降低了CTLA-4 mRNA水平或?qū)е翪TLA4蛋白結(jié)構(gòu)的修飾改變有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)不同病情嚴(yán)重程度、不同肝組織炎癥分級和不同肝纖維化程度的AIH患者PBMCs TLR2和CTLA-4均存在顯著性差異,并與肝組織炎癥分級和纖維化分期存在明顯的關(guān)聯(lián),提示隨著病情加重、炎癥程度加深和纖維化加劇,AIH患者PBMCs TLR2 mRNA水平越高,而CTLA-4陽性的PBMCs百分比越低。國外研究[20]表明,相較于健康人,AIH患者血清TLR2明顯升高,且與細(xì)胞因子水平有關(guān)。他們認(rèn)為AIH發(fā)病與單核細(xì)胞TLR2/TLR4通路被激活有關(guān),該通路被激活后可導(dǎo)致肝組織炎癥小體增多,引起過度炎癥反應(yīng),損傷肝組織,同時驅(qū)動相關(guān)炎癥性細(xì)胞因子分泌,調(diào)節(jié)T細(xì)胞表型,造成T淋巴細(xì)胞功能障礙。TLR2相關(guān)信號通路被激活可刺激巨噬細(xì)胞功能,促進(jìn)肝星狀細(xì)胞增殖,加劇肝纖維化,提示TLR2與肝組織纖維化程度有關(guān)[21-23]。TLR2相關(guān)通路可調(diào)控多條炎癥通路和相關(guān)的細(xì)胞因子水平,參與了AIH患者肝組織炎癥和纖維化進(jìn)程。