胡嘉嘉 盧惠 黎業(yè)娟 阮海玲 趙立強 王安國 萬邦貝 鐘靜靜 盧偉英

近年中國育齡人群不孕不育發(fā)生率已上升至10%～15%,男性不育占其中的30%～40%[1]。在輔助生殖技術(shù)治療過程中,精子的體外優(yōu)化處理是輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology,ART)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一,其目的是為了從精液中篩選出活力、形態(tài)、受精潛能最優(yōu)的精子用于體外受精,而精子處理方法的選擇取決于精液標(biāo)本的質(zhì)量。常規(guī)精液處理方法有密度梯度離心法、直接上游法和洗滌法等,各種方法都有其優(yōu)缺點。目前國內(nèi)多數(shù)生殖中心實驗室使用密度梯度離心和上游法優(yōu)化精子,其過程包括數(shù)次的離心與洗滌操作。研究報道[2]精子離心是機(jī)械性的剪切力,可引起精子蛋白質(zhì)組學(xué)以及基因組水平的改變,甚至?xí)?dǎo)致嚴(yán)重的精子功能障礙。而DNA甲基化的異?？赡軙绊懙胶罄m(xù)胚胎的發(fā)育,從而影響體外受精與胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)的最終臨床結(jié)局[4]。

精子浮游器上游法優(yōu)選精子的過程是模擬體內(nèi)精子的自然篩選過程,不經(jīng)歷密度梯度、離心和洗滌等過程,直接富集最優(yōu)的精子用于體外受精[3]。目前國內(nèi)對該產(chǎn)品的使用報道較少。因此為了解浮游器上游法與本中心主流使用的密度梯度結(jié)合上游法優(yōu)化精子后對胚胎發(fā)育的影響,本文比較密度梯度離心結(jié)合上游法和浮游器上游法對體外受精—胚胎移植中受精及胚胎發(fā)育的影響,旨在為輔助生殖實驗室精液優(yōu)化技術(shù)方法應(yīng)用提供依據(jù)。

對象與方法

一、研究對象

回顧性分析2021年3月—2022年2月在海南省婦女兒童醫(yī)學(xué)中心生殖醫(yī)學(xué)中心行IVF/ICSI治療周期的夫婦病例402/157對。包括男性因素、女性因素、混合因素和發(fā)病原因不明的不孕不育。納入標(biāo)準(zhǔn)：IVF適應(yīng)證：(1)女方包括盆腔及輸卵管因素、排卵障礙、子宮內(nèi)膜異位癥、多囊卵巢綜合征等;(2)男方禁欲3 d ～ 5 d后取卵日手淫采集的精液,精液量≥1 mL,濃度>15×106/mL。ICSI適應(yīng)證：(1)不明原因的前次IVF受精失敗或受精率小于30%等;(2)男方精液量≥1 mL,濃度>15×106/mL或輕度弱精子癥。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)女方獲卵數(shù)<5個,年齡40歲以上;排除各種嚴(yán)重的內(nèi)科合并癥的病例;(2)男方重度少弱精子癥患者;(3)附睪、睪丸穿刺取精患者;(4)逆行射精;(5)供精、供卵。

二、研究方法

1.密度梯度離心結(jié)合上游法優(yōu)選精子：精液由患者本人于取卵日手淫法獲取。精液液化后1h之內(nèi)處理精液,記錄精子濃度、精子活力(率)、精液體積和液化時間等。在錐形離心管底加入0.5 mL 45%的Sperm Grad液,而后在其下0.5 mL 90%的Sperm Grad液,使兩液交界處見明顯分層,然后將精液輕輕加在梯度液的上面,415 g(1 500 r/min)離心20 min后去掉上清。沉淀物用1.5 mL Sperm Rinse懸浮300 g離心5 min后去上清,視精子沉淀情況加入1 mL左右精子洗滌液,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中上游40 min。最后輕輕吸取上游液至新的小試管中用于卵子受精。

2.精子浮游器上游法優(yōu)選精子：待精液完全液化后處理精液,記錄精子濃度、精子活力(率)、精液體積和液化時間等。吸取1mL左右Sperm Rinse加至已標(biāo)記有夫妻雙方姓名浮游管底部,然后吸取1 mL已吹打均勻液化的精液輕輕加到精子洗滌液底部,上層液面剛好超過粉紅色的浮游通孔的上緣,使凹槽內(nèi)充滿液體,置于45°傾角的試管架內(nèi),放置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中上游40 min。最后輕輕吸取凹槽中的精子至新的試管中用于卵子受精。

3. 控制性超排卵以及卵母細(xì)胞收集：嚴(yán)格按照本科室制定的人類輔助生殖臨床技術(shù)操作規(guī)程進(jìn)行控制性超促排卵,待優(yōu)勢卵泡直徑超過18 mm時,予以人絨毛膜促性腺激素肌注,并于34～36 h行陰道超聲引導(dǎo)下取卵術(shù)并收集卵母細(xì)胞。

4. 胚胎培養(yǎng)：取卵后3～5 h(夜針后39～41 h)進(jìn)行IVF/ICSI授精,IVF授精的PR精子的濃度為10萬～15萬條/mL,ICSI操作為在顯微鏡下挑選活力好、形態(tài)正常的精子進(jìn)行卵子注射。根據(jù)本中心制定的胚胎評分標(biāo)準(zhǔn)對胚胎進(jìn)行詳細(xì)評分,以本院患者實際情況隨后選取1～2個優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行移植或者選擇全胚冷凍處理。

5. 試劑與耗材：SpermGrad、SpermRinse、G-IVF Plus、G1、G2等胚胎培養(yǎng)液均為瑞典Vitrolife 公司產(chǎn)品;輔助生殖用精子浮游器的制作材料是聚丙烯,由15 mL的圓底試管和內(nèi)部的浮游通孔組成,浮游通孔直徑6 mm,通孔外圍是凹槽。詳見圖1。

1-Upstream pipe lid;2-Upstream pipe;3-Floating through the hole;4-Card position line圖1 輔助生殖用精子浮游管示意圖Figure 1 Schematic of sperm swimming trapper for assisted reproduction

6. 觀察指標(biāo)：受精率=(2PN卵子數(shù)+1PN卵子數(shù)+多PN卵子數(shù)+0PN卵裂卵子數(shù))/加精卵子數(shù)×100%;卵裂率=卵裂胚胎數(shù)/受精卵子數(shù)×100%;優(yōu)質(zhì)胚胎率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/正常受精卵裂胚胎數(shù)×100%;囊胚形成率=II期及II期以上囊胚數(shù)/行囊胚培養(yǎng)卵裂期胚胎總數(shù)×100%;可利用囊胚率=可利用囊胚數(shù)/II期及II期以上囊胚數(shù)×100%。

結(jié) 果

一、密度梯度離心結(jié)合上游法與浮游器上游法的一般數(shù)據(jù)比較

經(jīng)過篩選IVF周期共有398對夫婦,ICSI周期共有157對夫婦納入研究,根據(jù)不同精子優(yōu)化處理方法分為密度梯度離心結(jié)合上游法(IVF周期：n=276;ICSI周期：n=79)和浮游器上游法(IVF周期：n=126;ICSI周期：n=78)。

IVF/ICSI周期密度梯度離心結(jié)合上游法組和浮游器上游法組在女方平均年齡、男方平均年齡、不孕年限、體質(zhì)指數(shù)、基礎(chǔ)FSH、基礎(chǔ)LH、基礎(chǔ)E2等均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表1～2。

表1 兩組患者的基本情況和促排卵情況Table 1 Basic information, ovulation induction and other index of two

表2 兩組患者的基本情況和促排卵情況Table 2 Basic information, ovulation induction and other index of two

二、兩組常規(guī)精液檢查相關(guān)參數(shù)比較

IVF方案精液處理前后密度梯度離心結(jié)合上游法組和浮游器上游法組男方精子濃度、活率、前向運動精子、回收率的比例差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。ICSI方案因行單精子顯微注射,需選擇形態(tài)正常、活動力高的優(yōu)質(zhì)精子進(jìn)行受精,兩組入組的篩選標(biāo)準(zhǔn)中存在弱精子癥的病例,處理前兩組的精子活力之間存在差異,而精液處理后兩組精子濃度、活率、回收率的比例差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3～4。

表3 兩組精子參數(shù)處理前后比較Table 3 Comparison of sperm parameters before and after treatment in the two

表4 兩組精子參數(shù)處理前后比較Table 4 Comparison of sperm parameters before and after treatment in the two

三、不同精子處理方法對卵子受精及胚胎發(fā)育結(jié)局的影響

IVF/ICSI周期密度梯度離心結(jié)合上游法組和浮游器上游法組平均獲卵數(shù)、成熟卵子數(shù)、受精率、卵裂率、正常卵裂率、囊胚形成率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在IVF周期,浮游器上游法組的雙原核受精率顯著高于密度梯度離心結(jié)合上游法組(72.2±19.9)% vs(68.0±18.0)%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。浮游器上游法組多PN受精率顯著低于密度梯度離心結(jié)合上游法組(5.3±9.1)% vs(7.4±9.9)%,浮游器上游法組優(yōu)質(zhì)囊胚率顯著高于密度梯度離心結(jié)合上游法組(62.6±33.0)% vs(53.2 ±34.0)%,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。ICSI周期浮游器上游法組D3優(yōu)質(zhì)胚胎率顯著高于密度梯度離心結(jié)合上游法組(38.0±27.7)% vs(28.2±25.3)%,浮游器上游法組優(yōu)質(zhì)囊胚率顯著高于密度梯度離心結(jié)合上游法組(52.6±37.0)% vs(40.2±38.3)%,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

表5 兩組之間各種指標(biāo)的比較Table5 Comparison of the various indicators between the two

討 論

本研究采用的精子浮游器上游法優(yōu)選精子的過程是模擬體內(nèi)精子的自然篩選過程,與常規(guī)的直接上游法不同,其內(nèi)部結(jié)構(gòu)是一個特制的塑料管,不經(jīng)歷密度梯度離心和洗滌等步驟,減少對精子的損害,對比密度梯度離心法,所需時間短,篩選精液中既能克服重力又能跨過浮游通孔的上緣進(jìn)人凹槽的精子用于IVF和ICSI受精。

IVF過程是人工將大量精子直接與卵母細(xì)胞在體外共同孵育完成體外受精,此過程對精子的自然選擇是有限的,而卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)(ICSI)則是將單個精子直接注入卵胞質(zhì)內(nèi),因此該過程對精子的選擇尤為重要,通常需要盡量多地選擇形態(tài)正常、活動力高的優(yōu)質(zhì)精子進(jìn)行受精[5]。目前國內(nèi)大多數(shù)生殖中心的精液優(yōu)化處理方法主要是密度梯度離心法和直接上游法。直接上游法主要用于精液質(zhì)量較好的和相對正常的精液,依賴于活動精子在培養(yǎng)液中的運動能力。本研究中采用的浮游器上游法與傳統(tǒng)的上游法相似,但是所用耗材及步驟有所不同。傳統(tǒng)的上游法多采用小試管或錐形管加入精液上游后一段時間收集精子或收集后大多還需經(jīng)過離心洗滌,精漿與培養(yǎng)液的接觸面積較大,而有些還需經(jīng)過再沉淀的過程。本研究采用的精子浮游器,避免了傳統(tǒng)上游法的缺點,該浮游器通孔外圍是凹槽,精液中活力好的精子通過浮游通孔上游到凹槽中,無需再次沉淀過程,同時減少精液液化后的精漿接觸培養(yǎng)液可能引起的精子損傷及污染。

密度梯度離心法能較好地分離精子和其他細(xì)胞及碎片,可以去除精漿、不活動精子、畸形精子、細(xì)胞碎片及其他有害的物質(zhì),從而回收更多形態(tài)正常的精子[6],特別適用于少精子癥、畸精子癥、弱精子癥或者冷凍復(fù)蘇后的精液,能提高精子的回收率[7]。但梯度離心法步驟需要經(jīng)過數(shù)次的離心和洗滌操作,其中難免有可能對精子產(chǎn)生物理損傷。浮游法不同于直接上游法和密度梯度法,其處理過程不需要離心和數(shù)次洗滌。研究發(fā)現(xiàn)精子離心是機(jī)械性的剪切力,多次反復(fù)離心可致脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生,引起的活性氧增強非特異性滲透離子,也抑制膜受體和酶的作用,甚至都會導(dǎo)致嚴(yán)重的精子功能障礙,進(jìn)而可能會影響卵子受精[2]。本研究中兩種精液優(yōu)化方法處理之后精子的回收率無統(tǒng)計學(xué)差異,精子與卵子受精后兩組之間受精率差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義,提示梯度離心和浮游器優(yōu)選的精子對于卵子的受精能力影響不大,精子仍具有使卵子受精的能力。精子的質(zhì)膜是最容易損傷的部位,功能完整的質(zhì)膜是精子能夠進(jìn)行新陳代謝,完成獲能和頂體反應(yīng)以及與透明帶結(jié)合并穿過透明帶的基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)密度梯度離心法處理后部分精子會表現(xiàn)為精子質(zhì)膜和頂體外膜的損傷,精子尾部中段的損傷為線粒體和中心粒細(xì)胞器的損傷,但研究并未表現(xiàn)為中段的丟失[3],提示了一定程度的精子質(zhì)膜和頂體外膜的腫脹和破裂。只要頂體內(nèi)膜和尾部中段未丟失,精子仍具有使卵子受精的能力,因此對受精的影響并不明顯,但可能對后續(xù)胚胎發(fā)育造成影響[8]。

近年研究認(rèn)為精子DNA碎片是影響胚胎質(zhì)量的重要因素之一。研究報道梯度離心可能會損害精子DNA的完整性,尤其是在運動能力和形態(tài)受損的不育男性的精液樣本中,這些樣本產(chǎn)生高病理活性氧水平(因為精子形態(tài)異常),并且總抗氧化能力低于正常男性的精漿[4,19]。含有DNA碎片的精子可能具有使卵子受精的能力,但當(dāng)精子DNA損傷超過一定閾值時,會干擾正常受精和早期胚胎發(fā)育會造成影響,引起胚胎發(fā)育減慢,導(dǎo)致妊娠丟失[9]。處理過程中多次的離心操作會對精子的細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成損傷,精子的質(zhì)膜是最容易損傷的部位,精子單位膜完整性遭到破壞將會影響精子正常的新陳代謝、受精、卵裂和后續(xù)胚胎發(fā)育[10-12]。本研究比較在IVF和ICSI周期兩組精子優(yōu)化處理后對后續(xù)胚胎發(fā)育的情況,結(jié)果顯示在IVF周期浮游器上游法組的雙原核受精率顯著高于密度梯度離心結(jié)合上游法組,浮游器上游法組的多PN受精率極顯著低于密度梯度離心結(jié)合上游法組,浮游器上游法組的優(yōu)質(zhì)囊胚率極顯著高于密度梯度離心結(jié)合上游法組。ICSI周期浮游器上游法組的D3優(yōu)質(zhì)胚胎率、優(yōu)質(zhì)囊胚率也明顯高于密度梯度離心結(jié)合上游法組。但I(xiàn)VF/ICSI卵裂率、正常卵裂率、囊胚形成率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究與曹曉敏等的研究結(jié)果相符,以上結(jié)果再次驗證使用浮游器精子優(yōu)化方法獲得的胚胎具有較好的發(fā)育潛能,明顯提高優(yōu)質(zhì)胚胎率。推測原因為對比密度梯度離心法,浮游組的精子未經(jīng)過梯度離心,對精子的物理損傷小,降低精子DNA碎片,提高了精子質(zhì)量,最后獲取的高質(zhì)量的精子用于體外受精。過多的精子DNA損傷被認(rèn)為會影響IVF受精率以及之后的胚胎發(fā)育[13]。Palini等的研究也顯示浮游法可獲得更高的優(yōu)質(zhì)胚胎率和妊娠率[14]。文獻(xiàn)報道早期胚胎發(fā)育潛能對于妊娠的維持至關(guān)重要,胚胎發(fā)育不良會導(dǎo)致自然流產(chǎn)的增加[15],尤其是早期的妊娠丟失,表現(xiàn)為生化妊娠[13,16]。本研究發(fā)現(xiàn)尤其在囊胚發(fā)育階段,顯著增加優(yōu)質(zhì)囊胚率。精子質(zhì)量對胚胎基因組的貢獻(xiàn)非常大,尤其影響囊胚的發(fā)育[17]。囊胚移植的高種植率和活產(chǎn)率使得醫(yī)生和患者更愿意選擇單胚胎移植,在累積妊娠率不降低的情況下,極大地降低了多胎率和多胎帶來的孕期和圍產(chǎn)期的風(fēng)險[17-18]。

綜上所述,本文對比了密度梯度離心結(jié)合上游法和采用精子浮游器上游法分選精子后的受精及胚胎發(fā)育的區(qū)別。結(jié)果顯示浮游器上游法可獲得較高的正常受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率和優(yōu)質(zhì)囊胚率。試管嬰兒的最終目的是孕育健康的胎兒,而這個需要獲得更多高質(zhì)量的正常胚胎,浮游器的使用在一定程度上提高了本中心雙原核來源的胚胎,降低了多精受精的胚胎以及獲得較高質(zhì)量的胚胎,有助于進(jìn)一步提高試管嬰兒的成功率。同時通過使用該方法,還可以減少成本和錯配錯誤,該方法簡化了常規(guī)精液處理的操作步驟,處理所需時間明顯縮短,方便快捷自然。但目前該浮游器的使用數(shù)據(jù)報道較少,希望后續(xù)有更多的研究總結(jié),尤其浮游器上游法精子DNA的完整性。