肖 捷，紀(jì) 華，王 宵，王 靜，劉凌云，李美荃，王 斌

(1.大理大學(xué)藥學(xué)院,云南 大理 671000;2.云南省第一人民醫(yī)院腫瘤科,云南 昆明 650034;3.昆明學(xué)院云南教育廳新型畜禽疫苗及產(chǎn)業(yè)關(guān)鍵技術(shù)工程研究中心,云南 昆明 650214)

重組蛋白藥物是利用基因工程技術(shù)表達(dá)的產(chǎn)物,用于彌補體內(nèi)某些功能蛋白的缺失[1],在生物醫(yī)藥領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。但是,目前在哺乳動物細(xì)胞中重組蛋白藥物的高效和穩(wěn)定表達(dá)仍是生產(chǎn)上的主要難題。外源基因在哺乳動物細(xì)胞中高效和穩(wěn)定表達(dá)的主要障礙與轉(zhuǎn)基因沉默效應(yīng)和位置效應(yīng)等表觀遺傳機制有關(guān)。轉(zhuǎn)基因沉默是宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)入的外源基因受到細(xì)胞的內(nèi)在機制的抑制而不表達(dá),這是生物體在基因調(diào)控上的一種自我保護(hù)機制,也是基因工程產(chǎn)品生物實用化和商品化的巨大障礙[2-3]。轉(zhuǎn)基因沉默可發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和染色質(zhì)DNA水平3種不同層次上[4-5]。位置效應(yīng)是指當(dāng)轉(zhuǎn)基因插入轉(zhuǎn)錄不活躍區(qū)域或異染色質(zhì)區(qū)域,導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因處于低水平的轉(zhuǎn)錄或不能轉(zhuǎn)錄[6-7]。啟動子上的調(diào)控元件能影響轉(zhuǎn)基因沉默和位置效應(yīng)[8],如增強子能消除DNA甲基化[9-10],CpG島調(diào)節(jié)元件對DNA甲基化具有抵抗能力等[11]。但是,啟動子上的調(diào)節(jié)元件如何影響轉(zhuǎn)基因沉默效應(yīng)和位置效應(yīng)尚不完全清楚。多能干基因八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4(octamer binding transcription factor 4,OCT4)、性別決定區(qū)Y框蛋白2(sex determining region Y box protein 2,SOX2)和NANOG是典型的受表觀遺傳調(diào)控的細(xì)胞命運決定基因的關(guān)鍵因子,其中OCT4基因啟動子主要包含近端增強子和近端啟動子,SOX2基因啟動子包含CpG島,而NANOG基因啟動子不含近端增強子和CpG島[12-13]。同時含CpG島和增強子的巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus,CMV)基因啟動子是真核表達(dá)載體中常用的高表達(dá)啟動子[14],能夠在多種不同類型的細(xì)胞中高效表達(dá)外源基因。本研究觀察NANOG、SOX2、OCT4、CMV基因啟動子介導(dǎo)的載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到中國倉鼠卵巢細(xì)胞株CHO-K1細(xì)胞和人胚胎腎細(xì)胞(human embryonic kidney 293,HEK293)中的表達(dá)差異,以及各啟動子介導(dǎo)的載體轉(zhuǎn)染后在不同時間段所受的轉(zhuǎn)基因沉默效應(yīng)和不同單克隆中受位置效應(yīng)的影響,探討啟動子上增強子和CpG島調(diào)節(jié)元件在轉(zhuǎn)基因沉默和位置效應(yīng)中的作用,以期為構(gòu)建高效穩(wěn)定表達(dá)的載體提供理論依據(jù),為解決重組蛋白藥物在生產(chǎn)過程中的低產(chǎn)量、不穩(wěn)定等問題提供方向。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑與儀器

中國倉鼠卵巢細(xì)胞株CHO-K1和HEK293細(xì)胞株(冷凍管干冰保存運輸)購自廣州吉妮歐生物科技有限公司。含增強綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)載體pE-C1購自上海生工生物工程股份有限公司,pE-Oct4、pE-Sox2、pE-Nanog 載體為云南教育廳新型畜禽疫苗及產(chǎn)業(yè)關(guān)鍵技術(shù)工程研究中心構(gòu)建,卡那霉素購自大連美侖生物技術(shù)有限公司,胰蛋白酶細(xì)胞消化液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司,胎牛血清購自以色列Biological Industries公司,大提質(zhì)粒試劑盒購自美國Omega 公司,總RNA提取試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司,AseⅠ酶和AgeⅠ酶購自TaKaRa寶生物技術(shù)(大連)有限公司,引物由昆明碩擎生物科技有限公司合成;聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀購自美國ABI公司,電穿孔系統(tǒng)、電擊杯型號640購自美國BTX公司,熒光倒置顯微鏡購自德國Leica公司,SpectraMax M2酶標(biāo)儀購自美國Molecular Devices公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 pE-Oct4、pE-Sox2、pE-Nanog載體構(gòu)建

取pE-C1載體,用AseⅠ酶和AgeⅠ酶對pE-C1載體行雙酶切,去除mCMV基因啟動子片段,用人源OCT4、SOX2、NANOG基因啟動子連接在mCMV基因啟動子去除片段位置進(jìn)行載體構(gòu)建,從而獲得pE-Oct4、pE-Sox2、pE-Nanog 3種載體。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將CHO-K1細(xì)胞接種于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和體積分?jǐn)?shù)1%雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基中,將HEK293細(xì)胞接種于含體積分?jǐn)?shù)10%小牛血清和體積分?jǐn)?shù)1%雙抗的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基,置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng);待細(xì)胞融合達(dá)80%～90%時傳代,按所需濃度接種至培養(yǎng)瓶中或細(xì)胞培養(yǎng)板上,用于后續(xù)實驗。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及G418篩選單克隆細(xì)胞株

將CHO-K1、HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)移到75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,細(xì)胞融合達(dá)50%～70%時,用胰蛋白酶消化細(xì)胞,加入1 mL RPMI 1640培養(yǎng)基獲得細(xì)胞混懸液;分別取400 μL細(xì)胞混懸液(細(xì)胞數(shù)約為 2×106)和pE-C1、pE-Oct4、pE-Sox2、pE-Nanog 載體質(zhì)粒(各20 μg)加入到電擊杯中混勻,進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化;將電擊杯放入電擊槽中,280 V、20 ms脈沖電擊1次,電擊后將電擊杯于冰上靜置5 min;將CHO-K1和HEK293細(xì)胞分別吸入含有0.8 mL CHO-K1細(xì)胞培養(yǎng)基和HEK293細(xì)胞培養(yǎng)基的12孔板中,置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,待細(xì)胞融合度達(dá)50%～70%時,加入700～800 mg·L-1G418 15 μL;48 h后觀察細(xì)胞,當(dāng)有大量細(xì)胞死亡時,換成篩選培養(yǎng)基培養(yǎng),將G418濃度減半,持續(xù)G418加壓篩選,直至細(xì)胞克隆生成;10～14 d 左右細(xì)胞克隆形成,長出肉眼可見的單克隆細(xì)胞株后,使用軟瓊脂法篩選細(xì)胞單克隆;將單個細(xì)胞株挑至96孔板內(nèi),移液槍吹打細(xì)胞形成細(xì)胞懸液,置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細(xì)胞貼壁生長后,在熒光顯微鏡下篩選單克隆細(xì)胞株。

1.2.4 熒光強度分析EGFP蛋白表達(dá)

使用熒光顯微鏡對構(gòu)建載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染第20天的CHO-K1細(xì)胞和HEK293細(xì)胞以及構(gòu)建載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染第30天的CHO-K1細(xì)胞進(jìn)行熒光拍照,參數(shù):10倍焦距;70%綠光、藍(lán)光和白光強度,每個樣品選取3個不同拍攝點進(jìn)行拍照,并應(yīng)用Image J 軟件中Mean算法對熒光圖片進(jìn)行熒光強度分析,以熒光強度值代表EGFP蛋白表達(dá)。

1.2.5 克隆表達(dá)差異分析

應(yīng)用Image J 軟件中Mininum、Maxentropy、Mean 3種算法分別計算pE-C1、pE-Oct4、pE-Sox2、pE-Nanog 4個載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后形成的多個單細(xì)胞克隆混合生長樣品在同一個樣本中最大熒光強度的細(xì)胞、大于平均熒光強度的所有細(xì)胞和最小熒光強度的所有細(xì)胞的平均熒光強度值,以此表示該樣品中表達(dá)載體整合在不同位置導(dǎo)致的表達(dá)差異,反映其克服位置效應(yīng)后的穩(wěn)定表達(dá)程度[13]。

1.2.6 單克隆篩選和熒光強度分析EGFP蛋白表達(dá)

采用有限稀釋法從G418篩選后獲得的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染多個單克隆混合CHO-K1細(xì)胞中分別篩選pE-C1、pE-Oct4、pE-Sox2、pE-Nanog質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的單克隆細(xì)胞,每個質(zhì)粒載體隨機篩選3個單克隆細(xì)胞,應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行平均熒光強度分析,根據(jù)平均熒光強度觀察載體整合位置不同的單克隆細(xì)胞中EGFP熒光強度變化。

1.2.7 酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法檢測CMV、OCT4、SOX2、NANOG基因啟動子在CHO-K1細(xì)胞中介導(dǎo)表達(dá)的EGFP蛋白

將篩選出的CHO-K1單克隆細(xì)胞株在T25培養(yǎng)瓶中擴大培養(yǎng),待細(xì)胞融合達(dá)90%時,加入適量NP-40裂解液于冰上充分裂解,使用移液器將裂解物移至1.5 mL離心管中,4 ℃下14 000×g離心10 min,取上清液,置于新的1.5 mL離心管中,得到待測蛋白樣品;對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋,終質(zhì)量濃度分別為10、8、6、4、2 μg·L-1,各孔分別加50 μL;將pE-C1、pE-Oct4、pE-Sox2、pE-Nanog質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的4種單克隆細(xì)胞待測蛋白樣品進(jìn)行11稀釋,將稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品加入反應(yīng)孔中,立即加入50 μL小鼠EGFP單抗,蓋上膜板,輕輕振蕩搖勻,37 ℃ 孵育1 h;洗滌后在各反應(yīng)孔中加入0.1 mL新鮮稀釋的親和鏈霉素-辣根過氧化物酶,37 ℃孵育0.5～1.0 h,洗滌3次后,加底物液四甲基聯(lián)苯胺顯色,應(yīng)用酶標(biāo)儀于波長450 nm處檢測各孔吸光度值,繪制樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算EGFP蛋白表達(dá)水平。實驗重復(fù)3次,取均值。

1.2.8 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)法檢測CMV、OCT4、SOX2、NANOG基因啟動子在CHO-K1細(xì)胞中介導(dǎo)表達(dá)的EGFP mRNA

取篩選得到的pE-C1、pE-Oct4、pE-Sox2、pE-Nanog 質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO-K1單克隆細(xì)胞,用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將1.0 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR反應(yīng)體系:cDNA 2.0 μL,上下游引物各0.4 μL,Eastep?qPCR Master Mix 2×10.0 μL,Rox 0.4 μL,無酶水 6.8 μL。 引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成。EGFP上游引物序列為5′-GTGCAGTGCTTCAGCCGCTAC-3′,下游引物序列為5′-GTGCAGT GCTTCAGCCGCTAC-3′;甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)上游引物序列為5′-GTGCAGTGCTTCAGCCGCTAC-3′,下游引物序列為5′-GTGCAGTGCTTCAGCCGCTAC-3′。以內(nèi)參GAPDH的循環(huán)數(shù)作為對照,將配制好的樣品和內(nèi)參置于熒光定量 PCR儀(EppendorfQX200)上進(jìn)行PCR擴增反應(yīng),采用2-△△Ct法計算CHO-K1細(xì)胞中EGFP mRNA的相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次,取均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 不同時段內(nèi)不同啟動子對轉(zhuǎn)基因沉默效應(yīng)的反應(yīng)

pE-Sox2、pE-Oct4、pE-Nanog、pE-C1載體構(gòu)建成功,其結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 含SOX2、CMV、OCT4、NANOG基因啟動子表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Structural diagram of expression vector containing SOX2,CMV,OCT4 and NANOG gene promoter

SOX2基因啟動子在CHO-K1細(xì)胞和HEK293細(xì)胞中介導(dǎo)表達(dá)的EGFP平均熒光強度分別為0.200±0.081、0.150±0.060,SOX2基因啟動子在CHO-K1細(xì)胞和HEK293細(xì)胞中介導(dǎo)表達(dá)的EGFP平均熒光強度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.770,P>0.05)。OCT4基因啟動子在CHO-K1細(xì)胞和HEK293細(xì)胞中介導(dǎo)表達(dá)的EGFP平均熒光強度分別為0.250±0.041、0.061±0.019;OCT4基因啟動子在CHO-K1細(xì)胞中介導(dǎo)表達(dá)的EGFP平均熒光強度顯著高于HEK293細(xì)胞,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.000,P<0.05)。CMV基因啟動子在CHO-K1細(xì)胞和HEK293細(xì)胞中介導(dǎo)表達(dá)的EGFP平均熒光強度分別為 0.330±0.020、0.180±0.013;CMV基因啟動子在CHO-K1細(xì)胞中介導(dǎo)表達(dá)的EGFP平均熒光強度顯著高于HEK293細(xì)胞,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=11.100,P<0.05)。NANOG基因啟動子在CHO-K1細(xì)胞和HEK293細(xì)胞中介導(dǎo)表達(dá)的EGFP平均熒光強度分別為 0.240±0.029、0.150±0.020;NANOG基因啟動子在CHO-K1細(xì)胞中介導(dǎo)表達(dá)的EGFP平均熒光強度顯著高于HEK293細(xì)胞,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.900,P<0.05)。 結(jié)果見圖2。

圖2 攜帶不同啟動子的載體在CHO-K1細(xì)胞和HEK293細(xì)胞中介導(dǎo)EGFP基因的表達(dá)Fig.2 Expression of EGFP in CHO-K1 cells and HEK293 mediated by vectors carrying different promoters

ELISA結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染第20、30天,SOX2基因啟動子在CHO-K1細(xì)胞中介導(dǎo)表達(dá)的EGFP蛋白水平分別為(1.77±0.18)、(1.81±0.04)μg·L-1;SOX2基因啟動子轉(zhuǎn)染第20、30天在CHO-K1細(xì)胞中介導(dǎo)表達(dá)的EGFP蛋白水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.330,P>0.05)。轉(zhuǎn)染第20、30天,CMV基因啟動子在CHO-K1細(xì)胞中介導(dǎo)表達(dá)的EGFP蛋白水平分別為(2.19±0.17)、(1.74±0.07)μg·L-1;CMV基因啟動子轉(zhuǎn)染第20天在CHO-K1細(xì)胞中介導(dǎo)表達(dá)的EGFP蛋白水平顯著低于轉(zhuǎn)染第30天,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.770,P<0.05);轉(zhuǎn)染第20、30天,OCT4基因啟動子在CHO-K1細(xì)胞中介導(dǎo)表達(dá)的EGFP蛋白水平分別為(2.11±0.16)、(1.84±0.10)μg·L-1;OCT4基因啟動子轉(zhuǎn)染第20、30天在CHO-K1細(xì)胞中介導(dǎo)表達(dá)的EGFP蛋白水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.500,P>0.05)。轉(zhuǎn)染第20、30天,NANOG基因啟動子在CHO-K1細(xì)胞中介導(dǎo)表達(dá)的EGFP蛋白水平分別為(2.02±0.14)、(2.02±0.09)μg·L-1;NANOG基因啟動子轉(zhuǎn)染第20、30天在CHO-K1細(xì)胞中介導(dǎo)表達(dá)的EGFP蛋白水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.014,P>0.05)。熒光強度分析顯示,轉(zhuǎn)染第20、30天,SOX2基因啟動子在CHO-K1 細(xì)胞介導(dǎo)表達(dá)的EGFP平均熒光強度值分別為0.140±0.020、0.140±0.009,CMV基因啟動子在CHO-K1細(xì)胞中介導(dǎo)表達(dá)的EGFP平均熒光強度值分別為0.220±0.032、0.240±0.015,NANOG基因啟動子在CHO-K1細(xì)胞中介導(dǎo)表達(dá)的EGFP平均熒光強度值分別為0.220±0.005、0.220±0.063;轉(zhuǎn)染第20天與轉(zhuǎn)染第30天,SOX2、CMV、NANOG基因啟動子在CHO-K1細(xì)胞中介導(dǎo)表達(dá)的EGFP平均熒光強度值比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.130、0.830、0.210,P>0.05)。轉(zhuǎn)染第20、30天,OCT4基因啟動子在CHO-K1細(xì)胞中介導(dǎo)表達(dá)的EGFP平均熒光強度值分別為0.250±0.042、0.099±0.015;OCT4基因啟動子轉(zhuǎn)染第30天在CHO-K1細(xì)胞中介導(dǎo)表達(dá)的EGFP平均熒光強度值顯著低于轉(zhuǎn)染第20天,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.750,P<0.05)。 結(jié)果見圖3。

2.2 不同啟動子介導(dǎo)翻譯階段轉(zhuǎn)基因沉默效應(yīng)

SOX2、CMV、OCT4和NANOG基因啟動子在CHO-K1細(xì)胞中介導(dǎo)表達(dá)的EGFP蛋白水平分別為(1.77±0.18)、(2.19±0.17)、(2.11±0.16)、(2.02±0.14)μg·L-1,SOX2、CMV、OCT4、NANOG基因啟動子在CHO-K1細(xì)胞中介導(dǎo)表達(dá)的EGFP蛋白水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=4.070,P>0.05)。SOX2、CMV、OCT4、NANOG基因啟動子在CHO-K1細(xì)胞中介導(dǎo)表達(dá)的EGFP mRNA相對表達(dá)量分別為0.013±0.007、0.400±0.120、1.190±0.410、1.670±0.510;CMV、OCT4、NANOG基因啟動子在CHO-K1細(xì)胞中介導(dǎo)表達(dá)的EGFP mRNA相對表達(dá)量顯著高于SOX2基因啟動子,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.440、5.000、5.740,P<0.05);CMV、OCT4基因啟動子在CHO-K1細(xì)胞中介導(dǎo)表達(dá)的EGFP mRNA相對表達(dá)量顯著高于NANOG基因啟動子,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.220、4.270,P<0.05);CMV基因啟動子在CHO-K1細(xì)胞中介導(dǎo)表達(dá)的EGFP mRNA相對表達(dá)量高于OCT4基因啟動子,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.270,P>0.05)。

為研究SOX2、CMV、OCT4、NANOG基因啟動子在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平的差異,轉(zhuǎn)錄水平用EGFP mRNA相對表達(dá)量表示,轉(zhuǎn)錄后水平用EGFP蛋白水平來表示,以1.5為基準(zhǔn)對轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平進(jìn)行相對定量分析,結(jié)果顯示,SOX2基因啟動子介導(dǎo)表達(dá)的EGFP在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平差異最大(t=16.900,P<0.05),NANOG基因啟動子介導(dǎo)表達(dá)的EGFP在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平差異次之(t=14.930,P<0.05),OCT4和CMV基因啟動子介導(dǎo)表達(dá)的EGFP在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平差異最小(t=2.060、0.430,P>0.05)。結(jié)果見表1。

2.3 不同細(xì)胞克隆顯示不同啟動子克服位置效應(yīng)的能力

用Mininum、Maxentropy、Mean等3種算法計算OCT4基因啟動子在多克隆下介導(dǎo)表達(dá)的EGFP熒光強度值分別為0.170±0.049、0.082±0.066、0.210±0.085,三者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=3.720,P>0.05);SOX2基因啟動子在多克隆下介導(dǎo)表達(dá)的EGFP熒光強度值分別為0.290±0.012、0.110±0.022、0.490±0.001,三者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=516.400,P<0.05);CMV基因啟動子在多克隆下介導(dǎo)表達(dá)的EGFP熒光強度值分別為0.440±0.009、0.096±0.004、0.580±0.035,三者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=428.500,P<0.05);NANOG基因啟動子在多克隆下介導(dǎo)表達(dá)的EGFP熒光強度值分別為 0.380±0.062、0.150±0.058、0.500±0.055,三者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=28.120,P<0.05)。不同單克隆細(xì)胞中的差異分析顯示,OCT4基因啟動子介導(dǎo)表達(dá)的EGFP熒光強度值分別為0.085±0.009、0.083±0.020、0.075±0.013,標(biāo)準(zhǔn)誤差值為0.005;CMV基因啟動子介導(dǎo)表達(dá)的EGFP熒光強度值分別為0.093±0.004、0.099±0.017、0.100±0.009,標(biāo)準(zhǔn)誤差值為 0.004;NANOG基因啟動子介導(dǎo)表達(dá)的EGFP熒光強度值分別為0.210±0.016、0.160±0.012、0.092±0.010,標(biāo)準(zhǔn)誤差值為0.057;SOX2基因啟動子介導(dǎo)表達(dá)的EGFP熒光強度值為0.110±0.008、0.140±0.016、0.099±0.029,標(biāo)準(zhǔn)誤差值為0.019。4種載體在不同單克隆細(xì)胞中介導(dǎo)表達(dá)的EGFP熒光強度值的標(biāo)準(zhǔn)誤差相比,從高到低依次為NANOG基因啟動子在不同單克隆細(xì)胞中介導(dǎo)表達(dá)的EGFP熒光強度值標(biāo)準(zhǔn)誤差、SOX2基因啟動子在不同單克隆細(xì)胞中介導(dǎo)表達(dá)的EGFP熒光強度值標(biāo)準(zhǔn)誤差、OCT4基因啟動子在不同單克隆細(xì)胞中介導(dǎo)表達(dá)的EGFP熒光強度值標(biāo)準(zhǔn)誤差、CMV基因啟動子在不同單克隆細(xì)胞中介導(dǎo)表達(dá)的EGFP熒光強度值標(biāo)準(zhǔn)誤差,且OCT4基因啟動子與SOX2、CMV基因啟動子在單克隆細(xì)胞中介導(dǎo)表達(dá)的EGFP平均熒光強度比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.070、4.360,P<0.05)。結(jié)果見圖4。

圖4 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染4種質(zhì)粒載體的單克隆細(xì)胞中EGFP熒光圖Fig.4 Fluorescence images of EGFP in the monoclonal cells stably transfected with four plasmid vectors

3 討論

啟動子上的CpG島是發(fā)生DNA甲基化的主要區(qū)域,甲基化的CpG島會通過干擾轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合使其所調(diào)控的基因表達(dá)受到抑制[15-17];同時啟動子上的CpG島大多不發(fā)生甲基化,這就使帶CpG島的啟動子具有克服轉(zhuǎn)基因沉默效應(yīng)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[18-20]。研究報道,帶增強子的啟動子在不同細(xì)胞中受轉(zhuǎn)基因沉默效應(yīng)的影響差異最明顯[21-22],且OCT4基因啟動子上的增強子調(diào)控元件活性會受到細(xì)胞類型特異性DNA甲基化的影響[23]。本研究結(jié)果顯示,帶CpG島的SOX2基因啟動子介導(dǎo)的EGFP在CHO-K1細(xì)胞和HEK293細(xì)胞中表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義;這說明,啟動子上的CpG島有助于介導(dǎo)基因在不同細(xì)胞染色質(zhì)環(huán)境中的穩(wěn)定表達(dá)。而本研究結(jié)果同時顯示,OCT4、CMV和NANOG基因啟動子在CHO-K1細(xì)胞中介導(dǎo)表達(dá)的EGFP基因平均熒光強度顯著高于HEK293細(xì)胞,說明,OCT4、CMV和NANOG基因啟動子在CHO-K1細(xì)胞中表達(dá)的穩(wěn)定性更高;因此,本研究選擇CHO-K1細(xì)胞為觀察細(xì)胞。

本研究通過對含增強子和CpG島調(diào)控的啟動子介導(dǎo)表達(dá)的標(biāo)記基因EGFP在CHO-K1細(xì)胞中的表達(dá)分析,以其轉(zhuǎn)染不同時段表達(dá)量變化作為表達(dá)載體受轉(zhuǎn)基因沉默效應(yīng)影響的衡量標(biāo)準(zhǔn),結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染第20、30天,帶CpG島的SOX2基因啟動子介導(dǎo)表達(dá)的EGFP蛋白水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義,帶增強子和CpG島的CMV基因啟動子介導(dǎo)的EGFP蛋白水平有顯著差異;而帶增強子的OCT4基因啟動子介導(dǎo)的EGFP表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平差異極顯著,在翻譯水平差異也非常明顯;這說明,含CpG島的啟動子受轉(zhuǎn)基因沉默效應(yīng)的影響小,而增強子單獨作用的啟動子介導(dǎo)的EGFP表達(dá)受轉(zhuǎn)基因沉默效應(yīng)的影響較大。本研究結(jié)果顯示,CpG島和增強子共同作用在同一個啟動子上時,在EGFP翻譯表達(dá)水平上具有顯著差異,而在EGFP基因轉(zhuǎn)錄水平上差異不顯著;這說明,帶增強子和CpG島的CMV基因啟動子受轉(zhuǎn)基因沉默效應(yīng)的影響介于帶CpG島的SOX2基因啟動子和帶增強子的OCT4基因啟動子之間;相比之下,不含CpG島和增強子的NANOG基因啟動子受轉(zhuǎn)基因沉默效應(yīng)的影響與只帶CpG島的啟動子相當(dāng),提示增強子與CpG島共同作用時,存在抵消后者克服轉(zhuǎn)基因沉默效應(yīng)的現(xiàn)象;因此,推測啟動子上的CpG島可能具有較強克服轉(zhuǎn)基因沉默效應(yīng)的能力,而增強子可能會有利于轉(zhuǎn)基因沉默效應(yīng)的發(fā)生。另外,本研究結(jié)果顯示,帶增強子的OCT4基因啟動子增強基因表達(dá)的同時會使其在不同細(xì)胞環(huán)境中表達(dá)量差異顯著,同時帶CpG島和增強子的CMV基因啟動子和不含CpG島和增強子2個調(diào)節(jié)元件的NANOG基因啟動子均有顯著差異;這也說明,增強子的存在可抵消CpG島克服轉(zhuǎn)基因沉默效應(yīng)。綜上所述,啟動子上的CpG島具有克服轉(zhuǎn)基因沉默效應(yīng)的能力。

本研究結(jié)果顯示,帶CpG島的SOX2基因啟動子介導(dǎo)的EGFP蛋白表達(dá)水平與EGFP mRNA相對表達(dá)量之間具有顯著差異,且在轉(zhuǎn)錄后水平的表達(dá)遠(yuǎn)大于轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá),這可能是因為SOX2基因啟動子上的轉(zhuǎn)錄起始位點后300 bp附近的CpG島對轉(zhuǎn)錄后mRNA 5′端非翻譯區(qū)(5′untranslated region,5′UTR)區(qū)有顯著影響。研究報道,帶CpG島的啟動子在不同細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)體現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄后水平的克服轉(zhuǎn)基因沉默效應(yīng)能力,而帶增強子的啟動子克服轉(zhuǎn)錄后水平轉(zhuǎn)基因沉默的能力弱[24-27]?；虮磉_(dá)的轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控是以mRNA為中心[28],真核細(xì)胞mRNA主要通過包含了保守的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的5′UTR參與轉(zhuǎn)錄后協(xié)同調(diào)控的生物路徑影響轉(zhuǎn)錄后水平[29]。CpG島的啟動子中的5′UTR可以啟動轉(zhuǎn)錄翻譯的過程,由此間接促進(jìn)轉(zhuǎn)錄后水平表達(dá),克服轉(zhuǎn)錄后水平的轉(zhuǎn)基因沉默效應(yīng)[30]。另外,高CG的5′UTR區(qū)也可能會導(dǎo)致mRNA水平的RNA甲基化程度的增加[31]。一方面,增強子通過粘連蛋白復(fù)合物參與,再結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子能夠在空間上形成的增強子-啟動子染色質(zhì)環(huán)[32],增強子形成的染色質(zhì)環(huán)可在一定程度上調(diào)控細(xì)胞特異性基因表達(dá)。另一方面,增強子具有參與蛋白質(zhì)修飾、開放染色質(zhì)結(jié)構(gòu)等經(jīng)典表觀遺傳特征,介導(dǎo)表觀改變與轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用,可實現(xiàn)精確和動態(tài)的基因調(diào)節(jié)表達(dá)[33-34]。用同一個載體在不同單克隆中的熒光強度標(biāo)準(zhǔn)差及多個克隆群體中的表達(dá)差異,作為反映該載體在同一細(xì)胞中不同整合位置表達(dá)能力差異的評判標(biāo)準(zhǔn),以考察不同載體克服位置效應(yīng)的能力[13]。本研究結(jié)果顯示,帶增強子的OCT4基因啟動子在不同單克隆細(xì)胞中介導(dǎo)的熒光強度值和同時帶增強子和CpG島的CMV基因啟動子在不同單克隆細(xì)胞中熒光強度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義,說明OCT4和CMV基因啟動子在CHO-K1細(xì)胞中均能較好地克服位置效應(yīng)的影響;而帶CpG島調(diào)節(jié)元件的SOX2基因啟動子在不同單克隆細(xì)胞中介導(dǎo)的熒光強度值的標(biāo)準(zhǔn)誤差最大,克服位置效應(yīng)的能力最弱;由此說明,CpG和增強子共同作用在同一啟動子上時,其克服位置效應(yīng)的能力有所增強,這可能是帶增強子的啟動子能較好地克服位置效應(yīng),實現(xiàn)帶增強子的表達(dá)載體在不同單克隆細(xì)胞中較為穩(wěn)定表達(dá)的原因。

4 結(jié)論

啟動子上的CpG島能克服轉(zhuǎn)基因沉默效應(yīng),增強子能夠較好地克服位置效應(yīng)。高效穩(wěn)定表達(dá)的CMV啟動子同時帶增強子和CpG島;但CMV基因啟動子中增強子和CpG島的協(xié)調(diào)并不完美,增強子可能具有抵消CpG島克服轉(zhuǎn)基因沉默效應(yīng)的能力。因此,如何在啟動子上進(jìn)一步優(yōu)化布局,既能避免增強子對CpG島的克服轉(zhuǎn)基因沉默效應(yīng)能力的削弱,又能發(fā)揮增強子和CpG島協(xié)同增強的克服位置效應(yīng)能力,值得更深入地研究和探討。