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        青稞麥麩γ-氨基丁酸的制備條件優(yōu)化

        2023-08-18 14:49:04張紫晉蒲鄧佳
        中國食品學報 2023年7期
        關鍵詞:谷氨酸鈉脫皮麥麩

        江 迪,張紫晉,楊 婷,2,趙 爽,4,彭 君,蒲鄧佳,2,陳 靜*

        (1 中國科學院成都生物研究所 成都 610041 2 四川農(nóng)業(yè)大學 四川雅安 625014 3 西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所 拉薩 850000 4 云南農(nóng)業(yè)大學 昆明 650500)

        γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyricacid,GABA)是一種廣泛分布于動、植物和微生物中的非蛋白質氨基酸[1],是存在于哺乳動物腦、脊髓中的一種重要的抑制性神經(jīng)傳遞物質[2],具有降血壓[3-4],抗抑郁[5-6],增強腦功能[7-8]等生理活性,在功能性食品領域有著巨大的應用前景[9]。GABA 主要由谷氨酸經(jīng)谷氨酸脫羧酶(Glutamate decarboxylase,GAD)催化轉化而來[10],其制備方法主要有化學合成法和生物合成法兩大類[11]?;瘜W合成法雖然反應速度快,得率高,但是副反應多,有化學物質殘留,不符合現(xiàn)代工業(yè)綠色環(huán)保的發(fā)展理念[12]。生物合成法又分為微生物轉化法和植物富集法[13],其原理是利用微生物與植物中的內源GAD 將谷氨酸(Glu)及其鈉鹽轉化成GABA。微生物轉化存在高效菌株難獲得,發(fā)酵液成分復雜,生產(chǎn)的GABA 需進一步純化等問題[14]。常見的植物富集法,如利用大豆[15]、水稻[16]等谷物籽粒進行發(fā)芽或發(fā)酵處理富集GABA,則存在得率低,操作步驟多,pH 調控嚴等不同程度的局限性,不能滿足食品工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)的需要。

        近年來,全球對營養(yǎng)健康功能食品和保健品的需求持續(xù)增加,探索低成本、環(huán)境友好、食物源的GABA 高效富集方法十分重要[17]。到目前為止,國內外利用米糠[18]、玉米胚芽[19]等農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物轉化GABA 的研究較多,然而,利用麥麩制備GABA 的報道較少。廖周華等[20]以脫脂小麥麥麩為原料,通過正交試驗優(yōu)化富集工藝得到的GABA 產(chǎn)量為3.81 mg/g(4 mmol/L)。Jin 等[21]和Limure 等[22]以裸大麥麥麩為原料,通過對外源添加谷氨酸鈉和輔酶以及反應條件的單因素優(yōu)化,GABA 生成量達到11 mmol/L,轉化率為92%。青藏高原裸大麥(亦稱青稞)是栽培大麥的一個變種,也是種植面積最大的高原糧食作物[23]。本試驗通過對青稞品種選擇、麩皮分級制備方法和GABA 合成工藝優(yōu)化等研究,建立一種利用青稞麩皮制備GABA 的安全、高效的方法,從而為高附加值GABA 功能食品和保健品生產(chǎn)提供可靠的原料生產(chǎn)途徑,以提高農(nóng)業(yè)資源的利用率和種植效益。

        1 材料與方法

        1.1 材料、試劑與儀器

        供試材料:15 份青稞品種,種植于四川什邡,常規(guī)田間管理,收獲成熟籽粒用于后續(xù)研究。

        主要試劑:GABA 標準品,上海麥克林生化科技有限公司;谷氨酸鈉、磷酸吡哆醛,上海源葉生物科技有限公司;硼酸、四硼酸鈉、苯酚、次氯酸鈉、無水乙醇、鹽酸,成都海鴻實驗儀器有限公司。本試驗使用的化學藥品均為分析純級。

        主要儀器與設備:SCIENTZ 高通量組織研磨器,寧波新芝生物科技股份有限公司;IS-RDV1/IS-RSV1 立式恒溫振蕩器,美國精騏有限公司;AS220.X2 分析天平,波蘭RADWAG 公司;Thermo Fisher 全波長掃描式多功能讀數(shù)儀,美國賽默飛世爾公司;L4-6K 臺式低速離心機,湖南可成儀器設備有限公司;HWS24 電熱恒溫水浴鍋,上海一恒科技有限公司。

        1.2 試驗方法

        1.2.1 原料制備 委托當?shù)孛娣奂庸S采用常規(guī)磨粉方法獲得供試品種的商品麥麩。通過不同程度碾壓進行麥麩分級制備,具體做法為:清除種子中的石子、泥塊等雜質,快速清洗、烘干后,稱取6份青稞倒入脫皮機,采用常規(guī)碾米工序,通過設定脫皮循環(huán)次數(shù)得到不同的脫皮率,出料口收集并稱量青稞麥麩,計算脫皮率(%)=(青稞麩皮質量/青稞質量)×100。采用組織研磨器粉碎麥麩,過80目篩,備用。

        1.2.2 繪制GABA 標準曲線 準確稱取GABA標準品100 mg,用蒸餾水溶解并定容到100 mL,配制成1 mg/mL 的標準液。準確吸取0,0.05,0.10,0.15,0.20,0.25 mL 的1 mg/mL 的GABA 標準液于帶蓋的10 mL 離心管中,分別加入蒸餾水1,0.95,0.90,0.85,0.80,0.75 mL,得到不同濃度的GABA標準溶液。

        采用Berthelot 比色法[24]對不同濃度的標準GABA 溶液進行處理,依次加入0.2 mol/L(pH 9.0)硼酸鹽緩沖液0.6 mL,5%苯酚溶液2 mL,7%次氯酸鈉溶液1 mL 混勻后,立即放入沸水浴加熱13 min,冰浴冷卻5 min,最后加入60%乙醇2 mL搖勻,然后在波長645 nm 處測定溶液的吸光度。以吸光度為橫坐標,GABA 濃度為縱坐標,繪制標準曲線。

        1.2.3 GABA 產(chǎn)量及GAD 酶活力測定 GABA富集參考Jin 等[21]的方法,略有改動。具體操作步驟為:按照140∶1(g/L)的料液比,在180 r/min,30℃條件下振蕩培養(yǎng)8 h。反應結束后3 800×g 離心15 min,取上清液1 mL 測定GABA 含量。GABA測量方法同1.2.2 節(jié)。利用繪制的標準曲線計算樣品GABA 含量。

        GAD 酶活力測定參考呂瑩果[25]的方法,略有改動。具體操作步驟為:稱取1 g 麥麩到三角瓶中,加入質量濃度為10 g/L 的谷氨酸鈉底物溶液40 mL,在pH 5.7,40 ℃反應2 h,90 ℃加熱5 min滅酶活,3 800×g 離心5 min,取上清測定產(chǎn)物GABA 含量,GABA 測量方法同1.2.2 節(jié)。以每30 min生成1 μmol 的GABA 作為一個酶活力單位。

        1.2.4 GABA 合成工藝的單因素實驗及正交試驗分別考察pH 值(5.7,7)、料液比(60∶1,80∶1,100∶1,120∶1,140∶1,g/L)、反應時間(4,8,12,16,20 h)、反應溫度(25,30,35,40,45 ℃)、磷酸吡哆醛濃度(0,10,20,30 μmol/L)、谷氨酸鈉濃度(0,3,6,8,10 mmol/L)對青稞麩皮制備GABA 的影響。根據(jù)單因素實驗結果,設計正交試驗。試驗因素與水平見表1。

        表1 因素水平表Table 1 Factors and levels of the test

        1.3 數(shù)據(jù)處理方法

        試驗設置3 次重復。采用軟件SPSS 25.0 進行顯著性檢驗及方差分析。

        2 結果與分析

        2.1 標準曲線的建立

        圖1 為繪制的GABA 標準曲線,在波長645 nm 處的吸光值與GABA 質量濃度具有良好的線性關系:y=0.0955x-0.00009,回歸系數(shù)R2=0.9994,RSD=1.8%,可以作為后續(xù)計算樣品GABA 含量的參照標準曲線。

        圖1 GABA 標準曲線Fig.1 The standard curve of GABA content

        2.2 青稞麥麩GAD 活性及GABA 產(chǎn)量分析

        青稞屬于高蛋白、低脂作物,其籽粒谷氨酸含量明顯高于其它氨基酸組分[26],基于前期對不同青稞品種籽粒GABA 含量的鑒定,選擇15 個品種的商品麥麩進行GABA 富集的比較試驗。從圖2可以看出,利用不同青稞品種富集的GABA 產(chǎn)量存在顯著差異,GABA 平均產(chǎn)量為5.29 mmol/L,變化范圍為4.10~7.27 mmol/L,其中ZJ5 的GABA 生成量最高為7.27 mmol/L。GAD 是GABA 代謝通路中的限速酶,進一步分析發(fā)現(xiàn),品種間GAD 酶活水平差異顯著,GAD 酶活力平均為6.18 U,變化范圍為4.33~9.91 U,且不同品種GABA 生成量與GAD 活性呈極顯著正相關(r=0.988),表明品種間內源GAD 酶活性差異可能是GABA 產(chǎn)量不同的主要原因。因此,選擇品種ZJ5 的商品麥麩作為GABA 富集方法優(yōu)化的原料。

        圖2 不同青稞品種富集的GABA 產(chǎn)量及GAD 酶活力Fig.2 GABA yield and GAD activity of different highland barley varieties

        2.3 利用青稞麩皮富集GABA 的單因素實驗

        2.3.1 pH 值對GABA 產(chǎn)量的影響 有研究表明麥麩GAD 酶活的最佳pH 值為5.7[25],故而分別以蒸餾水和pH 5.7 的磷酸緩沖液作為浸泡溶液,比較其對GABA 產(chǎn)量的影響,GABA 富集方法同1.2.3 節(jié)。如圖3 所示,不同浸泡液轉化生成的GABA產(chǎn)量存在差異,在pH 5.7 的磷酸緩沖液條件下,2個青稞品種GABA 產(chǎn)量雖均高于以蒸餾水為介質的GABA 產(chǎn)量,但差異未達到顯著水平。為減少生產(chǎn)過程中的化學物質成分,建立安全的GABA 制備方法,后續(xù)試驗均以蒸餾水為反應溶液介質。

        圖3 pH 對GABA 產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of pH on GABA yield

        2.3.2 料液比對GABA 產(chǎn)量的影響 分別按照60∶1,80∶1,100∶1,120∶1,140∶1(g/L)的料液比,準確稱取6,8,10,12,14 g 麥麩加入到含有100 mL蒸餾水的三角瓶中,在180 r/min,30 ℃條件下振蕩培養(yǎng)8 h,3 800×g 離心15 min,取上清液1 mL 測定GABA 含量。由圖4 可知,GABA 產(chǎn)量隨著料液比的升高而增加,在料液比為140 ∶1(g/L)的情況下,GABA 的產(chǎn)量最高,可達到7.30 mmol/L。繼續(xù)增加料液比,反應攪拌困難,因此確定最適宜的料液比為140∶1(g/L)。

        圖4 料液比對GABA 產(chǎn)量的影響Fig.4 Effects of solid-liquid ratio on GABA yield

        2.3.3 反應時間對GABA 產(chǎn)量的影響 按照140∶1(g/L)的料液比稱取14 g 麥麩,加入含有10 mmol/L 谷氨酸鈉的100 mL 水溶液,在180 r/min,30 ℃條件下分別振蕩培養(yǎng)4,8,12,16,20 h,3 800×g 離心15 min,取上清液測定GABA 含量。由圖5 可以看出,4~8 h 是GABA 生成緩慢增長期,8~12 h 為GABA 的快速增長期,12 h 之后GABA 的合成趨于平穩(wěn)。

        圖5 反應時間對GABA 產(chǎn)量的影響Fig.5 Effects of reaction time on GABA yield

        2.3.4 反應溫度對GABA 產(chǎn)量的影響 按照140∶1(g/L)料液比稱取14 g 麥麩,加入含有10 mmol/L谷氨酸鈉的100 mL 水溶液,分別在溫度25,30,35,40,45 ℃,180 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)12 h,3 800×g 離心15 min,取上清液測定GABA 含量。從圖6 可以看出,當反應溫度在25~45 ℃時,GABA 的生成量呈先升高后降低的趨勢,當反應溫度為35 ℃時,GABA 的生成量最高,隨后開始下降。

        圖6 反應溫度對GABA 產(chǎn)量的影響Fig.6 Effects of reaction temperature on GABA yield

        2.3.5 PLP 濃度對GABA 產(chǎn)量的影響 PLP 是維生素B6的活性形式,作為輔酶參與GABA 生物合成的谷氨酸脫羧反應。按照140∶1(g/L)料液比稱取14 g 麥麩,分別加入含有0,10,20,30 μmol/L PLP 及10 mmol/L 谷氨酸鈉的100 mL 水溶液。在180 r/min,30 ℃條件下振蕩培養(yǎng)12 h,3 800×g 離心15 min,取上清液1 mL 測定GABA 含量。由圖7 可以看出,在0~30 μmol/L PLP 濃度范圍,GABA的生成量持續(xù)升高,當添加量大于20 μmol/L 時,GABA 的生成量增加趨于平緩。

        圖7 磷酸吡哆醛添加量對GABA 產(chǎn)量的影響Fig.7 Effect of the amount of pyridoxal 5'-phosphate on GABA yield

        2.3.6 谷氨酸鈉濃度對GABA 產(chǎn)量的影響 按照140∶1(g/L)料液比稱取14 g 麥麩,分別加入含有0,3,6,8,10 mmol/L 谷氨酸鈉以及10 μmol/L PLP的100 mL 水溶液。在180 r/min,30 ℃條件下振蕩培養(yǎng)12 h,3 800×g 離心15 min,取上清液1 mL 測定GABA 的濃度。由圖8 可以看出,在0~10 mmol/L 的谷氨酸鈉添加量范圍內,GABA 的生成量持續(xù)上升,在添加量為8 mmol/L 時,GABA 的生成量最高為14.01 mmol/L。當谷氨酸鈉添加量大于8 mmol/L 后,GABA 的生成量開始下降。因此,后續(xù)優(yōu)化試驗谷氨酸鈉的添加量為8 mmol/L。

        圖8 谷氨酸鈉添加量對GABA 產(chǎn)量的影響Fig.8 Effects of the amount of sodium glutamate on GABA yield

        2.4 青稞麥麩GABA 富集工藝優(yōu)化的正交試驗及驗證

        根據(jù)單因素實驗結果,將料液比確定為140∶1(g/L),谷氨酸鈉添加量為8 mmol/L,采用L9(33)正交試驗對反應時間、反應溫度、PLP 濃度3 個因素進一步優(yōu)化。由表2 和表3 可知,3 個試驗因素的極差(r)大小依次為rA>rB>rC,反應時間對GABA產(chǎn)量的影響最大,其次是反應溫度和PLP 添加量。方差分析表明,反應時間、反應溫度、PLP 添加量對GABA 產(chǎn)量的影響極顯著(P<0.01),根據(jù)各因素水平組合得到的GABA 含量結果顯示,A2B2C3為最優(yōu)組合,即在時間12 h,溫度35 ℃,PLP 初始濃度18 μmol/L 的反應條件下,轉化生成的GABA產(chǎn)量最高。

        表2 正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal experiment

        表3 正交試驗方差分析表Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment

        為驗證優(yōu)化工藝條件,按140∶1(g/L)的料液比,加入含有8 mmol/L 的谷氨酸鈉以及18 μmol/L的磷酸吡哆醛水溶液,設置反應溫度為35 ℃,反應12 h,3 次重復試驗測得的GABA 生成量分別為15.07,15.13,15.16 mmol/L,平均含量為15.12 mmol/L,與正交試驗結果相近,說明該工藝條件穩(wěn)定可靠。

        2.5 不同脫皮率對青稞麥麩制備GABA 的影響

        胚芽和麥麩是籽粒GABA 合成的主要部位,為進一步調查麩皮脫皮率對GABA 產(chǎn)量的影響,通過不同碾磨程度的麩皮分級制備方法共獲得7個試驗組的青稞麥麩,脫皮率分別為0%(完整籽粒),4.23%,6.43%,13.62%(商品麥麩),23.78%,30.44%,34.27%。采用前述優(yōu)化工藝條件富集制備GABA。

        由表4 可以看出,隨著青稞脫皮率的增加,麥麩富集的GABA 含量顯著下降,當脫皮率>23.78%時,籽粒外皮全部脫離,GABA 含量趨于穩(wěn)定。同樣,隨著脫皮率的增加,對應的青稞米GABA 含量不斷降低,在脫皮率為4.23%~6.43%范圍時,差異不顯著。因此,在前述優(yōu)化工藝合成條件下,利用脫皮率為4.23%~6.43%的麥麩富集制得的GABA含量較高(17.27~19.57 mmol/L),明顯高于商品麥麩富集的GABA 含量15.12 mmol/L。本試驗利用青稞麥麩富集的GABA 含量最高可達19.57 mmol/L,相當于麩皮中GABA 含量為14.41 mg/g,顯著高于前人報道的裸大麥富集GABA 產(chǎn)量7.56 mg/g[22],也極顯著高于米糠和小麥富集的GABA產(chǎn)量5.02 mg/g 和3.21 mg/g[21,27]。

        表4 麥麩脫皮率對GABA 產(chǎn)量的影響Table 4 Effect of peeling rate of bran on GABA yield

        為了測量添加底物谷氨酸鈉的轉化率,對試驗組2 和3 設置了無底物添加的對照組,其余工藝條件相同。計算轉化率(%)=(添加底物處理組GABA 量-未添加底物對照組GABA 量)/底物添加量×100。測量得到脫皮率分別為4.23%和6.43%麥麩的對照組GABA 產(chǎn)量分別為11.78 mmol/L 和9.44 mmol/L,相應的底物轉化率分別為97.38%和97.88%,表明在上述工藝條件下,底物谷氨酸鈉轉化為GABA 的效率極高,殘留量低。

        3 結論

        青稞是青藏高原特色主糧作物,富含多種營養(yǎng)成分及功能活性物質。本研究發(fā)現(xiàn),利用不同青稞品種麥麩為原料富集的GABA 產(chǎn)量差異較大,且與品種內源GAD 活性密切相關,其中品種ZJ5的GABA 產(chǎn)量最高。在pH 值、料液比、外源谷氨酸鈉和PLP 濃度、反應溫度和時間的單因素實驗基礎上,通過反應時間、溫度和PLP 濃度的三因素三水平正交試驗,得到GABA 富集的優(yōu)化工藝條件。不同脫皮率的麩皮分級制備對GABA 產(chǎn)量影響顯著,在不使用緩沖溶液,安全添加谷氨酸鈉和PLP 的條件下,青稞麥麩GABA 安全高效的制備技術為:麩皮脫皮率為4.23%~6.43%,料液比為140∶1(g/L),反應時間為12 h,反應溫度為35 ℃,分別添加濃度為8 mmol/L 的谷氨酸鈉和18 μmol/L 的PLP,獲得的GABA 最高產(chǎn)量為19.57 mmol/L(14.41 mg/g),外源底物轉化率高于97%。該工藝技術為食物源高含量GABA 綠色制備和青稞副產(chǎn)物高值化利用提供了理論和技術支持,后續(xù)將在中試或更大規(guī)模條件下繼續(xù)優(yōu)化GABA 青稞麥麩富集的工藝條件。

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