陳珊 朱俊德 趙雪 劉若靜 龍婷婷

貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室（貴陽 550025）

腦卒中作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)腦血流循環(huán)障礙性疾病，是世界上公認(rèn)的第三大致死性疾?。?］。目前臨床常用的溶栓藥物治療僅在腦卒中后最初4～4.5 h 有效［2］，隨著近年來神經(jīng)干細(xì)胞治療的興起，為臨床治療腦卒中這類難治性疾病提供了新的希望。大量證據(jù)表明NSCs 通過旁分泌方式釋放外泌體（exosomes，Exos）發(fā)揮著重要的神經(jīng)保護(hù)作用［3］，Exos 具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征和生物學(xué)功能，直徑約30～200 nm。給予嚙齒動(dòng)物外源神經(jīng)干細(xì)胞來源的外泌體可以維持免疫豁免權(quán)，通過蛋白質(zhì)和遺傳信息交換的方式，促進(jìn)受體動(dòng)物免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)、組織損傷的修復(fù)、抑制炎癥反應(yīng)等［4］。轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）可激活星形膠質(zhì)細(xì)胞表面相關(guān)受體，影響星形膠質(zhì)細(xì)胞增生過程，反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生是慢性和廣泛性中樞神經(jīng)系統(tǒng)獲得性免疫炎癥的顯著特征［5］。目前已知NSCs 來源的外泌體（neural stem cell-derived exosomes，NSC-Exos）在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療過程中具有保護(hù)作用，但其在MCAO損傷大鼠中對星形膠質(zhì)細(xì)胞TGF-β1 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及相關(guān)炎癥因子的影響尚不明確，因此本研究旨在探討這一變化，以期為NSC-Exos 治療缺血性腦卒中提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級雄性SD 大鼠40 只，體質(zhì)量250～280 g，購自貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號：SYXK（黔）2018-0001，倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（編號：2200094）。環(huán)境溫度（22±0.5）℃，濕度55%～60%，12 h 周期晝夜更替，大鼠自由攝取食物和水。

1.1.2 主要試劑兔抗大鼠膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）、微管相關(guān)蛋白2（MAP-2）抗體，Alexa Fluor 488 標(biāo)記羊抗兔、Alexa Fluor 555 標(biāo)記羊抗兔二抗，DAPI 染色液購于美國CST 公司；外泌體紅色熒光標(biāo)記染料PKH26 購自上海宇玫博生物公司；兔抗大鼠白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）抗體購自美國Peprotech 公司；TGF-β1 抗體，β-actin 抗體，過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗及蛋白裂解液RIPA 購自武漢博士德生物公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組采用隨機(jī)數(shù)字表法將40 只SD大鼠分為Sham 組、MCAO 組、磷酸緩沖鹽溶液對照（PBS）組和NSC-Exos 治療組。Sham 組僅分離右側(cè)頸部動(dòng)脈，不予液體注射；MCAO 組行MCAO 模型手術(shù)，缺血90 min 后再灌注，不予液體注射；PBS組行MCAO 手術(shù)，缺血90 min 后再灌注，大鼠清醒2 h 后，右側(cè)側(cè)腦室注射10 μL PBS 緩沖液；NSCExos 治療組大鼠行MCAO 手術(shù)，缺血90 min 后再灌注，大鼠清醒2 h 后，右側(cè)側(cè)腦室注射10 μL 含10 μg NSC-Exos 的PBS 混懸液［6-7］。

1.2.2 右側(cè)MCAO 模型構(gòu)建及側(cè)腦室注射采用經(jīng)典線栓法［8］制備MCAO 模型，腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液（0.2 mL/100 g）麻醉大鼠，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈，分離迷走神經(jīng)，在頸總動(dòng)脈近心端夾閉血管，頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端剪一小口，將線栓經(jīng)切口推至頸總動(dòng)脈，沿頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈順行向上插入至大腦中動(dòng)脈，插入深度約（18± 2.0）mm，阻斷90 min 后退出線栓，逐層縫合傷口。參照大鼠腦立體定位圖譜［9］，以前囟為坐標(biāo)零點(diǎn)，向后囟方向前進(jìn)0.5 mm，右側(cè)旁開1.5 mm 進(jìn)行標(biāo)記，顱骨鉆打開標(biāo)記部位顱骨，進(jìn)針深度3.5 mm，以1 μL/min速度勻速注射10 μL的PBS緩沖液（PBS 組）或NSC-Exos 溶液（NSC-Exos 組）。

1.2.3 Zea Longa 評分根據(jù)神經(jīng)功能行為學(xué)缺陷Zea Longa 評分［8］判斷術(shù)后大鼠是否建立MCAO模型。評判標(biāo)準(zhǔn)：無神經(jīng)功能缺損癥狀，0 分；健側(cè)前爪不能完全伸展，1 分；出現(xiàn)偏癱，行走時(shí)向健側(cè)旋轉(zhuǎn)或轉(zhuǎn)圈，2 分；輕推大鼠或大鼠行走時(shí)向偏癱側(cè)倒下，3 分；無自主活動(dòng)或喪失意識(shí)，4 分。將評分1～3 分的大鼠確定為模型成功鼠。

1.2.4 腦梗死體積測定腦組織以2 mm 為厚度制備冠狀切片，加入2，3，5-三苯基氯化四氮唑（2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride，TTC）染液37 ℃避光孵育20 min，4%多聚甲醛溶液固定30 min 后拍照觀察。應(yīng)用Image Pro Plus 6.0 軟件分析，梗死面積=對側(cè)半球面積-患側(cè)正常腦組織面積；相對梗死體積=微梗死體積/總體積=（S1+S2+…SN）*H/（S1總+S2總+…SN總）*H*100%，SN表示每片腦片的梗死面積，H 為腦片厚度。

1.2.5 Nissl 染色石蠟切片脫蠟至水，按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。高倍鏡（× 400）下隨機(jī)觀察海馬CA3 區(qū)域不重疊的3 個(gè)視野，計(jì)算神經(jīng)元數(shù)目，神經(jīng)元存活率=存活神經(jīng)元數(shù)目/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.6 GFAP 免疫熒光化學(xué)染色石蠟切片脫蠟至水，3% H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶，枸櫞酸鈉緩沖液水浴加熱修復(fù)抗原，5% BSA 室溫孵育2 h，滴加兔抗大鼠GFAP（1∶250，批號80788）抗體4 ℃過夜孵育，次日加入Alexa Fluor 488 標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1∶500，批號4412）室溫孵育2 h，DAPI 染核20 min，封片固定。于高倍鏡（× 400）視野下在海馬CA3 區(qū)域，每張切片隨機(jī)取3 個(gè)視野計(jì)數(shù)，陽性細(xì)胞表達(dá)率=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.7 PKH26探針標(biāo)記及MAP-2共定位檢測按照PHK26 試劑盒說明書配制染色工作液（批號UR52302），200 μg 外泌體加入50 μL 工作液充分混勻，加入10 mL無菌PBS緩沖液，4 ℃，120 000×g離心70 min，無菌PBS 重懸沉淀即得PKH26 探針標(biāo)記的外泌體混懸液。MAP-2 免疫熒光化學(xué)染色步驟所需一抗為兔抗大鼠MAP-2（1∶250，批號8707）抗體，二抗為Alexa Fluor 555 標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶500，批號4413）。

1.2.8 TUNEL與MAP-2免疫熒光化學(xué)染色按照TUNEL 試劑盒（批號KGA7071-1）說明書操作，最后用DAPI 染液染核10 min，鏡下觀察。用Image-Pro Plus 6.0 軟件進(jìn)行圖像分析，高倍鏡（× 400）下每張切片在海馬CA3 區(qū)域隨機(jī)取3 個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)MAP-2 和TUNEL 雙陽性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)。凋亡指數(shù)=雙陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%，3 個(gè)視野的細(xì)胞凋亡指數(shù)平均值代表每只大鼠的神經(jīng)元凋亡指數(shù)。

1.2.9 Western blot右側(cè)海馬組織加入RIPA 蛋白裂解液提取蛋白，BCA方法進(jìn)行蛋白定量，電泳、轉(zhuǎn)膜，5%BSA 封閉。加入兔抗大鼠IL-6（1∶1 000，批號500-P73）、IL-1β（1∶1 000，批號500-P80）、TGF-β1（1∶1 000，批號BA0290）、β-actin（1∶5 000，批號BM3873）抗體，4 ℃孵育過夜，次日加入過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG 二抗（1∶5 000，批號BA1003），室溫孵育2.5 h，顯色并拍照，Image Pro Plus 6.0 軟件計(jì)算條帶相對灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，兩組間比較采用獨(dú)立t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。方差齊時(shí)，采用LSD 法進(jìn)行多重比較；方差不齊則采用Dunnett T3 法進(jìn)行檢驗(yàn)。運(yùn)用SNK 檢驗(yàn)評估統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Zea Longa 評分結(jié)果Sham 組大鼠未見異常神經(jīng)功能缺損；與Sham 組相比，MCAO 組和PBS 組大鼠缺血再灌注后Zea Longa 評分增高（P＜0.05），大鼠出現(xiàn)偏癱癥狀，行走時(shí)向健側(cè)傾倒或轉(zhuǎn)圈；與MCAO 組和PBS 組相比，NSC-Exos 組大鼠評分顯著降低（P＜0.05）；MCAO 組與PBS 組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 各組大鼠Zea Longa 評分、腦組織相對梗死體積和神經(jīng)元存活率比較Tab.1 Comparison of Zea Longa score,relative infarct volume of brain tissue and neuronal cell survival in each group of rats ±s

表1 各組大鼠Zea Longa 評分、腦組織相對梗死體積和神經(jīng)元存活率比較Tab.1 Comparison of Zea Longa score,relative infarct volume of brain tissue and neuronal cell survival in each group of rats ±s

組別Sham組MCAO組PBS組NSC-Exos組F值P值Zea Longa評分0.00±0.00 2.60±0.52 2.70±0.48 1.80±0.42 92.210＜0.001相對梗死體積（%）0.00±0.00 48.67±4.04 48.88±3.32 33.61±4.07 144.600＜0.001神經(jīng)元存活率（%）89.06±4.60 17.94±3.05 18.70±3.62 36.87±6.59 154.300＜0.001

2.2 腦組織相對梗死體積結(jié)果TTC 染色后血流正常供應(yīng)區(qū)域腦組織呈現(xiàn)粉紅色，缺血梗死灶為白色（圖1）。與Sham 組相比，MCAO 組和PBS 組大鼠腦組織出現(xiàn)明顯白色梗死灶，相對梗死體積增大（P＜0.05）；與MCAO 組和PBS 組相比，NSC-Exos組大鼠相對梗死體積顯著減少（P＜0.05）；MCAO組與PBS 組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

圖1 大鼠腦組織TTC 染色結(jié)果Fig.1 TTC staining results of brain tissue in rats

2.3 Nissl 染色結(jié)果Sham 組大鼠海馬CA3 區(qū)域細(xì)胞排列規(guī)整，形態(tài)飽滿圓潤，尼氏小體深染分布均勻；與Sham 組相比，MCAO 組和PBS 組可見大量壞死神經(jīng)元（P＜0.05），細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，尼氏小體淡染甚至消失；與MCAO 組和PBS 組大鼠相比，NSC-Exos 組可見少量壞死神經(jīng)元，細(xì)胞形態(tài)較圓潤飽滿，尼氏小體分布較均勻（P＜0.05）；MCAO 組與PBS 組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1、圖2。

圖2 大鼠海馬CA3 區(qū)域Nissl 染色結(jié)果Fig.2 Nissl staining results of CA3 region in hippocampus of rats

2.4 GFAP 免疫熒光化學(xué)染色結(jié)果Sham 組大鼠海馬CA3 區(qū)域GFAP 陽性細(xì)胞伸出細(xì)長突起，向四周擴(kuò)散，發(fā)綠色熒光（圖3）；與Sham 組相比，MCAO組和PBS 組大鼠GFAP 強(qiáng)陽性表達(dá)（P＜0.05）；與MCAO 組和PBS 組相比，NSC-Exos 組大鼠GFAP 陽性細(xì)胞表達(dá)率顯著下降（P＜0.05）；MCAO 組與PBS組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

圖3 海馬CA3 區(qū)GFAP 免疫熒光化學(xué)染色結(jié)果Fig.3 GFAP immunofluorescence chemical staining results in CA3 region of hippocampus

表2 各組大鼠海馬CA3 區(qū)GFAP 陽性細(xì)胞表達(dá)率、MAP-2陽性細(xì)胞凋亡指數(shù)比較Tab.2 Comparison of GFAP positive cell expression rate and MAP-2 positive cell apoptosis index in hippocampal CA3 region of rats in each group ±s，%

表2 各組大鼠海馬CA3 區(qū)GFAP 陽性細(xì)胞表達(dá)率、MAP-2陽性細(xì)胞凋亡指數(shù)比較Tab.2 Comparison of GFAP positive cell expression rate and MAP-2 positive cell apoptosis index in hippocampal CA3 region of rats in each group ±s，%

組別Sham 組MCAO 組PBS 組NSC-Exos 組F 值P 值GFAP 陽性表達(dá)率5.09±1.26 20.85±0.44 20.40±1.56 16.50±0.42 147.800＜0.001 MAP-2 凋亡指數(shù)5.04±0.20 45.41±3.21 43.78±4.92 19.58±0.49 131.900＜0.001

2.5 神經(jīng)元細(xì)胞成功攝取NSC-ExosPKH26 熒光探針標(biāo)記的NSC-Exos（紅色）定位于MAP-2 陽性神經(jīng)元（粉色）的胞漿中，且有少量Exos 與細(xì)胞核存在重疊現(xiàn)象，MAP-2 是神經(jīng)元特異性的細(xì)胞骨架蛋白，能夠作為神經(jīng)元細(xì)胞表型標(biāo)記物，結(jié)果表明經(jīng)側(cè)腦室注射的NSC-Exos 可被神經(jīng)元細(xì)胞成功攝取。見圖4。

圖4 PKH26 探針與MAP-2 陽性神經(jīng)元細(xì)胞在CA3 區(qū)域共定位表達(dá)Fig.4 Co-localized expression results of PKH26 and MAP-2 positive neuronal cells in CA3 region

2.6 海馬CA3 區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞凋亡結(jié)果Sham 組大鼠海馬CA3 區(qū)少量表達(dá)MAP-2 和TUNEL 共定位陽性細(xì)胞（圖5）。與Sham 組相比，MCAO 組和PBS組CA3 區(qū)域MAP-2 與TUNEL 陽性共定位細(xì)胞增多（P＜0.05）；與MCAO 組和PBS 組相比，NSC-Exos組共定位陽性細(xì)胞表達(dá)率顯著下降（P＜0.05）；MCAO 組與PBS 組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

2.7 海馬組織IL-6、IL-1β、TGF-β1 蛋白的變化與Sham 組相比，MCAO 組和PBS 組海馬組織中促炎因子IL-6、IL-1β表達(dá)升高，抗炎因子TGF-β1表達(dá)低下（P＜0.05）；與MCAO 組和PBS 組相比，NSC-Exos 組海馬組織中IL-6、IL-1β 蛋白表達(dá)降低，TGF-β1 蛋白表達(dá)增強(qiáng)（P＜0.05）。MCAO 組與PBS組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖6、表3。

圖6 海馬組織中IL-6、IL-1β、TGF-β1 蛋白表達(dá)Fig.6 Expression of protein IL-6，IL-1β and TGF-β1 in hippocampus

表3 各組海馬組織中IL-6、IL-1β、TGF-β1 蛋白表達(dá)的比較Tab.3 Comparison of expression of IL-6，IL-1β and TGF-β1 in hippocampal tissue of each group ±s

表3 各組海馬組織中IL-6、IL-1β、TGF-β1 蛋白表達(dá)的比較Tab.3 Comparison of expression of IL-6，IL-1β and TGF-β1 in hippocampal tissue of each group ±s

組別Sham 組MCAO 組PBS 組NSC-Exos 組F 值P 值IL-6 1.00±0.17 2.24±0.15 2.32±0.01 1.70±0.06 80.590＜0.001 IL-1β 1.00±0.21 7.99±0.32 8.33±1.43 4.68±0.24 62.490＜0.001 TGF-β1 1.00±0.03 0.74±0.03 0.70±0.04 0.93±0.02 67.120＜0.001

3 討論

Exos 是活細(xì)胞分泌到細(xì)胞外液中的囊泡樣物質(zhì)，體積微小，粒徑達(dá)到納米級別［10］，已被證實(shí)在多種疾病損傷中發(fā)揮修復(fù)作用。研究報(bào)道Exos 可被親脂性熒光標(biāo)記染料PKH26 標(biāo)記［11］，并且穩(wěn)定插入受體細(xì)胞膜脂質(zhì)區(qū)域，對靶細(xì)胞的存活率和其他生理特性無明顯影響。因此，本研究采用大鼠MCAO 模型復(fù)制臨床缺血性腦卒中疾病，將NSC-Exos 標(biāo)記PKH26 探針后，注射到MCAO 大鼠側(cè)腦室內(nèi)，結(jié)果顯示大鼠神經(jīng)功能行為學(xué)缺損癥狀顯著減輕，且逆轉(zhuǎn)了損傷側(cè)CA3 區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞的病理形態(tài)學(xué)損傷。鏡下觀察到PKH26 探針與MAP-2 陽性細(xì)胞在大鼠海馬CA3 區(qū)域共定位表達(dá)，表明外泌體可成功被神經(jīng)細(xì)胞攝取，實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果與其他研究［12］一致。

在星形膠質(zhì)細(xì)胞TGF-β 信號通路的研究中，星形膠質(zhì)細(xì)胞被認(rèn)為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染中神經(jīng)炎癥的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其在腦梗死區(qū)邊緣延伸突起包圍正在發(fā)展的梗塞區(qū)，從而抑制神經(jīng)元的可塑性以及腦梗死區(qū)新生軸突和血管的形成［13］。因此，星形膠質(zhì)細(xì)胞增生可能對卒中恢復(fù)產(chǎn)生不利影響［14］。本研究中給予NSC-Exos 治療后，損傷大鼠海馬CA3 區(qū)域的GFAP 陽性細(xì)胞表達(dá)率顯著降低，而GFAP 上調(diào)是星形膠質(zhì)細(xì)胞激活的標(biāo)志，因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示NSC-Exos 可抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞增生。

星形膠質(zhì)細(xì)胞長時(shí)間激活會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡和系列炎性因子的產(chǎn)生［15］，例如IL-6、IL-1β 和TGF-β1 等。IL-6、IL-1β 是與缺血性腦卒中病情加重相關(guān)的兩種重要前炎癥反應(yīng)細(xì)胞因子，也是多個(gè)損傷通路的下游信號分子［16］，研究表明［17］外泌體能明顯抑制Caspase-1 的激活，從而阻止GSDMD的切割和膜GSMDM 孔的形成，通過抑制神經(jīng)細(xì)胞焦亡引起的炎癥反應(yīng)，減少IL-6、IL-1β 等分泌，有效促進(jìn)神經(jīng)功能缺損的恢復(fù)，這與本研究中NSCExos干預(yù)后，MCAO損傷大鼠右側(cè)海馬組織中IL-6、IL-1β 的表達(dá)明顯降低有異曲同工之處。TGF-β1是典型的損傷誘導(dǎo)亞型，可調(diào)控機(jī)體有關(guān)生長、增殖、分化和凋亡基因的表達(dá)，在腦組織內(nèi)主要由星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌，因此星形膠質(zhì)細(xì)胞的含量變化可影響TGF-β1 的表達(dá)，TGF-β1 又可反過來影響星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，進(jìn)而干預(yù)神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕的形成過程［18］。此外，TGF-β1 的作用依賴于細(xì)胞類型，它還可以進(jìn)一步干預(yù)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的調(diào)控程序［19］，由于不同因素的聯(lián)合作用使得其生物學(xué)效應(yīng)更加復(fù)雜。本研究發(fā)現(xiàn)，NSC-Exos 組大鼠TGFβ1 蛋白水平表達(dá)明顯升高、MAP-2 陽性神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率顯著降低，以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其他學(xué)者報(bào)道［20］的人NSCs 來源的外泌體通過抑制神經(jīng)元的凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞活性，從而對受損細(xì)胞發(fā)揮修復(fù)作用的研究結(jié)果類似。

綜上所述，NSC-Exos 具有減輕MCAO 損傷大鼠神經(jīng)功能行為學(xué)缺損癥狀，發(fā)揮神經(jīng)修復(fù)的作用，其機(jī)制可能與NSC-Exos 促進(jìn)TGF-β1 高表達(dá)，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，進(jìn)而影響炎癥因子IL-6、IL-1β釋放及細(xì)胞凋亡有關(guān)。實(shí)驗(yàn)尚存在不足之處：（1）未設(shè)置NSC-Exos 注射濃度梯度，實(shí)驗(yàn)選取的劑量濃度僅依靠文獻(xiàn)報(bào)道的劑量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；（2）僅對Exos 整體干預(yù)效果做出檢測，具體修復(fù)靶點(diǎn)和信號通路尚需進(jìn)一步深挖。