楊 栩，陳弘麗

（廣東省中山生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)站，廣東 中山 528400）

抗生素是一類(lèi)由微生物或高等動(dòng)植物在生活過(guò)程中所產(chǎn)生的具有抗病原體或其他活性的即次級(jí)代謝產(chǎn)物，能干擾其他生活細(xì)胞發(fā)育功能的化學(xué)物質(zhì)[1]。作為一種消炎藥物被廣泛應(yīng)用于各種病痛的治療當(dāng)中，但是抗生素被濫用的危害也是顯而易見(jiàn)的。近20 年來(lái)，中國(guó)的湖泊被報(bào)道檢測(cè)出有39 種抗生素，其主要類(lèi)型為磺胺類(lèi)、喹諾酮類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、大環(huán)類(lèi)脂類(lèi)以及β-內(nèi)酰胺類(lèi)等[2]。其中，單一磺胺類(lèi)抗生素的質(zhì)量濃度最高達(dá)940 ng/L，是檢出濃度最高的種類(lèi)之一，而單一喹諾酮類(lèi)抗生素濃度最高可達(dá)713 ng/L[2]。正是因?yàn)閷?duì)環(huán)境持續(xù)輸入，抗生素對(duì)生態(tài)環(huán)境帶來(lái)危害，同時(shí)通過(guò)物質(zhì)與能量循環(huán)，對(duì)人體健康產(chǎn)生影響。因此，提升抗生素的檢測(cè)分析技術(shù)有助于在“環(huán)境-生物-人類(lèi)”系統(tǒng)中了解抗生素在各要素間的相互聯(lián)系和作用，對(duì)環(huán)境中抗生素的痕量分析、溯源追蹤和循環(huán)流動(dòng)，為后續(xù)抗生素的處理和有效使用有著積極的指導(dǎo)意義。

1 抗生素前處理分析研究發(fā)展現(xiàn)狀

我國(guó)目前還沒(méi)有建立適用于水中多組分抗生素的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)已有的檢測(cè)技術(shù)大部分暫時(shí)不能實(shí)現(xiàn)多種類(lèi)型抗生素的同時(shí)檢測(cè)，導(dǎo)致檢測(cè)耗時(shí)較長(zhǎng)、操作過(guò)程繁瑣[3]。經(jīng)過(guò)多年的技術(shù)發(fā)展，UPLC-MS/MS技術(shù)可對(duì)復(fù)雜的樣品進(jìn)行快速分析，準(zhǔn)確定性、定量目標(biāo)化合物，顯著提高信噪比和靈敏度[4]，目前已經(jīng)成為抗生素檢測(cè)與研究最常用的分析儀器技術(shù)。根據(jù)大量研究抗生素分析的文獻(xiàn)顯示，固相萃取法作為抗生素分析的預(yù)處理方法最為普遍[5]。然而較少文獻(xiàn)對(duì)預(yù)處理方法優(yōu)化進(jìn)行深入研究，部分已有研究成果在適用種類(lèi)或目標(biāo)物數(shù)量方面具有局限性，主要集中在過(guò)濾條件、淋洗液種類(lèi)及比例用量和干燥時(shí)長(zhǎng)[6]這幾個(gè)因素，鮮有文獻(xiàn)在不同pH 值的水樣條件下探討不同種類(lèi)抗生素的預(yù)處理效果，而縱觀多數(shù)文獻(xiàn)對(duì)各自地方河流或其他載體進(jìn)行抗生素污染空間分布特征和環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估等研究時(shí)，采用的都是酸性條件下的水樣，但并沒(méi)有在其他條件下和種類(lèi)數(shù)量上進(jìn)行更深入的探討，而且同類(lèi)抗生素中回收率高的目標(biāo)物數(shù)量并不多[7]。

本文主要考慮在5 種不同pH 值和添加不同濃度EDTA 的水樣條件下，對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素、磺胺類(lèi)抗生素和喹諾酮類(lèi)抗生素部分目標(biāo)物回收率的影響。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 主要儀器和試劑耗材

主要儀器：液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，LC-30AD Triple Quad 4500；色譜柱，島津XRD-ODS，100 mm×2.0 mm；全自動(dòng)固相萃取儀，GL Sciences 799；氮吹濃縮儀，TurboVapⅡ；棕色采樣瓶（2 500 mL，棕色磨口硬質(zhì)玻璃瓶）；其他一些實(shí)驗(yàn)室常用儀器和設(shè)備。

主要試劑、耗材：甲醇，色譜純；乙腈，色譜純；甲酸，色譜純；鹽酸，分析純；氨水，分析純；EDTA，分析純；無(wú)水硫酸鈉，分析純；標(biāo)準(zhǔn)溶液、固相萃取柱（HLB，200 mg，6 mL）和濾膜（0.22 μm）。

2.2 高效液相色譜儀器條件（表1）

流動(dòng)相A：水相（0.1%甲酸）；流動(dòng)相B：乙腈（0.1%甲酸）；洗針液：甲醇喝水（1∶1）混合。梯度洗脫程序見(jiàn)表1：流速0.4 mL/min；柱溫，40 ℃；進(jìn)樣體積，10 μL。

2.3 水樣預(yù)處理?xiàng)l件（固相萃取條件）

分別取5 組共10 個(gè)1 000 mL 水樣，分別加入10 μg 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，通過(guò)氨水或鹽酸分別按照pH 值為2、4、7、9 和12 的范圍調(diào)節(jié)水樣的酸堿性，及同一pH值條件加入不同量的EDTA 進(jìn)行研究。HLB 固相萃取柱安裝在全自動(dòng)固相萃取儀上，設(shè)置參數(shù)10 mL 甲醇5 mL/min 流速活化。將上述水樣以15 mL/min 的流速上樣，抽干固相萃取柱，加入10 mL 純水淋洗兩次，最后吹干柱子。用2 mL 甲醇3 mL/min 的流速洗脫。收集洗脫溶液后，再通過(guò)無(wú)水硫酸鈉脫水，在氮吹濃縮儀上濃縮至1 mL，水浴溫度為40 ℃，氮吹流量調(diào)至液面輕微晃動(dòng)，用0.22 μm 濾膜過(guò)濾，待測(cè)。每一個(gè)同等條件的水樣全程序重復(fù)測(cè)定6 次，計(jì)算每種條件下的平均回收率。

2.4 曲線的建立

移取適量的抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制至少7 個(gè)濃度點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)系列，各組分質(zhì)量濃度分別為2.50、6.25、12.5、25.0、62.5、100、125 μg/L。按照儀器條件，由低濃度到高濃度依次對(duì)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)行測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中的目標(biāo)組分的質(zhì)量濃度（μg/L）為橫坐標(biāo)，以其對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3 結(jié)果與討論

化合物在不同條件下的平均回收率見(jiàn)表2。由表2可知，pH 值對(duì)這三類(lèi)抗生素的形態(tài)和作用有顯著性影響，而EDTA 的添加對(duì)各化合物的影響有特別顯著的規(guī)律性。大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素有8 種化合物在pH=4條件下加標(biāo)回收率在80.0%～112%；磺胺類(lèi)抗生素在pH=4 條件下均有良好的回收率（80.9%～107%）；喹諾酮類(lèi)抗生素在pH=12 條件下有著良好的回收率（84.4%～112%），三類(lèi)抗生素添加EDTA的回收率更佳。

表2 各化合物在不同條件下的平均回收率 %

4 結(jié)論

在5 種不同pH 值和是否添加EDTA 試劑的水樣條件下，對(duì)8 種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素、16 種磺胺類(lèi)抗生素和9 種喹諾酮類(lèi)抗生素采用固相萃取-HPLC 法進(jìn)行加標(biāo)回收率的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析，大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素和磺胺類(lèi)抗生素在酸性（pH=4）條件下可以獲得較好的回收率，喹諾酮類(lèi)抗生素在堿性（pH=12）條件下可以獲得較好的回收率，而對(duì)于三類(lèi)抗生素物質(zhì)，EDTA 的添加對(duì)目標(biāo)物回收率更佳。對(duì)不同種類(lèi)的抗生素目標(biāo)物進(jìn)行前處理技術(shù)的探索和優(yōu)化有助于促進(jìn)抗生素檢測(cè)分析技術(shù)的發(fā)展，有效提高水中抗生素分析的準(zhǔn)確性，同時(shí)抗生素檢測(cè)分析方法可以應(yīng)用于區(qū)域水域的抗生素生態(tài)毒性和健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，對(duì)于未來(lái)更好建立和完善水系抗生素檢測(cè)分析技術(shù)方法和標(biāo)準(zhǔn)具有積極的意義。