董麗麗 余青華

摘要 ［目的］深入了解生防菌發(fā)揮作用的方式。［方法］對(duì)從土壤中分離的解淀粉芽孢桿菌的產(chǎn)酶活性和生防菌功能展開(kāi)研究，采用產(chǎn)生透明圈的方法檢測(cè)解淀粉芽孢桿菌生產(chǎn)纖維素酶的功能，用牛津杯法檢測(cè)解淀粉芽孢桿菌對(duì)植物致病菌禾谷鐮刀菌的抑制作用。［結(jié)果］解淀粉芽孢桿菌能夠產(chǎn)生分解纖維素的纖維素酶，纖維素酶活性可以達(dá)到26.86 U/mL，并且它能夠抑制禾谷鐮刀菌的生長(zhǎng)，而且生長(zhǎng)代謝產(chǎn)物濃度越濃抑制效果越明顯，未經(jīng)稀釋的菌液抑菌效價(jià)可達(dá)到465 mm/mL。［結(jié)論］該研究為解淀粉芽孢桿菌的實(shí)際應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)和實(shí)踐指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞 抑菌性能；解淀粉芽孢桿菌；禾谷鐮刀菌；纖維素酶；生防能力

中圖分類(lèi)號(hào) X172? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2023）14-0011-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.14.003

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

作者簡(jiǎn)介 董麗麗（1973—），女，山東威海人，高級(jí)工程師，從事風(fēng)景園林建設(shè)管理、環(huán)境微生物應(yīng)用研究。

隨著人類(lèi)人口數(shù)目的不斷增加，人們對(duì)農(nóng)作物的需求也隨之增加，這促使農(nóng)田面積大幅度增加，大量種植所需求的農(nóng)作物。然而，大面積開(kāi)墾農(nóng)田，種植單一作物，使得生態(tài)系統(tǒng)的多樣性下降，穩(wěn)定性下降，對(duì)于各種病蟲(chóng)害的抵御能力也隨之下降［ 1］。病蟲(chóng)害帶來(lái)的巨大經(jīng)濟(jì)損失使得人們對(duì)這一問(wèn)題越來(lái)越重視，隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，研究者發(fā)現(xiàn)有些化學(xué)試劑能夠有效地抑制病蟲(chóng)害，減少農(nóng)作物的損失，有些化學(xué)試劑能夠通過(guò)提供生長(zhǎng)所需要的元素來(lái)提高農(nóng)作物的產(chǎn)量，于是就出現(xiàn)了化肥農(nóng)藥。正是由于化學(xué)防治的高效性，截至目前，人們大多仍采用此方法來(lái)抵御農(nóng)作物的病蟲(chóng)害。但是無(wú)節(jié)制地使用化肥農(nóng)藥，也造成環(huán)境污染、土壤硬化等問(wèn)題［ 2］。并且病原微生物也因?yàn)榛瘜W(xué)藥劑的使用而產(chǎn)生了不可避免的抗性［ 3］，再加上近年來(lái)人們對(duì)生活質(zhì)量的追求，以及農(nóng)藥殘留帶來(lái)的食品安全問(wèn)題，農(nóng)田防治病蟲(chóng)害的方法也日益受到人們的關(guān)注，所以在這種趨勢(shì)下化學(xué)防治在農(nóng)業(yè)方面的應(yīng)用也慢慢減少。

近年來(lái)，在研究防治病蟲(chóng)害的過(guò)程中，人們發(fā)現(xiàn)有些微生物也具有防治的功效，由于生物防治具有無(wú)害性這一特點(diǎn)，對(duì)生物防治的研究也越來(lái)越受關(guān)注［ 4］。農(nóng)藥減量化觀點(diǎn)的提出也使人們不斷去尋找其他能夠替代農(nóng)藥作用的方法，人們對(duì)作為能夠無(wú)害解決病蟲(chóng)害問(wèn)題的生物防治的方法充滿期待［ 5］。相關(guān)研究表明生防菌可以作為化學(xué)農(nóng)藥的良好替代品，它不僅能夠解決病蟲(chóng)害問(wèn)題，而且不會(huì)給環(huán)境造成污染。某些生防菌還可以抑制農(nóng)田中雜草的生長(zhǎng)［ 6］，這種微生物除草劑主要是利用雜草病原微生物的致病能力從而達(dá)到除草的目［ 7］。此外，對(duì)藥用植物有關(guān)的生防菌的研究也是一大熱點(diǎn)［ 8］。藥用植物相比于一般的植物，它對(duì)光照、溫度、濕度等環(huán)境因素的要求更加苛刻，所以人們更加關(guān)注藥用植物的培育［ 9］。對(duì)于某些珍貴的藥用植物，生防菌的存在提升了自身的存活率。木霉屬（Trichoderma spp.）、芽孢桿菌屬（Bacillus spp.）、假單胞菌屬（Pseudomonas spp.）等是植物生防菌中較為常見(jiàn)的類(lèi)型［ 10］，其中生防菌中的細(xì)菌是應(yīng)用最為廣泛的一種［ 11］。這些生防菌發(fā)揮作用的機(jī)制主要是抗生作用、競(jìng)爭(zhēng)作用、重寄生作用、誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性等拮抗機(jī)制［ 12］。

其中，芽孢桿菌是研究的一大熱點(diǎn)，芽孢桿菌是微生物中的優(yōu)勢(shì)生物種群，它是一種嚴(yán)格好氧、兼性厭氧的桿狀菌。芽孢桿菌最大的特點(diǎn)是能夠產(chǎn)生圓形或者橢圓形的芽孢，并且因?yàn)橛醒挎叩拇嬖谑沟盟哂袠O強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)力，能夠在酸性、高溫、低氧、紫外線、電離輻射和存在有害化學(xué)試劑等各種不良環(huán)境下存活［ 13］。芽孢桿菌生長(zhǎng)速度很快，體積也比一般的病原菌大，所以它可以通過(guò)和其他病原菌競(jìng)爭(zhēng)生長(zhǎng)空間、爭(zhēng)奪養(yǎng)分的方式，抑制病原菌的繁殖生長(zhǎng)，此外，芽孢桿菌還可以產(chǎn)生一些抗菌物質(zhì)，具有更好的抑菌效果，還可以分泌一些能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)的物質(zhì)，可促進(jìn)植物生長(zhǎng)，最重要的是對(duì)人畜無(wú)害［ 13］。該研究從土壤中篩選并鑒定解淀粉芽孢桿菌，采用牛津杯法檢測(cè)所篩解淀粉芽孢桿菌對(duì)植物病原菌的抑制作用，并且通過(guò)觀察水解圈的大小來(lái)鑒定它產(chǎn)纖維素酶的能力，以期為該菌作為土壤改良劑提供應(yīng)用基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種。解淀粉芽孢桿菌（從土壤中分離得到的）；植物病原菌禾谷鐮刀菌（從谷鐮刀病的玉米病株中分離得到的）。

1.1.2 試劑。酵母提取物，羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulose sodium-Na，CMC-Na），胰蛋白胨，（NH4）2SO4，NaCl，瓊脂粉，葡萄糖，K2HPO4，Mg SO4·7H2O，CaCl2，1% CMC溶液，DNS溶液。

1.1.3 培養(yǎng)基。

（1）LB固體培養(yǎng)基。胰蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 10 g，瓊脂粉 15 g，pH為7.2。

（2）LB液體培養(yǎng)基。胰蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 10 g，pH為7.2。

（3）馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基。馬鈴薯提取物（將200 g 馬鈴薯去皮切成薄片，用適量蒸餾水煮熟，再用8層干凈的紗布進(jìn)行過(guò)濾得到的濾液），瓊脂粉 15 g，葡萄糖 20 g，再用蒸餾水定容到1 L。

（4）馬鈴薯葡萄糖水（PD）培養(yǎng)基。馬鈴薯提取物，葡萄糖 20 g，蒸餾水定容到 1 L。

（5）纖維素酶測(cè)定培養(yǎng)基。（NH4）2SO4? 0.25 g，K2HPO4? 0.3 g，Mg SO4·7H2O 0.05 g，羧甲基纖維素鈉 1 g，瓊脂2 g，蒸餾水定容100 mL，pH為7.2。

（6）產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基。CMC-Na 1.5 g，（NH4）2SO4 0.2 g，蛋白胨 0.1 g，NaCl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，K2HPO4? 0.4 g，CaCl2 0.03 g，蒸餾水定容到100 mL。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的分離篩選。

稱取10 g土壤用90 mL的無(wú)菌水溶解搖勻，用盛有9 mL無(wú)菌水的試管進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)来螢?0-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，充分混勻，并做好標(biāo)記。分別吸取1 mL 10-5、10-6、10-7、10-8試管中的混合溶液，每個(gè)試管中的溶液分別涂布到2個(gè)制備好的LB固體培養(yǎng)基中，做好標(biāo)記。38 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d。從培養(yǎng)的平板中再次挑菌，接種到新的LB固體培養(yǎng)基中，純化重復(fù)2～3次。

1.2.2 PCR擴(kuò)增和16S rDNA瓊脂糖凝膠電泳。

取純化的菌株放入有50 μL雙蒸水的離心管中，搖晃混勻；離心管用泡沫浮板固定，放到提前預(yù)熱到100 ℃的水浴鍋中，煮沸10 min，將處理過(guò)的菌液置于離心機(jī)中，5 000 r/min，離心10 min，取上清液。

將離心取得的上清液與dNTP、buffer、Taq酶和引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）、1492R（5′- GGTTACCTTGTTACGACTT-3′），以及雙蒸水按照標(biāo)準(zhǔn)配制成25 μL的體系［10×緩沖液2.5 μL，dNTP 2.5 μL，DNA模板1 μL，Taq酶0.25 μL，2種引物（27F和1492R）各1 μL，雙蒸水補(bǔ)至25 μL］，將混合好的體系放到無(wú)菌的EP管中，用漩渦振蕩儀混合均勻。設(shè)置PCR儀程序（95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min），進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

將0.2 g瓊脂糖和20 mL電泳液加熱混合均勻，待混合液的溫度下降至40 ℃左右加入2 μL核酸染料混合均勻后倒入模具中，待凝膠凝固后放入電泳池中。取4 μL PCR產(chǎn)物與等量的londing buffer混合均勻，用移液槍轉(zhuǎn)移到電泳池的凝膠孔中，110 V電泳40 min，結(jié)束后使用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。保存條帶在1 500 bp左右的PCR產(chǎn)物，送至青島蔚來(lái)生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，得到菌株（K3菌）的16S rDNA擴(kuò)增片段序列。

應(yīng)用NCBI上的BLAST功能對(duì)所得到的序列進(jìn)行同源分析，并利用MEGA6軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.3 產(chǎn)纖維素酶性能測(cè)定。

①將K3菌分四區(qū)接種到纖維素酶測(cè)定培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)1 d。

②向培養(yǎng)基中加入適量的2%剛果紅溶液，染色15 min后，用蒸餾水和1 mol/L NaCl溶液進(jìn)行清洗，觀察菌種周?chē)袩o(wú)水解圈。若存在水解圈，測(cè)量水解圈的直徑。

③挑取菌種接種到產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基中，置搖床37 ℃培養(yǎng)1 d。12 000 r/min離心10 min。

④取2次0.5 mL上清液分別置于A、B管中，A管用50 ℃水浴鍋預(yù)熱，B管100 ℃滅活。取出，A、B管同時(shí)加入1.5 mL 1% CMC溶液，在50 ℃水浴鍋中，保溫30 min。取出，分別加入3 mL DNS溶液，沸水煮沸10 min，冷水降溫，540 nm 波長(zhǎng)測(cè)OD值。比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)出葡萄糖含量，計(jì)算纖維素酶酶活。

1.2.4 抑菌性能測(cè)定。

①用接種環(huán)挑取禾谷鐮刀菌接種到盛有無(wú)菌水的錐形瓶中，加入適量玻璃珠，搖晃振蕩使病原菌上的孢子分散在水中，過(guò)濾得到只含有孢子的懸浮液。

②制備PDA固體培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基冷卻但是在凝固之前加入孢子懸液，并放入直徑為10 mm牛津杯，凝固后取出牛津杯。

③對(duì)純化的解淀粉芽孢桿菌進(jìn)行液體培養(yǎng)，取菌液置于離心管中5 000 r/min離心10 min，取上清液并進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)?0 μL上清液依次加至牛津杯在PDA固體培養(yǎng)基中留下的孔中。在恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)3 d，觀察是否產(chǎn)生抑菌圈，若有測(cè)量抑菌圈的大小，并計(jì)算抑菌效價(jià)，抑菌效價(jià)=（抑菌圈直徑-牛津杯直徑）/發(fā)酵液體積×1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S rDNA同源性分析

分離得到的菌株（K3菌）的16S rDNA擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1 430 bp，如圖1所示。將獲得的序列片段利用NCBI的BLAST功能進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示篩選所得菌種與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）同源性高，初步判斷此菌種為解淀粉芽孢桿菌。

應(yīng)用MEGA6軟件進(jìn)行分析，建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。從系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2）可以看出，K3菌與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）在同一分支，說(shuō)明兩者之間存在的親緣關(guān)系最近，所以進(jìn)一步確定篩選出的K3菌為解淀粉芽孢桿菌。

2.2 產(chǎn)纖維素酶性能分析

纖維素酶測(cè)定培養(yǎng)基平板上接有菌種的4個(gè)分區(qū)盡管菌落大小不同，但是都有不同程度的水解圈。各個(gè)分區(qū)具體菌落直徑以及對(duì)應(yīng)的水解圈直徑如表1所示，雖然有著不同大小的水解圈，但是水解圈直徑與菌落直徑的差值在1.0～1.3，這說(shuō)明解淀粉芽孢桿菌是能夠產(chǎn)出一定量的纖維素酶。經(jīng)計(jì)算，該纖維素酶的平均酶活為26.86 U/mL。

2.3 抑制禾谷鐮刀菌活性分析

從抑制病原菌生長(zhǎng)的平板上可以明顯地觀察到滴加不同濃度解淀粉芽孢桿菌菌液的4個(gè)分區(qū)都產(chǎn)生了不同程度的抑菌圈，這說(shuō)明解淀粉芽孢桿菌能夠抑制病原菌禾谷鐮刀菌的生長(zhǎng)。但是由于所加入的上清液濃度變化不大，導(dǎo)致抑菌圈的大小變化不大。測(cè)量各濃度解淀粉芽孢桿菌菌液抑制禾谷鐮刀菌產(chǎn)生的抑菌圈直徑（表2），可以直觀地看到上清液的濃度越高，抑菌圈越大，抑菌效果越好，未經(jīng)稀釋的菌液抑菌效價(jià)可達(dá)到465 mm/mL。

3 討論

纖維素不僅是一種可再生資源，而且它在自然界中的分布也最為廣泛［ 14］，主要存在于植物的莖干、樹(shù)葉等部位。自然界中的植物、動(dòng)物、微生物都可以通過(guò)產(chǎn)生纖維素酶使纖維素參與到物質(zhì)循環(huán)中。在土壤中也存在多種能夠通過(guò)產(chǎn)酶的方式以雜草或者莖稈中存在的纖維素為底物分解成不同小分子物質(zhì)的微生物，提高土壤肥力。趙龍妹等［ 15］研究表明土壤中的巨大芽孢桿菌能夠產(chǎn)生纖維素酶，張功友等［ 16］從重樓的內(nèi)生菌中發(fā)現(xiàn)部分內(nèi)生菌具有產(chǎn)纖維素酶的功能。所以該研究測(cè)定從土壤中純化出來(lái)的解淀粉芽孢桿菌是否可以分泌纖維素酶來(lái)促進(jìn)纖維素的降解，結(jié)果表明該菌具有此能力。

由于化學(xué)藥劑給農(nóng)業(yè)帶來(lái)的弊端不斷顯現(xiàn)，人們更加關(guān)注農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全且具有防治功能的微生物［ 17］。芽孢桿菌是目前應(yīng)用比較廣泛并且作用比較強(qiáng)的菌種，因?yàn)樗兄敝硶r(shí)間短、適應(yīng)能力強(qiáng)、抑菌譜廣等優(yōu)點(diǎn)，可以通過(guò)抑制植物病原菌的生長(zhǎng)來(lái)減少植物的感染范圍，從而提高植物體的生存能力，也已被人們廣泛地運(yùn)用到各種農(nóng)業(yè)技術(shù)生產(chǎn)過(guò)程中以預(yù)防各種病蟲(chóng)害中［ 18］。解淀粉芽孢桿菌對(duì)我國(guó)許多地方存在的植物病害均有顯著的防治效果，王愛(ài)玉等［ 19］研究表明，解淀粉芽孢桿菌能夠有效提高棉花的產(chǎn)量，對(duì)立枯病和黃萎病有很好的防治效果。秦燕等［ 20］研究表明，解淀粉芽孢桿菌和哈茨木霉復(fù)配能夠通過(guò)抑制灰霉菌的分生孢子來(lái)防治草莓灰霉病。該研究采用抑菌圈法檢測(cè)解淀粉芽孢桿菌對(duì)病原菌禾谷鐮刀菌的抑制效果。由于所采用的牛津杯法導(dǎo)致部分結(jié)果存在誤差，一定濃度的解淀粉芽孢桿菌菌液能夠抑制病原菌的生長(zhǎng)。

根是植物體中的重要器官，土壤中的營(yíng)養(yǎng)成分就是通過(guò)它源源不斷地輸送到植物體內(nèi)的，那么對(duì)于植物的生長(zhǎng)，根部環(huán)境的改善尤為重要。由植物根際、土壤中根際微生物和周?chē)钠渌蜃訕?gòu)成的根際微生態(tài)系統(tǒng)［ 21］能夠很好地維持植物的生長(zhǎng)。生防菌大多也是參與到植物根際在生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮作用的。施加生防菌能夠在不造成環(huán)境污染等問(wèn)題的情況下，修復(fù)被破壞的土壤，提高根際微生物群落的多樣性［ 22］，進(jìn)而增強(qiáng)植株抗病蟲(chóng)害的能力。所以生防菌對(duì)于集約化農(nóng)業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)生的土壤問(wèn)題的解決有重要作用，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域有極大的發(fā)展空間。

生防菌主要是添加到微生物肥料中發(fā)揮作用，但是單一菌種會(huì)產(chǎn)生菌株功能退化的現(xiàn)象，從而導(dǎo)致效果不穩(wěn)定，并且由于菌種退化增大了感染雜菌的可能［ 23］。所以這需要考慮將不同的菌種或者化學(xué)試劑相互配合使用，來(lái)達(dá)到更加明顯的效果。例如，多種菌種相互影響能夠更好地降解土壤中的纖維素［ 24］。

生防菌在土壤中的定植能力不穩(wěn)定。生防菌在施加到土壤中后，需要一定的時(shí)間適應(yīng)新環(huán)境，進(jìn)行繁殖生長(zhǎng)。而在這一過(guò)程中有些生防菌由于與土壤中土著微生物的競(jìng)爭(zhēng)［ 25］，可能最終留在土壤中的微乎其微，這嚴(yán)重影響了生防菌發(fā)揮作用。對(duì)于這種生防菌可以在施用之前先采用農(nóng)家肥處理，豐富土壤中的有機(jī)質(zhì)［ 26］，以此來(lái)增強(qiáng)生防菌的定殖能力。

4 結(jié)論

解淀粉芽孢桿菌是構(gòu)成微生物肥料常用的微生物種類(lèi)，它可以通過(guò)不同的機(jī)制在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮作用。該研究從產(chǎn)酶和抑菌2個(gè)方面探討解淀粉芽孢桿菌的作用，結(jié)果表明，解淀粉芽孢桿菌不僅可以產(chǎn)生纖維素酶，還可以抑制病原菌禾谷鐮刀菌的生長(zhǎng)，具有較強(qiáng)的生防潛力。

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