姜敬維，李玟君，李建湘，宋青云，李玉蝶，汪海燕，李瑋*

（1.陸軍勤務(wù)學(xué)院，重慶 401331；2.湖北工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430068）

我國(guó)高原地區(qū)面積遼闊，約占土地面積1/6[1]。高原低氧環(huán)境會(huì)造成人體頭痛、胸悶，甚至產(chǎn)生高原肺水腫等缺氧應(yīng)激及疲勞應(yīng)激反應(yīng)[2]。相關(guān)研究表明，在高原缺氧環(huán)境下，官兵的運(yùn)動(dòng)能力和軍事作業(yè)效能比平原地區(qū)下降20%～40%，顯著影響高原部隊(duì)的戰(zhàn)斗力[3]。開(kāi)發(fā)高原功能食品、預(yù)防或減輕高原反應(yīng)、增強(qiáng)高原適應(yīng)力并提高高原地區(qū)部隊(duì)作戰(zhàn)能力，對(duì)有效維護(hù)高原地區(qū)軍民身體健康，提升我國(guó)高原地區(qū)經(jīng)濟(jì)競(jìng)爭(zhēng)力具有積極的影響。

β-葡聚糖廣泛存在于大麥和青稞等麥科作物中，在青稞胚芽中的含量尤其豐富[4-5]。目前針對(duì)青稞β-葡聚糖的研究主要集中在降血糖[6]、降血脂[7]、膽固醇調(diào)節(jié)機(jī)制[8-9]及應(yīng)用等方面，青稞β-葡聚糖干預(yù)缺氧應(yīng)激及疲勞應(yīng)激的相關(guān)研究較少。本文以產(chǎn)生胞外多糖的乳酸菌—植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，LP）、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus，LB）、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus，LR）分別對(duì)青稞進(jìn)行發(fā)酵，研究乳酸菌對(duì)青稞中提取出的β-葡聚糖的加工特性的影響，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)建立抗氧化抗疲勞復(fù)合應(yīng)激模型，研究不同乳酸菌發(fā)酵制備的青稞β-葡聚糖對(duì)小鼠抗缺氧疲勞功效的影響，為開(kāi)發(fā)高原功能食品、服務(wù)高原地區(qū)軍民提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與設(shè)備

青稞粉（昆侖17 號(hào)）：產(chǎn)自西藏自治區(qū)昌都市；昆明小鼠（雄性，SPF 級(jí)）：華中科技大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，SCXK（鄂）2016-0009，體質(zhì)量（20.4±2.2）g。植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌、鼠李糖乳桿菌：湖北工業(yè)大學(xué)保藏；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測(cè)試劑盒（BC0175）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒（BC0025）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）檢測(cè)試劑盒（BC1535）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測(cè)試劑盒（BC0685）、乳酸（lactic acid，LA）檢測(cè)試劑盒（BC2235）：南京建成生物工程研究所；鈉石灰:武漢鴻?？翟噭┯邢薰荆黄咸烟菢?biāo)準(zhǔn)品、耐高溫α-淀粉酶（380 U/mg）：阿拉丁試劑公司；其他試劑均為分析純。

X3R 型高速冷凍離心機(jī)：美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；DHR-1 流變儀：美國(guó)TA 儀器公司；1260 Infinity II 高效液相色譜儀：美國(guó)Agilent 科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

參考陳瑜等[10]和譚翠[11]的方法，稱(chēng)取一定量青稞粉于500 mL 燒杯中，加入體積比為1∶2 蒸餾水，并在室溫25 ℃下浸泡24 h。用紗布瀝干水分后，置于蒸鍋中常壓下蒸煮20 min，并分裝于250 mL 三角瓶中，冷卻后分別接入植物乳桿菌（LP）、保加利亞乳桿菌（LB）和鼠李糖乳桿菌（LR），選擇接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間為單因素，以β-葡聚糖的提取率為試驗(yàn)指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）進(jìn)行正交試驗(yàn)，具體因素與水平如表1 所示。以3 種乳酸菌最優(yōu)工藝得到的純化后青稞β-葡聚糖為樣品（以LPG、LBG、LRG 表示）進(jìn)行分析測(cè)試，以未發(fā)酵的青稞提取的β-葡聚糖做對(duì)照組（NFG）。

表1 因素與水平Table 1 Factors and levels

1.2.2 青稞β-葡聚糖的提取

參考謝昊宇等[12]和賈瑩[13]的方法，青稞全粉加稀堿提取2 次，收集上清液（4 000 r/min 離心15 min），耐高溫α-淀粉酶除淀粉，等電點(diǎn)法去除蛋白質(zhì)（調(diào)節(jié)pH值至4.5，95 ℃水浴靜置30 min，收集上清液，醇沉（真空減壓濃縮，緩慢加入乙醇溶液使最終濃度為60%，4 ℃下靜置20 h，離心收集沉淀，沉淀復(fù)溶，冷凍干燥得到青稞β-葡聚糖粗多糖。

1.2.3 青稞β-葡聚糖的純化

取10 mg/mL 粗多糖溶液50 mL，緩慢加入27 g 硫酸銨，邊加邊攪拌后置于4 ℃條件下，靜置10 h；4 000 r/min離心10 min，收集沉淀；將沉淀溶于20 mL 純水中，加熱溶解，冷卻后，緩慢加入60 mL 無(wú)水乙醇，邊加邊攪拌，使各溶液體系中乙醇最終濃度達(dá)到75%，置于4 ℃冰箱靜置10 h；重復(fù)離心3 次、收集沉淀、純水溶解，加熱溶解、冷卻后，將溶液采用截留分子量為3 500 Da的有機(jī)膜進(jìn)行處理，并按2 h/次的速率更換外層水溶液，直至樣品溶液與0.5 mol/L BaCl2溶液滴加混合時(shí)，不產(chǎn)生任何沉淀；將樣液于12 000 r/min 下高速離心20 min，去除溶液中可能存在的不溶性小顆粒，收集上清液，濃縮后進(jìn)行冷凍干燥得青稞β-葡聚糖純品。

1.2.4 分子量測(cè)定

配制濃度為1 mg/mL 的β-葡聚糖，過(guò)0.22 μm 水相膜待測(cè)，采用高效液相凝膠色譜聯(lián)合折光示差和多角度光散射檢測(cè)器測(cè)定其重均分子量（Mw）、數(shù)均分子量（Mn）、分子量分布系數(shù)（Mw/Mn）。色譜柱：OHpak SB-806 M HQ 和SB-805 HQ，8 mm×30 cm；流動(dòng)相：0.1 mol/L NaCl 溶液，流速：0.5 mL/min，柱溫：25 ℃；溶液的示差折光指數(shù)增量為0.138 mL/g；進(jìn)樣量：20 μL。

1.2.5 青稞β-葡聚糖的加工特性

青稞β-葡聚糖的溶解性、起泡能力、起泡穩(wěn)定性、乳化穩(wěn)定性和乳化性參考賈瑩[13]的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.6 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

將小鼠隨機(jī)分為5 組，每組18 只并編號(hào)，供給實(shí)驗(yàn)食物及飲水。環(huán)境溫度（25±2）℃，相對(duì)濕度（70±2）%。其中4 組每天固定時(shí)間以300 mg/（kg·d）的劑量將NFG、LPG、LBG、LRG 水溶液連續(xù)給藥7 d，每天1 次，每次0.4 mL；另一組為對(duì)照組，給予等體積生理鹽水，記為空白組（CK），每組數(shù)據(jù)取6 次平行均值。

1.2.6.1 耐缺氧實(shí)驗(yàn)

末次給藥后1 h，每組取6 只小鼠進(jìn)行常壓密閉缺氧試驗(yàn)。常壓密閉缺氧試驗(yàn)容器為40cm×40 cm×40 cm玻璃真空干燥器，內(nèi)置豎隔板分成兩室，底部放置鈉石灰，每次放入2 只小鼠，分別進(jìn)入一室，加蓋密封。記錄兩只小鼠的放置時(shí)間，以及小鼠劇烈抽搐、呼吸停止時(shí)間。每次試驗(yàn)結(jié)束，更換鈉石灰，記錄小鼠的存活時(shí)間。

1.2.6.2 耐疲勞實(shí)驗(yàn)

末次給藥后1 h，每組取6 只小鼠進(jìn)行游泳（耐疲勞）試驗(yàn)。小鼠稱(chēng)重，記錄體質(zhì)量，將小鼠尾部固定體質(zhì)量4%的鉛片，置入65 cm×50 cm×40 cm 池中進(jìn)行游泳實(shí)驗(yàn)，水溫控制在（28±1）℃，水深30 cm，并記錄每只小鼠的游泳時(shí)間，以頭部沉沒(méi)水中6 s 為試驗(yàn)終點(diǎn)，記錄小鼠的存活時(shí)間。

1.2.6.3 指標(biāo)檢測(cè)

末次給藥后1 h，將小鼠置入游泳箱內(nèi)進(jìn)行不負(fù)重游泳訓(xùn)練，時(shí)間為60 min，水溫控制在（28±1）℃；游泳后30 min 進(jìn)行眼球取血，按照試劑盒的使用說(shuō)明測(cè)定小鼠體內(nèi)LDH 和SOD 的活性以及MDA、LA 和BUN的含量。

將小鼠脫頸處死，取其肝臟，使用生理鹽水進(jìn)行清洗，并用濾紙除濕，按照試劑盒說(shuō)明，測(cè)定肝臟內(nèi)肝糖原含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

對(duì)所測(cè)得數(shù)據(jù)使用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析，并采用Origin 2019 計(jì)算機(jī)統(tǒng)計(jì)軟件處理，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t-檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，顯著性水平取0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同乳酸菌發(fā)酵對(duì)青稞β-葡聚糖提取率的影響

試驗(yàn)結(jié)果如表2 所示。

表2 LP、LB、LR 發(fā)酵提取β-葡聚糖正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental results of orthogonal extraction of β-glucan by LP，LB and LR fermentation

由表2 可知，植物乳桿菌（LP）提取青稞β-葡聚糖的最佳組合為A2B1C3，即接種量為5%，發(fā)酵時(shí)間為12 h，發(fā)酵溫度為32 ℃，提取得到的β-葡聚糖含量為（5.07±0.19）%；保加利亞乳桿菌（LB）提取青稞β-葡聚糖的最佳工藝組合為A3B3C2，即接種量為7%，發(fā)酵時(shí)間為36 h，發(fā)酵溫度為30 ℃，提取得到的β-葡聚糖含量為（5.14±0.22）%；鼠李糖乳桿菌（LR）提取青稞β-葡聚糖的最佳工藝組合為A3B2C1，即接種量為7%，發(fā)酵時(shí)間為24 h，發(fā)酵溫度為28 ℃，提取得到的β-葡聚糖含量為（5.05±0.16）%。

2.2 不同乳酸菌發(fā)酵對(duì)青稞β-葡聚糖分子量分布的影響

采用高效液相凝膠色譜聯(lián)合折光示差和多角度光散射檢測(cè)器測(cè)定發(fā)酵前后β-葡聚糖粗提物的重均分子量（Mw）、數(shù)均分子量（Mn）和分子量分布系數(shù)（Mw/Mn），結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同乳酸菌發(fā)酵提取β-葡聚糖的分子量參數(shù)Table 3 Molecular parameters of β-glucan extracted by different lactic acid bacterias

由表3 可知，LPG 和LBG 的Mw/Mn 均高于NFG，說(shuō)明植物乳桿菌和保加利亞乳酸菌發(fā)酵能顯著改善青稞β-葡聚糖的分子量分布。LRG 的Mw/Mn 最小，為1.00，說(shuō)明鼠李糖乳桿菌制得的青稞β-葡聚糖中多糖均一性較高。

在發(fā)酵過(guò)程中，乳酸菌的酶解反應(yīng)可能會(huì)促進(jìn)天然青稞β-葡聚糖分子量的降解[9-10]。研究表明β-葡聚糖分子量的降低與微生物發(fā)酵關(guān)系密切。由于發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌的酶解反應(yīng)促使β-葡聚糖聚合物分子鏈斷裂，從而導(dǎo)致樣品分子量的降低[11-12]。

2.3 不同乳酸菌發(fā)酵對(duì)青稞β-葡聚糖加工特性的影響

天然多糖的起泡性能和乳化性能與多糖自身攜帶的親水基團(tuán)與疏水基團(tuán)有關(guān)[13-17]，其中良好的起泡性能和乳化性能可豐富食品加工體系的多樣性[18]。β-葡聚糖的溶解性、起泡性和乳化性與其來(lái)源、分子量、結(jié)構(gòu)、濃度等因素有關(guān)，是衡量其加工特性的重要指標(biāo)[19-20]。青稞β-葡聚糖的溶解度、起泡性和乳化性等理化性質(zhì)如圖1 所示。

圖1 乳酸菌發(fā)酵提取β-葡聚糖的加工特性參數(shù)Fig.1 The parameters of β -glucan extracted by lactic acid bacteria

如圖1 所示，LPG、LBG、LRG 與NFG 相比均具有良好的溶解性、乳化性和起泡穩(wěn)定性，LBG 的溶解性和起泡能力均高于LPG、LRG 和NFG，LRG 的起泡穩(wěn)定性高于LPG、LBG 和NFG，LPG、LBG 和LRG 的乳化性均顯著高于NFG，LPG、LBG 和LRG 的乳化穩(wěn)定性與NFG 相比無(wú)顯著差異。

2.4 發(fā)酵工藝對(duì)青稞β-葡聚糖耐缺氧和抗疲勞功效的影響

不同乳酸菌發(fā)酵提取β-葡聚糖對(duì)小鼠耐缺氧、抗疲勞功效的影響如圖2 所示。

圖2 乳酸菌發(fā)酵提取β-葡聚糖對(duì)小鼠缺氧存活時(shí)間和游泳存活時(shí)間的影響Fig.2 Effects of lactic acid bacteria fermentation extraction of βglucan on mouse survival time

由圖2 可知，喂食β-葡聚糖組與CK 組相比，明顯延長(zhǎng)密閉缺氧小鼠的存活時(shí)間，證明β-葡聚糖具有耐缺氧的功效，其中LPG、LBG 和LRG 與NFG 相比，密閉缺氧存活時(shí)間延長(zhǎng)了26.6%、42.3%和36.4%，延長(zhǎng)效果均顯著，說(shuō)明乳酸菌發(fā)酵能顯著提升β-葡聚糖小鼠耐缺氧的存活時(shí)間。喂食β-葡聚糖組與CK 組相比，明顯延長(zhǎng)游泳小鼠的存活時(shí)間，證明β-葡聚糖具有抗疲勞的功效，其中LPG、LBG 和LRG 與NFG 相比缺氧存活時(shí)間延長(zhǎng)了22.6%、40.3%和42.4%，證明乳酸菌能顯著提升β-葡聚糖的抗疲勞效果。

2.5 青稞β-葡聚糖對(duì)小鼠缺氧、疲勞應(yīng)激生理指標(biāo)的影響

小鼠抗疲勞能力與肝糖原含量直接相關(guān)，乳酸脫氫酶（LDH）水平的高低直接反映體內(nèi)持續(xù)運(yùn)動(dòng)時(shí)的代謝能力，而SOD 有助于清除體內(nèi)產(chǎn)生的自由基；LA、BUN、MDA 與運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的代謝廢物有關(guān)[21-23]。不同乳酸菌發(fā)酵取得的β-葡聚糖對(duì)小鼠乳酸LDH、LA、肝糖原等指標(biāo)的影響如表4 所示。

表4 乳酸菌發(fā)酵提取β-葡聚糖對(duì)小鼠生理指標(biāo)的影響Table 4 Effects of β-glucan extracted by lactic acid bacteria fermentation on physiological indexes of mice

由表4 可知，LPG、LBG、LRG、NFG 與CK 相比，乳酸脫氫酶的含量明顯提升，證明β-葡聚糖能提升小鼠體內(nèi)LDH 的含量。其中LBG 組是CK、NFG 組的2.07 倍和1.38 倍，且高于LPG 和LRG 組16.74%和15.24%。LPG、LBG、LRG、NFG 與CK 相比，血尿素氮的含量明顯降低，證明β-葡聚糖能降低小鼠體內(nèi)BUN 的含量。LPG、LBG、LRG 和CK 相比，肝糖原的含量明顯升高，其中LRG 組是CK、NFG 組的1.54 和1.31 倍，LRG 組LA 含量比CK 組降低38.76%。LPG、LBG、LRG、NFG與CK 相比，SOD 的含量明顯提升，其中LBG 與CK、NFG 相比提高了124.93%和55.20%，LRG 與CK、NFG相比提高了77.54%和22.50%。LPG、LBG、LRG、NFG與CK 相比，MDA 的含量降低。證明β-葡聚糖能降低小鼠體內(nèi)MDA 的含量，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后得到的β-葡聚糖比未發(fā)酵得到的β-葡聚糖的MDA 含量要低。其中LBG 組最低。

3 結(jié)論

植物乳桿菌和保加利亞乳酸菌發(fā)酵能顯著改善青稞β-葡聚糖的分子量分布鼠李糖乳桿菌制得的青稞β-葡聚糖中多糖均一性較高，保加利亞乳桿菌發(fā)酵后得到的β-葡聚糖起泡能力和溶解性都顯著高于植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌及未發(fā)酵組，而鼠李糖乳桿菌發(fā)酵得到的β-葡聚糖起泡穩(wěn)定性顯著高于植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌和未發(fā)酵組。

乳酸菌發(fā)酵能顯著提升β-葡聚糖小鼠耐缺氧的存活時(shí)間和游泳存活時(shí)間，添加LBG 的鼠糧組的小鼠乳酸脫氫酶（LDH）含量均高于LPG 和LRG 組，添加LRG 的鼠糧組血尿素氮的含量遠(yuǎn)低于普通鼠糧組和空白組，添加LPG 的鼠糧組肝糖原的含量遠(yuǎn)高于普通鼠糧組和空白組，添加LBG 的鼠糧組能顯著降低小鼠體內(nèi)MDA、提升SOD。LRG 對(duì)小鼠血乳酸含量的影響比其他組降低更顯著。

綜上，3 種乳酸菌發(fā)酵后得到的青稞β-葡聚糖均能有效改善小鼠耐缺氧和抗疲勞的效果。這種改善效果可能與β-葡聚糖的分子量大小高度相關(guān)，植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌和鼠李糖乳桿菌提升β-葡聚糖抗疲勞效果無(wú)顯著性差異；植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌提升β-葡聚糖耐缺氧效果無(wú)顯著性差異。