江 迪，張紫晉，楊 婷，2，趙 爽，4，彭 君，蒲鄧佳，2，陳 靜*

（1 中國科學(xué)院成都生物研究所 成都 610041 2 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 四川雅安 625014 3 西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所 拉薩 850000 4 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 昆明 650500）

γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyricacid，GABA）是一種廣泛分布于動(dòng)、植物和微生物中的非蛋白質(zhì)氨基酸[1]，是存在于哺乳動(dòng)物腦、脊髓中的一種重要的抑制性神經(jīng)傳遞物質(zhì)[2]，具有降血壓[3-4]，抗抑郁[5-6]，增強(qiáng)腦功能[7-8]等生理活性，在功能性食品領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用前景[9]。GABA 主要由谷氨酸經(jīng)谷氨酸脫羧酶（Glutamate decarboxylase，GAD）催化轉(zhuǎn)化而來[10]，其制備方法主要有化學(xué)合成法和生物合成法兩大類[11]?；瘜W(xué)合成法雖然反應(yīng)速度快，得率高，但是副反應(yīng)多，有化學(xué)物質(zhì)殘留，不符合現(xiàn)代工業(yè)綠色環(huán)保的發(fā)展理念[12]。生物合成法又分為微生物轉(zhuǎn)化法和植物富集法[13]，其原理是利用微生物與植物中的內(nèi)源GAD 將谷氨酸（Glu）及其鈉鹽轉(zhuǎn)化成GABA。微生物轉(zhuǎn)化存在高效菌株難獲得，發(fā)酵液成分復(fù)雜，生產(chǎn)的GABA 需進(jìn)一步純化等問題[14]。常見的植物富集法，如利用大豆[15]、水稻[16]等谷物籽粒進(jìn)行發(fā)芽或發(fā)酵處理富集GABA，則存在得率低，操作步驟多，pH 調(diào)控嚴(yán)等不同程度的局限性，不能滿足食品工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)的需要。

近年來，全球?qū)I養(yǎng)健康功能食品和保健品的需求持續(xù)增加，探索低成本、環(huán)境友好、食物源的GABA 高效富集方法十分重要[17]。到目前為止，國內(nèi)外利用米糠[18]、玉米胚芽[19]等農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物轉(zhuǎn)化GABA 的研究較多，然而，利用麥麩制備GABA 的報(bào)道較少。廖周華等[20]以脫脂小麥麥麩為原料，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化富集工藝得到的GABA 產(chǎn)量為3.81 mg/g（4 mmol/L）。Jin 等[21]和Limure 等[22]以裸大麥麥麩為原料，通過對外源添加谷氨酸鈉和輔酶以及反應(yīng)條件的單因素優(yōu)化，GABA 生成量達(dá)到11 mmol/L，轉(zhuǎn)化率為92%。青藏高原裸大麥（亦稱青稞）是栽培大麥的一個(gè)變種，也是種植面積最大的高原糧食作物[23]。本試驗(yàn)通過對青稞品種選擇、麩皮分級制備方法和GABA 合成工藝優(yōu)化等研究，建立一種利用青稞麩皮制備GABA 的安全、高效的方法，從而為高附加值GABA 功能食品和保健品生產(chǎn)提供可靠的原料生產(chǎn)途徑，以提高農(nóng)業(yè)資源的利用率和種植效益。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

供試材料：15 份青稞品種，種植于四川什邡，常規(guī)田間管理，收獲成熟籽粒用于后續(xù)研究。

主要試劑：GABA 標(biāo)準(zhǔn)品，上海麥克林生化科技有限公司；谷氨酸鈉、磷酸吡哆醛，上海源葉生物科技有限公司；硼酸、四硼酸鈉、苯酚、次氯酸鈉、無水乙醇、鹽酸，成都海鴻實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。本試驗(yàn)使用的化學(xué)藥品均為分析純級。

主要儀器與設(shè)備：SCIENTZ 高通量組織研磨器，寧波新芝生物科技股份有限公司；IS-RDV1/IS-RSV1 立式恒溫振蕩器，美國精騏有限公司；AS220.X2 分析天平，波蘭RADWAG 公司；Thermo Fisher 全波長掃描式多功能讀數(shù)儀，美國賽默飛世爾公司；L4-6K 臺式低速離心機(jī)，湖南可成儀器設(shè)備有限公司；HWS24 電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原料制備 委托當(dāng)?shù)孛娣奂庸S采用常規(guī)磨粉方法獲得供試品種的商品麥麩。通過不同程度碾壓進(jìn)行麥麩分級制備，具體做法為：清除種子中的石子、泥塊等雜質(zhì)，快速清洗、烘干后，稱取6份青稞倒入脫皮機(jī)，采用常規(guī)碾米工序，通過設(shè)定脫皮循環(huán)次數(shù)得到不同的脫皮率，出料口收集并稱量青稞麥麩，計(jì)算脫皮率（%）=（青稞麩皮質(zhì)量/青稞質(zhì)量）×100。采用組織研磨器粉碎麥麩，過80目篩，備用。

1.2.2 繪制GABA 標(biāo)準(zhǔn)曲線 準(zhǔn)確稱取GABA標(biāo)準(zhǔn)品100 mg，用蒸餾水溶解并定容到100 mL，配制成1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)液。準(zhǔn)確吸取0，0.05，0.10，0.15，0.20，0.25 mL 的1 mg/mL 的GABA 標(biāo)準(zhǔn)液于帶蓋的10 mL 離心管中，分別加入蒸餾水1，0.95，0.90，0.85，0.80，0.75 mL，得到不同濃度的GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液。

采用Berthelot 比色法[24]對不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)GABA 溶液進(jìn)行處理，依次加入0.2 mol/L（pH 9.0）硼酸鹽緩沖液0.6 mL，5%苯酚溶液2 mL，7%次氯酸鈉溶液1 mL 混勻后，立即放入沸水浴加熱13 min，冰浴冷卻5 min，最后加入60%乙醇2 mL搖勻，然后在波長645 nm 處測定溶液的吸光度。以吸光度為橫坐標(biāo)，GABA 濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 GABA 產(chǎn)量及GAD 酶活力測定 GABA富集參考Jin 等[21]的方法，略有改動(dòng)。具體操作步驟為：按照140∶1（g/L）的料液比，在180 r/min，30℃條件下振蕩培養(yǎng)8 h。反應(yīng)結(jié)束后3 800×g 離心15 min，取上清液1 mL 測定GABA 含量。GABA測量方法同1.2.2 節(jié)。利用繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品GABA 含量。

GAD 酶活力測定參考呂瑩果[25]的方法，略有改動(dòng)。具體操作步驟為：稱取1 g 麥麩到三角瓶中，加入質(zhì)量濃度為10 g/L 的谷氨酸鈉底物溶液40 mL，在pH 5.7，40 ℃反應(yīng)2 h，90 ℃加熱5 min滅酶活，3 800×g 離心5 min，取上清測定產(chǎn)物GABA 含量，GABA 測量方法同1.2.2 節(jié)。以每30 min生成1 μmol 的GABA 作為一個(gè)酶活力單位。

1.2.4 GABA 合成工藝的單因素實(shí)驗(yàn)及正交試驗(yàn)分別考察pH 值（5.7，7）、料液比（60∶1，80∶1，100∶1，120∶1，140∶1，g/L）、反應(yīng)時(shí)間（4，8，12，16，20 h）、反應(yīng)溫度（25，30，35，40，45 ℃）、磷酸吡哆醛濃度（0，10，20，30 μmol/L）、谷氨酸鈉濃度（0，3，6，8，10 mmol/L）對青稞麩皮制備GABA 的影響。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels of the test

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

試驗(yàn)設(shè)置3 次重復(fù)。采用軟件SPSS 25.0 進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)及方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

圖1 為繪制的GABA 標(biāo)準(zhǔn)曲線，在波長645 nm 處的吸光值與GABA 質(zhì)量濃度具有良好的線性關(guān)系：y=0.0955x-0.00009，回歸系數(shù)R2=0.9994，RSD=1.8%，可以作為后續(xù)計(jì)算樣品GABA 含量的參照標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖1 GABA 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of GABA content

2.2 青稞麥麩GAD 活性及GABA 產(chǎn)量分析

青稞屬于高蛋白、低脂作物，其籽粒谷氨酸含量明顯高于其它氨基酸組分[26]，基于前期對不同青稞品種籽粒GABA 含量的鑒定，選擇15 個(gè)品種的商品麥麩進(jìn)行GABA 富集的比較試驗(yàn)。從圖2可以看出，利用不同青稞品種富集的GABA 產(chǎn)量存在顯著差異，GABA 平均產(chǎn)量為5.29 mmol/L，變化范圍為4.10～7.27 mmol/L，其中ZJ5 的GABA 生成量最高為7.27 mmol/L。GAD 是GABA 代謝通路中的限速酶，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，品種間GAD 酶活水平差異顯著，GAD 酶活力平均為6.18 U，變化范圍為4.33～9.91 U，且不同品種GABA 生成量與GAD 活性呈極顯著正相關(guān)（r=0.988），表明品種間內(nèi)源GAD 酶活性差異可能是GABA 產(chǎn)量不同的主要原因。因此，選擇品種ZJ5 的商品麥麩作為GABA 富集方法優(yōu)化的原料。

圖2 不同青稞品種富集的GABA 產(chǎn)量及GAD 酶活力Fig.2 GABA yield and GAD activity of different highland barley varieties

2.3 利用青稞麩皮富集GABA 的單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 pH 值對GABA 產(chǎn)量的影響 有研究表明麥麩GAD 酶活的最佳pH 值為5.7[25]，故而分別以蒸餾水和pH 5.7 的磷酸緩沖液作為浸泡溶液，比較其對GABA 產(chǎn)量的影響，GABA 富集方法同1.2.3 節(jié)。如圖3 所示，不同浸泡液轉(zhuǎn)化生成的GABA產(chǎn)量存在差異，在pH 5.7 的磷酸緩沖液條件下，2個(gè)青稞品種GABA 產(chǎn)量雖均高于以蒸餾水為介質(zhì)的GABA 產(chǎn)量，但差異未達(dá)到顯著水平。為減少生產(chǎn)過程中的化學(xué)物質(zhì)成分，建立安全的GABA 制備方法，后續(xù)試驗(yàn)均以蒸餾水為反應(yīng)溶液介質(zhì)。

圖3 pH 對GABA 產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of pH on GABA yield

2.3.2 料液比對GABA 產(chǎn)量的影響 分別按照60∶1，80∶1，100∶1，120∶1，140∶1（g/L）的料液比，準(zhǔn)確稱取6，8，10，12，14 g 麥麩加入到含有100 mL蒸餾水的三角瓶中，在180 r/min，30 ℃條件下振蕩培養(yǎng)8 h，3 800×g 離心15 min，取上清液1 mL 測定GABA 含量。由圖4 可知，GABA 產(chǎn)量隨著料液比的升高而增加，在料液比為140 ∶1（g/L）的情況下，GABA 的產(chǎn)量最高，可達(dá)到7.30 mmol/L。繼續(xù)增加料液比，反應(yīng)攪拌困難，因此確定最適宜的料液比為140∶1（g/L）。

圖4 料液比對GABA 產(chǎn)量的影響Fig.4 Effects of solid-liquid ratio on GABA yield

2.3.3 反應(yīng)時(shí)間對GABA 產(chǎn)量的影響 按照140∶1（g/L）的料液比稱取14 g 麥麩，加入含有10 mmol/L 谷氨酸鈉的100 mL 水溶液，在180 r/min，30 ℃條件下分別振蕩培養(yǎng)4，8，12，16，20 h，3 800×g 離心15 min，取上清液測定GABA 含量。由圖5 可以看出，4～8 h 是GABA 生成緩慢增長期，8～12 h 為GABA 的快速增長期，12 h 之后GABA 的合成趨于平穩(wěn)。

圖5 反應(yīng)時(shí)間對GABA 產(chǎn)量的影響Fig.5 Effects of reaction time on GABA yield

2.3.4 反應(yīng)溫度對GABA 產(chǎn)量的影響 按照140∶1（g/L）料液比稱取14 g 麥麩，加入含有10 mmol/L谷氨酸鈉的100 mL 水溶液，分別在溫度25，30，35，40，45 ℃，180 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)12 h，3 800×g 離心15 min，取上清液測定GABA 含量。從圖6 可以看出，當(dāng)反應(yīng)溫度在25～45 ℃時(shí)，GABA 的生成量呈先升高后降低的趨勢，當(dāng)反應(yīng)溫度為35 ℃時(shí)，GABA 的生成量最高，隨后開始下降。

圖6 反應(yīng)溫度對GABA 產(chǎn)量的影響Fig.6 Effects of reaction temperature on GABA yield

2.3.5 PLP 濃度對GABA 產(chǎn)量的影響 PLP 是維生素B6的活性形式，作為輔酶參與GABA 生物合成的谷氨酸脫羧反應(yīng)。按照140∶1（g/L）料液比稱取14 g 麥麩，分別加入含有0，10，20，30 μmol/L PLP 及10 mmol/L 谷氨酸鈉的100 mL 水溶液。在180 r/min，30 ℃條件下振蕩培養(yǎng)12 h，3 800×g 離心15 min，取上清液1 mL 測定GABA 含量。由圖7 可以看出，在0～30 μmol/L PLP 濃度范圍，GABA的生成量持續(xù)升高，當(dāng)添加量大于20 μmol/L 時(shí)，GABA 的生成量增加趨于平緩。

圖7 磷酸吡哆醛添加量對GABA 產(chǎn)量的影響Fig.7 Effect of the amount of pyridoxal 5'-phosphate on GABA yield

2.3.6 谷氨酸鈉濃度對GABA 產(chǎn)量的影響 按照140∶1（g/L）料液比稱取14 g 麥麩，分別加入含有0，3，6，8，10 mmol/L 谷氨酸鈉以及10 μmol/L PLP的100 mL 水溶液。在180 r/min，30 ℃條件下振蕩培養(yǎng)12 h，3 800×g 離心15 min，取上清液1 mL 測定GABA 的濃度。由圖8 可以看出，在0～10 mmol/L 的谷氨酸鈉添加量范圍內(nèi)，GABA 的生成量持續(xù)上升，在添加量為8 mmol/L 時(shí)，GABA 的生成量最高為14.01 mmol/L。當(dāng)谷氨酸鈉添加量大于8 mmol/L 后，GABA 的生成量開始下降。因此，后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)谷氨酸鈉的添加量為8 mmol/L。

圖8 谷氨酸鈉添加量對GABA 產(chǎn)量的影響Fig.8 Effects of the amount of sodium glutamate on GABA yield

2.4 青稞麥麩GABA 富集工藝優(yōu)化的正交試驗(yàn)及驗(yàn)證

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將料液比確定為140∶1（g/L），谷氨酸鈉添加量為8 mmol/L，采用L9（33）正交試驗(yàn)對反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、PLP 濃度3 個(gè)因素進(jìn)一步優(yōu)化。由表2 和表3 可知，3 個(gè)試驗(yàn)因素的極差（r）大小依次為rA＞rB＞rC，反應(yīng)時(shí)間對GABA產(chǎn)量的影響最大，其次是反應(yīng)溫度和PLP 添加量。方差分析表明，反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、PLP 添加量對GABA 產(chǎn)量的影響極顯著（P＜0.01），根據(jù)各因素水平組合得到的GABA 含量結(jié)果顯示，A2B2C3為最優(yōu)組合，即在時(shí)間12 h，溫度35 ℃，PLP 初始濃度18 μmol/L 的反應(yīng)條件下，轉(zhuǎn)化生成的GABA產(chǎn)量最高。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment

表3 正交試驗(yàn)方差分析表Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment

為驗(yàn)證優(yōu)化工藝條件，按140∶1（g/L）的料液比，加入含有8 mmol/L 的谷氨酸鈉以及18 μmol/L的磷酸吡哆醛水溶液，設(shè)置反應(yīng)溫度為35 ℃，反應(yīng)12 h，3 次重復(fù)試驗(yàn)測得的GABA 生成量分別為15.07，15.13，15.16 mmol/L，平均含量為15.12 mmol/L，與正交試驗(yàn)結(jié)果相近，說明該工藝條件穩(wěn)定可靠。

2.5 不同脫皮率對青稞麥麩制備GABA 的影響

胚芽和麥麩是籽粒GABA 合成的主要部位，為進(jìn)一步調(diào)查麩皮脫皮率對GABA 產(chǎn)量的影響，通過不同碾磨程度的麩皮分級制備方法共獲得7個(gè)試驗(yàn)組的青稞麥麩，脫皮率分別為0%（完整籽粒），4.23%，6.43%，13.62%（商品麥麩），23.78%，30.44%，34.27%。采用前述優(yōu)化工藝條件富集制備GABA。

由表4 可以看出，隨著青稞脫皮率的增加，麥麩富集的GABA 含量顯著下降，當(dāng)脫皮率＞23.78%時(shí)，籽粒外皮全部脫離，GABA 含量趨于穩(wěn)定。同樣，隨著脫皮率的增加，對應(yīng)的青稞米GABA 含量不斷降低，在脫皮率為4.23%～6.43%范圍時(shí)，差異不顯著。因此，在前述優(yōu)化工藝合成條件下，利用脫皮率為4.23%～6.43%的麥麩富集制得的GABA含量較高（17.27～19.57 mmol/L），明顯高于商品麥麩富集的GABA 含量15.12 mmol/L。本試驗(yàn)利用青稞麥麩富集的GABA 含量最高可達(dá)19.57 mmol/L，相當(dāng)于麩皮中GABA 含量為14.41 mg/g，顯著高于前人報(bào)道的裸大麥富集GABA 產(chǎn)量7.56 mg/g[22]，也極顯著高于米糠和小麥富集的GABA產(chǎn)量5.02 mg/g 和3.21 mg/g[21，27]。

表4 麥麩脫皮率對GABA 產(chǎn)量的影響Table 4 Effect of peeling rate of bran on GABA yield

為了測量添加底物谷氨酸鈉的轉(zhuǎn)化率，對試驗(yàn)組2 和3 設(shè)置了無底物添加的對照組，其余工藝條件相同。計(jì)算轉(zhuǎn)化率（%）=（添加底物處理組GABA 量-未添加底物對照組GABA 量）/底物添加量×100。測量得到脫皮率分別為4.23%和6.43%麥麩的對照組GABA 產(chǎn)量分別為11.78 mmol/L 和9.44 mmol/L，相應(yīng)的底物轉(zhuǎn)化率分別為97.38%和97.88%，表明在上述工藝條件下，底物谷氨酸鈉轉(zhuǎn)化為GABA 的效率極高，殘留量低。

3 結(jié)論

青稞是青藏高原特色主糧作物，富含多種營養(yǎng)成分及功能活性物質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn)，利用不同青稞品種麥麩為原料富集的GABA 產(chǎn)量差異較大，且與品種內(nèi)源GAD 活性密切相關(guān)，其中品種ZJ5的GABA 產(chǎn)量最高。在pH 值、料液比、外源谷氨酸鈉和PLP 濃度、反應(yīng)溫度和時(shí)間的單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過反應(yīng)時(shí)間、溫度和PLP 濃度的三因素三水平正交試驗(yàn)，得到GABA 富集的優(yōu)化工藝條件。不同脫皮率的麩皮分級制備對GABA 產(chǎn)量影響顯著，在不使用緩沖溶液，安全添加谷氨酸鈉和PLP 的條件下，青稞麥麩GABA 安全高效的制備技術(shù)為：麩皮脫皮率為4.23%～6.43%，料液比為140∶1（g/L），反應(yīng)時(shí)間為12 h，反應(yīng)溫度為35 ℃，分別添加濃度為8 mmol/L 的谷氨酸鈉和18 μmol/L 的PLP，獲得的GABA 最高產(chǎn)量為19.57 mmol/L（14.41 mg/g），外源底物轉(zhuǎn)化率高于97%。該工藝技術(shù)為食物源高含量GABA 綠色制備和青稞副產(chǎn)物高值化利用提供了理論和技術(shù)支持，后續(xù)將在中試或更大規(guī)模條件下繼續(xù)優(yōu)化GABA 青稞麥麩富集的工藝條件。