齊少霞，楊棟寶，周 翼，武 倩，王曉東

(滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院麻醉二科,河北 滄州 061000)

肝癌具有高發(fā)病率和高病死率等特點(diǎn),大多患者確診時(shí)已到晚期,經(jīng)化學(xué)治療和免疫治療后仍有復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致預(yù)后不良,因此,亟需尋求新的治療措施[1]。肝炎與肝癌密切相關(guān),急慢性肝炎會(huì)促進(jìn)肝組織纖維化或肝硬化,進(jìn)而導(dǎo)致肝癌發(fā)生[2]。因此,從炎癥入手研究抗肝癌藥物具有重要意義。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng),促進(jìn)白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等促炎因子釋放[3-4]。丙泊酚是一種典型的麻醉劑,其可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡而在癌癥中發(fā)揮抗癌作用[5],但其抗癌作用機(jī)制尚不完全明確。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是一種上皮到間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,可賦予細(xì)胞遷移和侵襲特性。研究報(bào)道,EMT與腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān),還與肝癌患者的預(yù)后有關(guān);EMT還可促進(jìn)癌細(xì)胞產(chǎn)生促炎因子[6-8]?；诖?本研究旨在探討丙泊酚對LPS誘導(dǎo)的人肝癌MHCC97H細(xì)胞增殖、凋亡、黏附、侵襲和EMT的影響及機(jī)制,以期為丙泊酚在肝癌治療中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器

人肝癌MHCC97H細(xì)胞購自上海賽百慷生物技術(shù)股份有限公司;丙泊酚、LPS購自上海源葉生物科技有限公司,胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium,DMEM)購自美國Gibco公司,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測試劑盒購自杭州主諾生物技術(shù)有限公司,細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)購自上海翌圣生物科技有限公司, 5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2′-deoxyuridine,EdU)細(xì)胞增殖檢測試劑盒、人重組纖維連接蛋白(human recombinant fibronectin,rFN)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司,Hoechst 33258染色試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司,結(jié)晶紫水溶液、基質(zhì)膠購自北京索萊寶科技有限公司,放射免疫沉淀分析(radio immuno precipitation assay,RIPA)裂解液購自美國Abw公司,細(xì)胞周期素D1(Cyclin D1)、caspase-3、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、纖連蛋白(fibronectin,FN)、β-actin鼠抗人一抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗購自美國CST公司;311型CO2培養(yǎng)箱購自美國賽默飛公司,Multiskan SkyHigh型全波長酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司,DYCZ-24KF型四板垂直蛋白電泳儀購自北京六一生物科技有限公司,H4-20kr型低溫高速離心機(jī)購自湖南可成儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人肝癌MHCC97H細(xì)胞培養(yǎng)

將人肝癌MHCC97H細(xì)胞接種于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、體積分?jǐn)?shù)1%青-鏈霉素的DMEM中,置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞貼壁達(dá)80%以上時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代,取第4代對數(shù)期生長期MHCC97H細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞分組及處理

取對數(shù)生長期肝癌MHCC97H細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度至2×108L-1,接種至96孔板中,每孔100 μL;將肝癌MHCC97H細(xì)胞隨機(jī)分為對照組、LPS組、低劑量丙泊酚組、中劑量丙泊酚組和高劑量丙泊酚組,對照組細(xì)胞不做干預(yù),LPS組細(xì)胞滴加1 mg·L-1LPS干預(yù)48 h構(gòu)建體外炎癥模型,低劑量丙泊酚組、中劑量丙泊酚組和高劑量丙泊酚組細(xì)胞滴加1 mg·L-1LPS干預(yù)48 h后,分別加入12.5、25.0、50.0 μmol·L-1丙泊酚干預(yù)24 h,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,然后置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 ELISA法檢測MHCC97H細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β和TNF-α表達(dá)水平

采用ELISA法測定細(xì)胞上清液中IL-1β和TNF-α表達(dá)水平,具體措施:收集藥物干預(yù)24 h后各組細(xì)胞培養(yǎng)液,4 000 r·min-1離心20 min并收集上清液;分別將100 μL標(biāo)準(zhǔn)品及待測上清液加入酶標(biāo)板中,37 ℃孵育2 h,棄去上清液,然后加 100 μL 生物素化抗體工作液和酶結(jié)合物工作液,37 ℃ 孵育1 h;洗滌后加入90 μL底物溶液,37 ℃孵育 10 min,再加入50 μL終止液;于5 min內(nèi)測量各孔在450 nm處吸光度(absorbance,A)值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算IL-1β和TNF-α表達(dá)水平。

1.2.4 CCK-8法檢測MHCC97H細(xì)胞活力

取藥物干預(yù)24 h后各組細(xì)胞,加入CCK-8溶液10 μL,繼續(xù)孵育2 h,使用酶標(biāo)儀測定各孔在 450 nm 處A值,并計(jì)算細(xì)胞活力,細(xì)胞活力(%)=(實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)×100%。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,取均值。

1.2.5 EdU法檢測MHCC97H細(xì)胞的增殖率

將MHCC97H細(xì)胞傳代并鋪于12孔板中,分組和藥物處理同“1.2.2”項(xiàng)。取藥物干預(yù)24 h后各組細(xì)胞,進(jìn)行EdU處理,去除培養(yǎng)液,加入40 g·L-1多聚甲醛0.5 mL,固定細(xì)胞15 min,0.5 mL 體積分?jǐn)?shù)3%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)洗滌3次;用0.5 mL體積分?jǐn)?shù)0.3% TritonX-100室溫固定10 min去除BSA,再用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)洗滌3次;12孔板中每孔加200 μL Click反應(yīng)液,室溫避光孵育30 min,PBS洗滌3次去除Click反應(yīng)液;加入Hoechst 33342染液避光孵育10 min;PBS洗滌3次后裝片,熒光顯微鏡拍照,應(yīng)用Image J軟件處理圖片,以EdU陽性染色細(xì)胞(紅色)占總細(xì)胞(藍(lán)色)的百分比表示細(xì)胞增殖率。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,取均值。

1.2.6 Hoechst 33258染色法檢測MHCC97H細(xì)胞凋亡率

取藥物干預(yù)24 h后各組細(xì)胞,PBS洗滌細(xì)胞2次(每次5 min),加入新鮮配制的40 g·L-1多聚甲醛, 4 ℃固定10 min;洗滌3次,Hoechst 33258染色液(5 mg·L-1)染色10 min,洗滌3次,封固后熒光顯微鏡觀察,應(yīng)用Image J圖像分析軟件計(jì)算凋亡細(xì)胞數(shù),細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,取均值。

1.2.7 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)檢測MHCC97H細(xì)胞的黏附細(xì)胞數(shù)

以無血清培養(yǎng)液稀釋rFN,取10 μg·L-1的rFN膠鋪96孔板,于超凈工作臺中過夜風(fēng)干,風(fēng)干后用PBS洗滌3次,每次20 min,備用。取藥物干預(yù)24 h后各組細(xì)胞,用胰蛋白酶消化細(xì)胞,并制成單細(xì)胞懸液。取100 μL單細(xì)胞懸液(約1×104個(gè)細(xì)胞)加入到鋪膠的96孔板中,設(shè)3個(gè)復(fù)孔,放置在37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h,取出96孔板,吸取培養(yǎng)液,PBS洗滌3次,甲醇固定10 min,結(jié)晶紫染色 15 min,再用PBS洗滌3次,在50倍顯微鏡下觀察并計(jì)算黏附細(xì)胞數(shù)。

1.2.8 Transwell小室法檢測MHCC97H細(xì)胞的侵襲能力

將MHCC97H細(xì)胞傳代并鋪于24孔板中,分組和藥物處理同“1.2.2”項(xiàng)。取-20 ℃保存的基質(zhì)膠4 ℃過夜融化,用無FBS培養(yǎng)基稀釋基質(zhì)膠濃度至1 g·L-1,每個(gè)Transwell小室加入100 μL基質(zhì)膠稀釋液,置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 h,使其呈干膠狀。將Transwell小室放入24孔板中,在Transwell小室的上室中每孔加300 μL無血清的各組細(xì)胞懸液(1×108L-1),下室加入 600 μL 含有體積分?jǐn)?shù)10% FBS的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,取出Transwell小室,棄上清,棉簽擦去小室薄膜上層細(xì)胞,PBS清洗后,40 g·L-1多聚甲醇固定 30 min。晾干后,用結(jié)晶紫染色10 min,PBS清洗3次。在顯微鏡下觀察拍照,每孔隨機(jī)選5個(gè)不同區(qū)域,應(yīng)用Image J圖像分析軟件計(jì)算侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.2.9 Western blot法檢測MHCC97H細(xì)胞中Cyclin D1、caspase-3及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平

取藥物干預(yù)24 h后各組細(xì)胞,加入RIPA在冰上裂解,4 ℃ 12 000 r·min-1離心20 min,取上清進(jìn)行蛋白變性后,制膠,行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠電泳,300 mA恒流轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯膜,脫脂牛奶封閉2 h,然后加入E-cadherin(1:5 000)、N-cadherin(1:5 000)、Vimentin(1:20 000)、FN(1:6 000)、Cyclin D1(1:10 000)、caspase-3(1:2 000)及β-actin(1:5 000)一抗,4 ℃ 孵育過夜,用含吐溫-20的三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液(Tris buffered saline with tween 20,TBST)洗滌3次后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG二抗,孵育2 h,棄去液體,TBST洗滌3次,最后加顯影液,使用凝膠成像系統(tǒng)拍照,使用Image J軟件計(jì)算灰度值,以β-actin為內(nèi)參,計(jì)算蛋白相對表達(dá)量,以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值表示目的蛋白相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 5組MHCC97H細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β和TNF-α水平比較

5組MHCC97H細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β和TNF-α水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=21.282、165.223,P<0.001);LPS組和低劑量丙泊酚組MHCC97H細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β和TNF-α水平顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);中劑量丙泊酚組和高劑量丙泊酚組MHCC97H細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β水平與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);中劑量丙泊酚組和高劑量丙泊酚組MHCC97H細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α水平顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。低劑量丙泊酚組與LPS組MHCC97H細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β和TNF-α水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。中劑量丙泊酚組和高劑量丙泊酚組MHCC97H細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β和TNF-α表達(dá)水平顯著低于LPS組和低劑量丙泊酚組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);高劑量丙泊酚組MHCC97H細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α水平顯著低于中劑量丙泊酚組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);高劑量丙泊酚組與中劑量丙泊酚組MHCC97H細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表1。

表1 5組MHCC97H細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β和TNF-α水平比較Tab.1 Comparison of IL-1β and TNF-α levels in MHCC97H cell culture medium among the five groups

2.2 5組MHCC97H細(xì)胞活力比較

對照組、LPS組、低劑量丙泊酚組、中劑量丙泊酚組和高劑量丙泊酚組MHCC97H細(xì)胞活力分別為(100.00±6.44)%、(113.73±3.43)%、(100.94±5.48)%、(83.70±4.57)%和(72.04±3.64)%,5組MHCC97H細(xì)胞活力比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=33.939,P<0.001)。LPS組MHCC97H細(xì)胞活力顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);中劑量丙泊酚組和高劑量丙泊酚組 MHCC97H 細(xì)胞活力顯著低于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);低劑量丙泊酚組與對照組MHCC97H細(xì)胞活力比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);低劑量丙泊酚組、中劑量丙泊酚組和高劑量丙泊酚組MHCC97H細(xì)胞活力顯著低于LPS組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);中劑量丙泊酚組和高劑量丙泊酚組MHCC97H 細(xì)胞活力顯著低于低劑量丙泊酚組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);高劑量丙泊酚組與中劑量丙泊酚組MHCC97H細(xì)胞活力比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 5組MHCC97H細(xì)胞的增殖率比較

對照組、LPS組、低劑量丙泊酚組、中劑量丙泊酚組和高劑量丙泊酚組細(xì)胞增殖率分別為(45.84±4.07)%、(58.25±4.61)%、(44.81±7.10)%、(34.41±3.62)%、(26.53±1.94)%,5組細(xì)胞增殖率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=20.820,P<0.001)。LPS組MHCC97H細(xì)胞增殖率顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);中劑量丙泊酚組和高劑量丙泊酚組MHCC97H細(xì)胞增殖率顯著低于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);低劑量丙泊酚組與對照組MHCC97H細(xì)胞增殖率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);低劑量丙泊酚組、中劑量丙泊酚組和高劑量丙泊酚組MHCC97H細(xì)胞增殖率顯著低于LPS組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);中劑量丙泊酚組和高劑量丙泊酚組MHCC97H細(xì)胞增殖率顯著低于低劑量丙泊酚組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);高劑量丙泊酚組與中劑量丙泊酚組MHCC97H 細(xì)胞增殖率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見圖1。

A:對照組;B:LPS組;C:低劑量丙泊酚組;D:中劑量丙泊酚組;E:高劑量丙泊酚組。圖1 5組MHCC97H細(xì)胞增殖情況(×20)Fig.1 Proliferation of MHCC97H cells in the five groups(×20)

2.4 5組MHCC97H細(xì)胞的凋亡情況比較

對照組、LPS組、低劑量丙泊酚組、中劑量丙泊酚組和高劑量丙泊酚組細(xì)胞凋亡率分別為(8.08±0.55)%、(2.30±0.56)%、(7.64±0.77)%、(21.96±2.44)%和(32.93±3.38)%,5組細(xì)胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=127.789,P<0.001)。LPS組MHCC97H細(xì)胞凋亡率顯著低于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);中劑量丙泊酚組和高劑量丙泊酚組MHCC97H細(xì)胞凋亡率顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);低劑量丙泊酚組與對照組MHCC97H細(xì)胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);低劑量丙泊酚組、中劑量丙泊酚組和高劑量丙泊酚組MHCC97H細(xì)胞凋亡率顯著高于LPS組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);中劑量丙泊酚組和高劑量丙泊酚組MHCC97H細(xì)胞凋亡率顯著高于低劑量丙泊酚組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);高劑量丙泊酚組MHCC97H細(xì)胞凋亡率顯著高于中劑量丙泊酚組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.5 5組MHCC97H 細(xì)胞的黏附細(xì)胞數(shù)比較

對照組、LPS組、低劑量丙泊酚組、中劑量丙泊酚組和高劑量丙泊酚組黏附細(xì)胞數(shù)分別為(124.33±10.50)、(157.33±11.50)、(111.00±4.58)、(85.33±4.16)和(52.00±4.36)個(gè), 5組黏附細(xì)胞數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=79.242,P<0.001)。LPS組黏附細(xì)胞數(shù)顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);中劑量丙泊酚組、高劑量丙泊酚組黏附細(xì)胞數(shù)顯著低于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);低劑量丙泊酚組和對照組黏附細(xì)胞數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);低劑量丙泊酚組、中劑量丙泊酚組和高劑量丙泊酚組黏附細(xì)胞數(shù)顯著低于LPS組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);中劑量丙泊酚組和高劑量丙泊酚組黏附細(xì)胞數(shù)顯著低于低劑量丙泊酚組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);高劑量丙泊酚組黏附細(xì)胞數(shù)顯著低于中劑量丙泊酚組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見圖2。

A:對照組;B:LPS組;C:低劑量丙泊酚組;D:中劑量丙泊酚組;E:高劑量丙泊酚組。圖2 5組MHCC97H細(xì)胞黏附情況(×5)Fig.2 Adhesion of MHCC97H cells in the five groups(×5)

2.6 5組MHCC97H細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)比較

對照組、LPS組、低劑量丙泊酚組、中劑量丙泊酚組和高劑量丙泊酚組侵襲細(xì)胞數(shù)分別為50.33±4.16、64.33±4.93、40.33±3.06、30.33±3.06和11.67±2.08,5組侵襲細(xì)胞數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=92.402,P<0.001)。低劑量丙泊酚組、中劑量丙泊酚組和高劑量丙泊酚組侵襲細(xì)胞數(shù)顯著低于對照組和LPS組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);LPS組侵襲細(xì)胞數(shù)顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);中劑量丙泊酚組和高劑量丙泊酚組侵襲細(xì)胞數(shù)顯著低于低劑量丙泊酚組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);高劑量丙泊酚組侵襲細(xì)胞數(shù)顯著低于中劑量丙泊酚組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)果見圖3。

2.7 5組MHCC97H細(xì)胞中Cyclin D1及caspase-3水平比較

5組MHCC97H細(xì)胞中Cyclin D1和caspase-3水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=147.325、38.414,P<0.001)。LPS組和低劑量丙泊酚組MHCC97H細(xì)胞中Cyclin D1水平顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);中劑量丙泊酚組和高劑量丙泊酚組中MHCC97H細(xì)胞Cyclin D1水平顯著低于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);低劑量丙泊酚組、中劑量丙泊酚組和高劑量丙泊酚組MHCC97H細(xì)胞中Cyclin D1水平顯著低于LPS組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);中劑量丙泊酚組和高劑量丙泊酚組MHCC97H細(xì)胞中Cyclin D1水平顯著低于低劑量丙泊酚組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。低劑量丙泊酚組與對照組MHCC97H細(xì)胞中caspase-3水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);LPS組MHCC97H細(xì)胞中caspase-3水平顯著低于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);中劑量丙泊酚組和高劑量丙泊酚組MHCC97H細(xì)胞中caspase-3水平顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);低劑量丙泊酚組、中劑量丙泊酚組和高劑量丙泊酚組MHCC97H細(xì)胞中caspase-3水平顯著高于LPS組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);中劑量丙泊酚組和高劑量丙泊酚組MHCC97H細(xì)胞中caspase-3水平顯著高于低劑量丙泊酚組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);中劑量丙泊酚組與高劑量丙泊酚組MHCC97H 細(xì)胞中Cyclin D1和caspase-3水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見圖4和表2。

表2 5組MHCC97H細(xì)胞中Cyclin D1及caspase-3水平比較Tab.2 Comparison of Cyclin D1 and caspase-3 levels in MHCC97H cells among the five groups

2.8 5組MHCC97H細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和FN水平比較

5組MHCC97H細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和FN水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=124.346、40.540、30.076、64.220,P<0.001)。LPS組和低劑量丙泊酚組MHCC97H細(xì)胞中E-cadherin水平顯著低于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);中劑量丙泊酚組和高劑量丙泊酚組MHCC97H 細(xì)胞中E-cadherin水平顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);低劑量丙泊酚組、中劑量丙泊酚組和高劑量丙泊酚組MHCC97H細(xì)胞中E-cadherin水平顯著高于LPS組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);中劑量丙泊酚組和高劑量丙泊酚組MHCC97H細(xì)胞中E-cadherin水平顯著高于低劑量丙泊酚組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。低劑量丙泊酚組N-cadherin水平和中劑量丙泊酚組FN蛋白表達(dá)水平與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);LPS組MHCC97H細(xì)胞中N-cadherin、Vimentin、FN水平及低劑量丙泊酚組中FN水平顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);中劑量丙泊酚組和高劑量丙泊酚組MHCC97H細(xì)胞中N-cadherin水平顯著低于對照組,低劑量丙泊酚組、中劑量丙泊酚組和高劑量丙泊酚組 MHCC97H細(xì)胞中Vimentin水平顯著低于對照組,高劑量丙泊酚組FN水平顯著低于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);低劑量丙泊酚組、中劑量丙泊酚組和高劑量丙泊酚組MHCC97H 細(xì)胞中N-cadherin、Vimentin和FN水平顯著低于LPS組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);中劑量丙泊酚組和高劑量丙泊酚組MHCC97H細(xì)胞中N-cadherin、Vimentin和FN水平顯著低于低劑量丙泊酚組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);中劑量丙泊酚組和高劑量丙泊酚組MHCC97H細(xì)胞中Vimentin水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);高劑量丙泊酚組MHCC97H細(xì)胞中E-cadherin水平顯著高于中劑量丙泊酚組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);高劑量丙泊酚組MHCC97H細(xì)胞中N-cadherin和FN水平顯著低于中劑量丙泊酚組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表3和圖5。

1:對照組;2:LPS組;3:低劑量丙泊酚組;4:中劑量丙泊酚組;5:高劑量丙泊酚組。圖5 5組MHCC97H細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、FN蛋白表達(dá)(Western blot)Fig.5 Expressions of E-cadherin,N-cadherin,Vimentin and FN proteins in MHCC97H cells in the five groups(Western blot)

表3 5組MHCC97H細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和FN蛋白水平比較Tab.3 Comparison of E-cadherin,N-cadherin,Vimentin and FN protein levels in MHCC97H cells among the five groups

3 討論

肝癌是一種常見的惡性腫瘤,具有較高的復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率,預(yù)后不佳[9]。肝癌與肝炎密切相關(guān),長期炎癥可引起肝硬化和肝癌,肝癌患者大都伴有全身系統(tǒng)性炎癥,炎癥反應(yīng)在肝癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中有促進(jìn)作用,涉及許多生物學(xué)功能,如黏附、侵襲及EMT[10]。因此,尋找新的治療手段改善癌細(xì)胞炎癥對改善肝癌患者的預(yù)后具有重要意義。丙泊酚是外科手術(shù)中廣泛使用的靜脈麻醉劑之一,研究發(fā)現(xiàn),其可參與許多癌癥的病理生理過程,包括在各種癌癥中的抗腫瘤作用和輕微的促癌作用[11]。已有研究報(bào)道,丙泊酚具有一定的抗肝癌作用[12],但其在與炎癥相關(guān)的肝癌中的抗癌作用及機(jī)制尚不明確。因此,本研究以肝癌MHCC97H細(xì)胞為研究對象,采用細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法觀察丙泊酚對MHCC97H細(xì)胞活力、增殖、凋亡、黏附、侵襲及炎癥因子IL-1β和TNF-α水平的影響。

本研究結(jié)果顯示,LPS組MHCC97H細(xì)胞中IL-1β、TNF-α水平、細(xì)胞活力、細(xì)胞增殖率、黏附細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)高于對照組,細(xì)胞凋亡率低于對照組,中、高劑量丙泊酚組MHCC97H細(xì)胞IL-1β、TNF-α水平、細(xì)胞活力、細(xì)胞增殖率、黏附細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)低于LPS組和低劑量丙泊酚組,細(xì)胞凋亡率高于LPS組和低劑量丙泊酚組,高劑量丙泊酚組MHCC97H 細(xì)胞中TNF-α表達(dá)水平、黏附細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)低于中劑量丙泊酚組,細(xì)胞凋亡率高于中劑量丙泊酚組,高劑量丙泊酚組與中劑量丙泊酚組MHCC97H細(xì)胞活力、細(xì)胞增殖率和IL-1β表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;說明,LPS誘導(dǎo)肝癌炎癥模型構(gòu)建成功,中、高劑量丙泊酚對LPS誘導(dǎo)的肝癌MHCC97H細(xì)胞炎癥因子IL-1β和TNF-α水平、細(xì)胞活力、增殖、黏附、侵襲有顯著抑制作用,對細(xì)胞凋亡有促進(jìn)作用,且呈一定濃度依賴性;提示丙泊酚在肝癌的治療中有良好的醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景。

Cyclin D1是細(xì)胞增殖過程中的標(biāo)志蛋白,以細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase 4,CDK)4和CDK6變構(gòu)調(diào)節(jié)劑的作用調(diào)節(jié)從G1期到S期的轉(zhuǎn)變,其高表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增殖[13]。細(xì)胞凋亡是一種多種因素誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡的生物學(xué)過程,caspase-3是執(zhí)行細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子,活化后切割多種底物,調(diào)節(jié)有絲分裂后神經(jīng)元和神經(jīng)前體細(xì)胞中的程序性細(xì)胞死亡,在細(xì)胞凋亡中起重要作用[14]。本研究結(jié)果顯示,LPS組Cyclin D1蛋白表達(dá)水平顯著高于對照組,caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著低于對照組;中劑量丙泊酚組和高劑量丙泊酚組Cyclin D1蛋白表達(dá)水平顯著低于LPS組和低劑量丙泊酚組,caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著高于LPS組和低劑量丙泊酚組;中劑量丙泊酚組與高劑量丙泊酚組MHCC97H細(xì)胞Cyclin D1和caspase-3蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;說明,中、高劑量丙泊酚對LPS誘導(dǎo)的MHCC97H細(xì)胞中增殖蛋白Cyclin D1具有抑制作用,對凋亡蛋白caspase-3具有促進(jìn)作用,且呈一定劑量依賴性;提示丙泊酚可能通過抑制Cyclin D1蛋白表達(dá)、促進(jìn)caspase-3蛋白表達(dá)而發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的生物學(xué)作用。

EMT是從上皮細(xì)胞到間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的一個(gè)過程,是癌癥轉(zhuǎn)移機(jī)制中研究的一個(gè)重點(diǎn),EMT變化包括上皮細(xì)胞失去頂端-基底極性,獲得較高的運(yùn)動(dòng)性,形成侵襲-轉(zhuǎn)移[15],EMT與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[16]。有研究報(bào)道,丙泊酚可抑制缺氧誘導(dǎo)的食管癌細(xì)胞遷移、侵襲和EMT[17],抑制宮頸癌細(xì)胞的生長和侵襲[18],且其可以通過下調(diào)miR-21的表達(dá)來抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和EMT[19],但關(guān)于丙泊酚在LPS誘導(dǎo)肝癌中調(diào)控EMT的作用機(jī)制尚未可知。本研究結(jié)果顯示,LPS組N-cadherin、Vimentin和FN蛋白表達(dá)水平高于對照組,E-cadherin蛋白表達(dá)水平低于對照組;中劑量丙泊酚組和高劑量丙泊酚組N-cadherin、Vimentin和FN蛋白表達(dá)水平低于LPS組和低劑量丙泊酚組,E-cadherin蛋白表達(dá)水平高于LPS組和低劑量丙泊酚組;高劑量丙泊酚組MHCC97H細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著高于中劑量丙泊酚組,而N-cadherin和FN蛋白表達(dá)水平顯著低于中劑量丙泊酚組,中劑量丙泊酚組和高劑量丙泊酚組MHCC97H細(xì)胞Vimentin蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;說明,LPS可降低 MHCC97H 細(xì)胞上皮標(biāo)志物 E-cadherin 表達(dá)水平,促進(jìn)間充質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin和FN的表達(dá)水平,而丙泊酚促進(jìn)了E-cadherin蛋白表達(dá),抑制了N-cadherin、Vimentin和FN蛋白表達(dá),且呈一定劑量依賴性;這提示,丙泊酚可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的MHCC97H 細(xì)胞EMT進(jìn)程。有研究表明,雙氫青蒿素可抑制肝癌細(xì)胞生長,促進(jìn)其凋亡,降低其遷移及侵襲能力,其機(jī)制可能為雙氫青蒿素抑制肝癌細(xì)胞EMT進(jìn)程[20];另有研究報(bào)道,阿帕替尼可抑制SMMC-7721細(xì)胞由上皮表型向間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化,進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[21],炎癥微環(huán)境下介導(dǎo)EMT能促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移[22];以上研究結(jié)果與本研究結(jié)果相似,證實(shí)丙泊酚可通過抑制EMT的進(jìn)程來抑制LPS誘導(dǎo)的MHCC97H細(xì)胞增殖、黏附、侵襲及炎癥,促進(jìn)其凋亡。

4 結(jié)論

丙泊酚可抑制LPS誘導(dǎo)的人肝癌MHCC97H細(xì)胞增殖、黏附、侵襲及炎癥,促進(jìn)凋亡,其作用機(jī)制可能與抑制EMT進(jìn)程有關(guān),提示丙泊酚對肝癌的治療有一定積極效果。但是本研究僅在體外實(shí)驗(yàn)證明了丙泊酚可抑制LPS誘導(dǎo)的人肝癌MHCC97H細(xì)胞的惡性行為,下一步將在動(dòng)物模型探討丙泊酚的作用,為丙泊酚在臨床肝癌治療中的應(yīng)用提供更為全面的理論依據(jù)。