林玲，袁夢淑，田小榮，王玉鑫，曹歡，吳龍龍，田軒，左懷文，張新如，宋紅麗（.天津醫(yī)科大學一中心臨床學院，天津 009；.南開大學醫(yī)學院，天津00074；.天津市第一中心醫(yī)院器官移植科，天津市器官移植重點實驗室，天津市器官移植臨床醫(yī)學研究中心，天津 009）

目前肝移植是治療終末期肝病的唯一有效治療手段，由于供肝的持續(xù)短缺，心臟死亡器官捐獻（donation after circulatory death，DCD）肝臟被廣泛應用于移植手術中［1］?，F(xiàn)有的靜態(tài)冷藏技術作為保存DCD 供肝的方式常導致術后并發(fā)癥的高風險和高病死率［2］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，相較于靜態(tài)冷保存，常溫機械灌注（normothermic machine perfusion，NMP）可有效緩解DCD 供肝移植過程中的缺血/再灌注損傷［3］。

急性排斥反應是影響移植預后的嚴重并發(fā)癥，免疫抑制劑的廣泛應用能夠有效預防排斥反應的發(fā)生，然而與免疫抑制相關的短期和長期風險，如感染、惡性腫瘤、心血管疾病、代謝紊亂及其他并發(fā)癥也不容忽視［4-5］。肝臟與腸道之間通過膽道、門靜脈和體循環(huán)緊密連接［6］，因此本研究在使用NMP 系統(tǒng)保存肝臟的基礎上，欲探究常用免疫抑制劑他克莫司對于肝移植急性排斥大鼠發(fā)揮保護肝臟作用時對腸道菌群的影響，為他克莫司在器官移植領域的安全合理用藥提供更充分的指導資料。

1 對象與方法

1.1 實驗材料：他克莫司（安斯泰來制藥有限公司，沈陽，中國）。雄性Lewis 大鼠12 只，7 ～8 周齡，200 ～220 g 為供體；雄性棕色挪威大鼠（brown norway，BN）大鼠18 只，8 ～9 周齡，220 ～240 g為受體，用于制備大鼠原位肝移植急性排斥反應模型。以上實驗動物由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，實驗流程遵循實驗動物倫理規(guī)定，并經(jīng)天津市第一中心醫(yī)院倫理委員會許可，批號為2016-03-A1。

1.2 建立 NMP 系統(tǒng)：根據(jù)前期研究［7］，NMP 系統(tǒng)由器官腔、膜式氧合器、蠕動泵、溫度和壓力傳感器、過濾器和熱交換器組成。灌流液總體積為80 ml，主要成分為60 ml 含20 %胎牛血清和1 %青鏈霉素混合液的DMEM /F12 培養(yǎng)液、20 ml 大鼠自體全血、肝素（5 U/ml）、地塞米松（2.5 μg/ml）和胰島素（1 U/ml）。

1.3 大鼠原位肝移植急性排斥模型建立及分組：Lewis 大鼠為供體，BN 大鼠為受體，利用“二袖套”法建立大鼠肝移植手術模型［8］，具體參考文獻［9］。實驗動物被隨機分為3 組：假手術（Sham）組、單純機械灌注（NMP）組及他克莫司（FMP）組。Sham 組大鼠僅開腹游離肝臟韌帶，不阻斷肝臟供血，30 min 后關腹。NMP 組供肝僅進行NMP。FMP 組供肝單純進行NMP，并在移植術后每天以0.1 mg/kg的劑量灌胃。每組6 只，術后14 d 收集血液、肝臟和腸道內(nèi)容物樣本進行檢測。

1.4 肝臟病理學：肝臟樣本固定24 ～48 h 后進行脫水、石蠟包埋及切片等步驟處理后進行蘇木精-伊紅 （hematoxylin and eosin，HE）染色，顯微鏡下觀察，按Banff 標準統(tǒng)計排斥活動指數(shù)（rejection activity index，RAI），評估組織病理學變化。

1.5 肝功能測定：血液樣本在室溫下進行離心機離心，3000×g，10 min 后獲得血清樣本，使用全自動生化分析儀檢測丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）和總膽紅素（total bilirubin，TBil）的水平。

1.6 糞便16 SrDNA 分析：收集大鼠回盲部腸道內(nèi)容物，立即浸入液氮凍存，隨后存放于-80℃低溫冰箱進行保存，密閉無菌便盒收集的盲腸內(nèi)容物送至北京博奧晶典生物技術有限公司行高通量測序。

1.7 統(tǒng)計學分析：采用GraphPad Prism 8.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料符合正態(tài)分布以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用成組t 檢驗或單因素方差分析，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 NMP 系統(tǒng)和大鼠原位肝移植急性排斥反應模型的建立：建立了穩(wěn)定運行的NMP 系統(tǒng)（圖1A）。術后14 d 肝臟組織HE 結(jié)果顯示：正常大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)完整，未見明顯異常（圖1B）。而急性排斥反應模型大鼠肝臟匯管區(qū)及中央靜脈內(nèi)皮細胞下有炎癥細胞浸潤（圖1C），證明急性排斥反應模型建立成功。

圖1 NMP 系統(tǒng)和急性排斥反應大鼠肝臟病理

2.2 他克莫司能夠延長DCD 肝移植大鼠的生存期：NMP 組大鼠存活時間最短，NMP 聯(lián)合術后他克莫司顯著延長了大鼠存活時間（圖2）。

圖2 他克莫司對DCD 肝移植排斥反應大鼠生存率的影響（每組n ＝5）

2.3 他克莫司能夠改善肝移植急性排斥大鼠的肝損傷：在Sham 組病理切片中，肝臟組織沒有見到淤血、壞死或者炎性表現(xiàn)（圖3A），NMP 組血竇和中央靜脈淤血表現(xiàn)明顯，炎癥細胞明顯浸潤（圖3B），F(xiàn)MP 組，肝小葉中沒有看到中央靜脈淤血或者組織壞死的情況發(fā)生（圖3C）。計算RAI 結(jié)果顯示，F(xiàn)MP 組（2.00±1.23）RAI 顯著低于NMP 組（7.60 ±1.14），差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）（圖3D）。結(jié)果表明，他克莫司治療能夠顯著改善大鼠肝移植排斥損傷模型肝臟病理。

圖3 他克莫司對DCD 肝移植排斥反應大鼠肝臟病理和肝功能的影響

與Sham 組相比，NMP 組和FMP 組血清AST、ALT 和TBil 水平均明顯上升，但FMP 組較NMP 組，上述指標顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）（圖3E ～G）。結(jié)果表明，他克莫司可以顯著降低肝移植術后肝功能水平，改善移植術后肝臟損傷的血液指標。

2.4 他克莫司對肝移植急性排斥大鼠腸道菌群的影響

2.4.1 物種組成分析：門水平物種組成分析顯示（圖4A ～B），F(xiàn)MP 組中厚壁菌門比例顯著高于NMP 組，變形菌門比例顯著低于NMP 組，差異具有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）?？扑轿锓N組成分析顯示（圖4C ～F），F(xiàn)MP 組中阿克曼菌科和毛螺菌科比例顯著高于NMP 組，梭菌科和脫硫弧菌科顯著低于NMP 組，差異具有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。

圖4 他克莫司對DCD 肝移植排斥反應大鼠腸道菌群物種組成的影響

2.4.2 多樣性分析：α 多樣性分析顯示（表1），NMP 組ACE 指 數(shù) 和Chao 指 數(shù) 均 低 于Sham 組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。與NMP 組相比，F(xiàn)MP 組Chao 指數(shù)降低，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），但兩組間ACE 指數(shù)、Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)均無顯著差異。

表1 各組間OTUs 和α 多樣性分析（±s）

表1 各組間OTUs 和α 多樣性分析（±s）

分組 OTUs Chao ACE Shannon Simpson Sham 1235.00±210.10 1440.00±209.20 1463.00±221.00 4.23±0.47 0.10±0.06 NMP 985.80±135.40 1119.00±161.70 1143.00±160.60 3.97±0.86 0.09±0.10 FMP 738.30±194.30 803.70±206.50 840.10±224.70 3.96±0.44 0.05±0.02 F 11.053 16.205 13.951 0.356 0.950 P 0.001 0.00 0.00 0.706 0.409

基于主坐標分析（principal component analysis，PCA）展示的β 多樣性分析結(jié)果顯示（圖5），F(xiàn)MP組的群落結(jié)構(gòu)不同于Sham 組和NMP 組，并且其中的主成分占總變化的39.13%和16.83%。ANOSIM相似分析證明FMP 組與其他兩組間存在顯著差異（P ＜0.05）。

圖5 他克莫司對DCD 肝移植排斥反應大鼠腸道菌群PCA分析的影響

2.4.3 功能基因在代謝途徑變化：通過重建未觀察到的狀態(tài)對群落進行系統(tǒng)發(fā)育研究（phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states，PICRUSt）分析顯示（圖6），與NMP 組相比，F(xiàn)MP 組富集其他聚糖降解和鞘脂代謝通路，而鐵載體類非核糖體肽生物合成通路的富集程度較NMP 組降低。

圖6 他克莫司對DCD 肝移植排斥反應大鼠代謝途徑的影響

3 討 論

3.1 肝移植是終末期肝病的唯一有效的治療方法10］。靜態(tài)冷保存作為DCD 供肝常用的體外保存方式被發(fā)現(xiàn)會增加供肝血流恢復后再灌注損傷的風險［11］。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，與靜態(tài)冷保存相比，NMP 在常溫下模擬機體環(huán)境，修復大鼠肝臟損傷，且在第14 天時保肝效果顯著［12］。移植后排斥反應是導致移植肝功能障礙的主要原因，嚴重影響患者術后的生存質(zhì)量和生存率，臨床上常用免疫抑制劑來預防并治療排斥反應［5］。他克莫司是一種抗T細胞藥物，是一種在移植術后廣泛使用的鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑［13］。研究發(fā)現(xiàn)，在心臟移植后他克莫司的劑量與移植后腸道菌群多樣性相互影響［14］，但是目前肝移植后他克莫司的應用與腸道菌群的關系仍無確定證據(jù)。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，他克莫司在顯著改善肝移植急性排斥反應大鼠肝損傷的同時，明顯降低了術后大鼠的腸道菌群豐度，也對術后大鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)造成了一定的影響。毛螺菌科屬于厚壁菌門的梭菌簇X Ⅳa，研究發(fā)現(xiàn)，它能夠水解淀粉和其他糖類以產(chǎn)生丁酸鹽和短鏈脂肪酸，影響健康功能［15］。阿克曼菌科屬于疣微菌門，研究發(fā)現(xiàn)，它對葡萄糖代謝和腸道通透性具有有益作用［16］。脫硫弧菌被認為是一種機會性病原體，它產(chǎn)生內(nèi)毒素并具有將硫酸鹽還原為硫化氫的能力，從而破壞腸道屏障［17］。而我們的研究發(fā)現(xiàn)，他克莫司能夠促進排斥反應后毛螺菌科和阿克曼菌科的比例升高，并且逆轉(zhuǎn)排斥反應后脫硫弧菌比例的升高。

本研究發(fā)現(xiàn)應用他克莫司后大鼠富集鞘脂代謝通路。鞘脂是在神經(jīng)系統(tǒng)中高度富集的一類脂質(zhì)，主要的生物活性鞘脂包括神經(jīng)酰胺、神經(jīng)酰胺1-磷酸酯、葡糖基神經(jīng)酰胺、鞘氨醇和1-磷酸鞘氨醇，其中神經(jīng)酰胺通常抑制細胞增殖并促進凋亡，而1-磷酸鞘氨醇刺激生長并抑制凋亡，具有極大的復雜性和多樣性［18-19］。目前，鞘脂代謝途徑已成為治療糖尿病、多發(fā)性硬化癥和白血病等疾病的生物活性藥物開發(fā)的重要目標［20］。但是目前還沒有針對他克莫司與鞘脂代謝相關性的研究?？傊?，我們的研究發(fā)現(xiàn)他克莫司可以調(diào)節(jié)肝移植術后大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)和代謝途徑，這為我們提供了一種新的思路，如通過檢測腸道菌群來監(jiān)控肝移植術后免疫抑制劑劑量、血藥濃度、使用時間及療效等對患者的影響，為肝移植技術后接受免疫抑制劑治療的患者病情評估提供了新的檢測策略。