楊曉 張歡 張朝暉 楊細(xì)飛

1南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院（湖南衡陽 421001）；2深圳市疾病預(yù)防控制中心深圳市現(xiàn)代毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳市衛(wèi)生毒理學(xué)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科（廣東深圳 518055）

杜氏肌營養(yǎng)不良癥是一種常見的肌營養(yǎng)不良癥，影響全球多達(dá)1/3 500～1/5 000的男性［1］。其特征表現(xiàn)為肌肉無力，運(yùn)動能力下降，骨骼肌退行性變化。杜氏肌營養(yǎng)不良癥多由于肌營養(yǎng)不良蛋白缺失導(dǎo)致細(xì)胞骨架穩(wěn)定性破壞所致，患者多在2～3 歲發(fā)病，7 歲左右癥狀顯著，10 歲左右需要依靠輪椅活動，最終多在20～30 歲階段死于心力衰竭或者膈肌呼吸無力［2-4］。杜氏肌營養(yǎng)不良癥骨骼肌病理損傷導(dǎo)致肌肉出現(xiàn)明顯的炎癥纖維化病變，盡管肌營養(yǎng)不良蛋白缺失是該病的主要原因，但是肌營養(yǎng)不良蛋白缺失導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷、慢性炎癥壞死和骨骼肌退行性變化會加重疾病進(jìn)展［5-6］。

目前關(guān)于杜氏肌營養(yǎng)不良癥的治療方法包括兩大類，即恢復(fù)肌營養(yǎng)不良蛋白表達(dá)和補(bǔ)償肌營養(yǎng)不良蛋白缺乏的療法，前者包括外顯子跳躍療法、載體介導(dǎo)的基因療法、載體介導(dǎo)的細(xì)胞療法等，后者包括抗炎、抗氧化、抗纖維化治療［7-9］。糖皮質(zhì)激素治療一直是杜氏肌營養(yǎng)不良癥患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，潑尼松和地夫可特是最值得推薦的類固醇治療方案［10］。地夫可特于2017 年獲得FDA 批準(zhǔn)，被廣泛用于杜氏肌營養(yǎng)不良癥患者的臨床治療［11］。

然而目前關(guān)于地夫可特對杜氏肌營養(yǎng)不良癥患者運(yùn)動能力和骨骼肌病理改變的治療研究甚少。此研究旨在了解杜氏肌營養(yǎng)不良癥小鼠運(yùn)動能力變化和肌肉病理改變，探索地夫可特治療期間對杜氏肌營養(yǎng)不良癥小鼠運(yùn)動能力及骨骼肌病理損傷的干預(yù)情況，進(jìn)一步為肌肉退行性疾病的科學(xué)防治提供參考價值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物模型選取肌營養(yǎng)不良蛋白缺乏的C57BL/10ScSnJGpt-Dmdem3Cd4/Gpt（mdx，DMD）動物模型小鼠和品系對照小鼠C57BL/10JGpt（WT）。小鼠購自江蘇省集萃藥康生物科技有限公司，并飼養(yǎng)在溫度穩(wěn)定在（20 ± 2）℃和濕度（55 ± 5）%的12 h 明暗循環(huán)的飼養(yǎng)室中。

依據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)將10 周齡雄性小鼠分為正常對照組（正常組）、模型組、地夫可特治療組［地夫可特組，1 mg/（kg·d）］，每組7只實(shí)驗(yàn)小鼠，實(shí)驗(yàn)8周后實(shí)施安樂死。實(shí)驗(yàn)期間，每周稱量1 次體質(zhì)量，每4 周進(jìn)行1 次行為學(xué)測試評估小鼠運(yùn)動能力。

深圳市疾病預(yù)防控制中心動物福利倫理委員會批準(zhǔn)了此項(xiàng)研究方案（No.2022011）。動物實(shí)驗(yàn)操作和程序均遵循深圳市疾病預(yù)防控制中心動物管理?xiàng)l例執(zhí)行。我們盡一切努力，盡量減少動物的痛苦及減少小鼠的數(shù)量。

1.2 藥物地夫可特：即Deflazacort（MCE，美國），糖皮質(zhì)激素的一種。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 懸掛測試采用懸掛網(wǎng)格測試評估小鼠四肢的握力，通過記錄小鼠倒置懸掛支撐的時間進(jìn)行評估小鼠的肌肉力量。首先將小鼠放置在21 cm × 21 cm 的金屬絲網(wǎng)格（線寬約0.1 cm，相距0.5 cm）的中心，等待小鼠抓住網(wǎng)格時輕輕翻轉(zhuǎn)網(wǎng)格并記錄小鼠懸掛在網(wǎng)格上的時間，可以翻轉(zhuǎn)網(wǎng)格后將其放置在桌子上方35 cm 處。每4 周測試1 次，并以90 s 作為測試結(jié)果的臨界值。每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，計算每只小鼠的平均懸掛時間作為評估值。

1.3.2 爬桿測試爬桿試驗(yàn)用于評估小鼠四肢的運(yùn)動和協(xié)調(diào)性。自制長約50 cm 直徑約1 cm 的木桿，用紗布包裹增加摩擦力。將木桿垂直放在水平桌子上，將小鼠輕輕放在桿子頂部，頭部朝下。小鼠在沒有外力驅(qū)動的情況下沿著攀爬桿自主向下爬行，記錄從桿頂爬到底部所需的時間，即為爬桿時間。正式測試前每天訓(xùn)練3次，持續(xù)3 d［12］。實(shí)驗(yàn)正式開始后，每4 周測試1 次，測試結(jié)果以15 s 為臨界值，超過15 s 的記錄為15 s。每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，計算每只小鼠的3次爬桿平均時間作為評估值。

1.3.3 抓力測試通過測量小鼠前肢最大的抓力大小來評估小鼠四肢的肌肉力量。將小鼠放在測試板中央，輕輕拉動鼠尾巴以鼓勵小鼠前肢抓住握板，當(dāng)它強(qiáng)行抓住抓握板時，及時以恒定速度施加力，拉動小鼠尾巴以使小鼠松開爪子。此時握力值即為小鼠的最大握力值。小鼠經(jīng)過訓(xùn)練后，每月測試1 次，每次重復(fù)3 次，取3 個結(jié)果中的最大值作為評估值。

1.3.4 步態(tài)測試在骨骼肌損傷的小鼠中，小鼠步行平衡能力和和速度會受到影響，步態(tài)會出現(xiàn)異常改變。我們采用小鼠行走跟蹤分析系統(tǒng)，獲得小鼠的自然步態(tài)，并對步態(tài)進(jìn)行鑒定和分析。該系統(tǒng)使用具有高速千兆以太網(wǎng)端口（150 幀/s）的德國相機(jī)和索尼CCD 的感光原理來實(shí)時跟蹤小鼠。它可以智能識別小鼠的身體、頭部、尾巴、四肢等部位的大小，并自動對軌跡進(jìn)行分類，實(shí)現(xiàn)面積、步數(shù)、行走周期、運(yùn)動速度、擺動持續(xù)時間等的精確測量。

在使用該儀器之前，調(diào)整步行平臺到適當(dāng)?shù)膶挾龋箤挾扰c小鼠的大小相匹配，并設(shè)置標(biāo)尺和安裝相機(jī)，正確調(diào)整增益值和白平衡值，以獲得最佳錄制和拍攝效果。整個測試都應(yīng)該在安靜、黑暗的環(huán)境中進(jìn)行的。在正式測試之前，訓(xùn)練小鼠行走，并允許沿著50 cm 長的玻璃路徑反復(fù)行走以熟悉環(huán)境。在正式測試期間，老鼠被放置在過道的入口處，老鼠會沿著玻璃通道行走。高速千兆以太網(wǎng)端口攝像頭收集步行數(shù)據(jù)，步行分析器系統(tǒng)軟件用于篩查。如果小鼠由于恐懼或嗅聞而在行走時暫?；蜣D(zhuǎn)身，則必須重復(fù)測量。如果自動跡線分析不正確，可以手動分析校準(zhǔn)跡線。

1.3.5 生化指標(biāo)檢測小鼠實(shí)施安樂死后，立即眼球取血收集新鮮血液。將血液樣品在4 ℃下以1 500×g離心10 min，凍存放在-80 ℃冰箱。在上機(jī)測試前，從冰箱取出血樣放在冰上等待其解凍。隨后使用HITACHI7080 自動臨床分析儀（日本東京）測量血清肌酸激酶、血漿乳酸脫氫酶和血糖水平。

1.3.6 蘇木素伊紅染色（1）烘箱55 ℃烘片；（2）二甲苯脫蠟30 min；（3）隨后乙醇梯度脫蠟，5 min/次，后經(jīng)自來水洗。（4）蘇木精染色5～10 min；（5）鹽酸乙醇分化數(shù)秒；（6）自來水洗，返藍(lán)；（7）伊紅染色3 min 左右；（8）自來水洗后乙醇梯度脫水，5 min/次；（9）二甲苯透明30 min；（10）中性樹脂封片。蘇木精-伊紅染色試劑購自北京索萊寶科技有限公司。在光學(xué)顯微鏡下觀察所有染色切片，并使用Image J 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.3.7 天狼猩紅染色（1）烘箱55 ℃烘片，二甲苯脫蠟30 min；（2）乙醇梯度脫蠟，5 min/次；（3）天狼猩紅染色8～10 min 后流水沖洗；（4）蘇木素染色1 min 流水沖洗；（5）乙醇梯度脫水，5 min/次；（6）二甲苯中透明30 min；（7）中性樹脂封片。天狼猩紅染色試劑盒購買于飛凈科研試劑有限公司，在光學(xué)顯微鏡下觀察所有染色切片，并使用Image J 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法使用GraphPad Prism 8.0.2 軟件，所有數(shù)據(jù)均表示均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，分析方法采用單因素方差分析或者雙因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠每周體質(zhì)量稱量結(jié)果小鼠稱重結(jié)果發(fā)現(xiàn)杜氏肌營養(yǎng)不良癥小鼠體質(zhì)量明顯高于正常小鼠（P＜0.01），地夫可特組與模型組體質(zhì)量相比，小鼠在13 周齡和15 周齡出現(xiàn)差異（P＜0.05），其他時間段稱重與模型組小鼠體質(zhì)量相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 小鼠體質(zhì)量結(jié)果（n=7）Fig.1 Mouse weight Results

2.2 地夫可特提高小鼠運(yùn)動能力在小鼠10 周齡、14 周齡、18 周齡時各進(jìn)行一次行為學(xué)測試，評估小鼠運(yùn)動能力變化。懸掛測試評估小鼠肌肉力量和耐力（圖2A），發(fā)現(xiàn)與正常組小鼠相比，模型組小鼠懸掛支撐時間縮短（P＜0.01）。地夫可特組小鼠與模型組小鼠相比，懸掛支撐時間在14 周齡時出現(xiàn)延長趨勢，在18 周齡時出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。爬桿耗時分析如圖2B 所示，10 周齡時正常組小鼠與模型組小鼠間存在差異（P＜0.05），隨著疾病進(jìn)展，兩組小鼠爬桿耗時差異逐漸明顯（14 周齡時P＜0.01，18 周齡時P＜0.001）。與模型組相比，地夫可特組小鼠爬桿耗時在18 周齡時出現(xiàn)顯著差異。采取前肢抓力測試評估小鼠肌肉力量如圖2C，可見10 周齡時正常組和模型組小鼠抓力測試即出現(xiàn)明顯差異（P＜0.0001），14 周齡和18 周齡測試發(fā)現(xiàn)其差異降低（P＜0.01）。相較于模型組小鼠，地夫可特組小鼠抓力值在14 周齡和18 周齡時均出現(xiàn)差異（P＜0.05）。

圖2 地夫可特提高小鼠運(yùn)動能力（n=7）Fig.2 Deflazacort improved locomotor activity in mice

2.3 地夫可特減輕小鼠步態(tài)損傷小鼠18 周齡時，采取小鼠步態(tài)分析儀測試小鼠的四肢步態(tài)變化，分析小鼠四肢步幅距離和步行速度兩項(xiàng)指標(biāo)。發(fā)現(xiàn)模型組小鼠前肢（P＜0.001）和后肢（P＜0.01）步幅距離縮短，地夫可特增加了小鼠前肢步幅距離（P＜0.01），然而對改善后肢步幅距離無統(tǒng)計學(xué)差異（圖3A、B）。此外，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠步行速度遠(yuǎn)低于正常組小鼠（P＜0.0001），地夫可特組小鼠前肢（P＜0.01）和后肢（P＜0.05）步行速度提高（圖3C、D）。

圖3 地夫可特減輕小鼠步態(tài)損傷（n=6）Fig.3 Deflazacort reduced gait impairment in mice

圖4 小鼠血清生化指標(biāo)檢測（n=6）Fig.4 Serum biochemical markers for mice

2.4 地夫可特治療對小鼠生化指標(biāo)的影響杜氏肌營養(yǎng)不良癥的標(biāo)志是骨骼肌損傷，肌酸激酶和乳酸脫氫酶作為衡量骨骼肌損傷的重要指標(biāo)［13］，在杜氏肌營養(yǎng)不良癥中會發(fā)生明顯變化。發(fā)現(xiàn)模型組小鼠血清中肌酸激酶和乳酸脫氫酶水平異常高于正常小鼠，尤其是肌酸激酶水平顯著升高（P＜0.000 1）。與模型組比較，地夫可特干預(yù)的小鼠血清肌酸激酶水平受到抑制（P＜0.05），以及乳酸脫氫酶水平具有降低趨勢。由于地夫可特作為糖皮質(zhì)激素的一種，可能會對血糖產(chǎn)生影響。我們檢測了小鼠血清中血糖含量，可見模型組小鼠與正常組小鼠相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而地夫可特組小鼠血糖水平升高（P＜0.01），提示我們地夫可特治療會對患者的血糖產(chǎn)生一定影響。

2.5 地夫可特減輕小鼠骨骼肌病理損傷小鼠腓腸肌和膈肌石蠟包埋后，進(jìn)行病理組織學(xué)檢查，觀察肌肉病變狀況。蘇木素伊紅染色結(jié)果顯示如圖5A，發(fā)現(xiàn)與正常組小鼠相比，模型組小鼠腓腸肌出現(xiàn)大量的炎性細(xì)胞浸潤（P＜0.001），同時伴隨肌肉萎縮表現(xiàn)。與模型組小鼠相比，地夫可特組腓腸肌炎性細(xì)胞浸潤的面積占比下降（P＜0.01）。小鼠膈肌天狼猩紅染色（圖5B-C），發(fā)現(xiàn)模型組小鼠肌肉切片中出現(xiàn)大量Ⅰ型膠原纖維沉積（P＜0.01）和炎性細(xì)胞聚集（P＜0.001）。地夫可特組膈肌炎性細(xì)胞浸潤面積減少（P＜0.01），并且具有降低Ⅰ型膠原纖維沉積面積的趨勢。

3 討論

杜氏肌營養(yǎng)不良癥作為一種伴X 隱性遺傳的肌肉退行性疾病，肌營養(yǎng)不良蛋白突變導(dǎo)致肌肉的再生能力失調(diào)，導(dǎo)致肌肉修復(fù)障礙，繼而出現(xiàn)纖維化損傷，阻礙了肌肉的再生［14-16］。杜氏肌營養(yǎng)不良癥被視作多系統(tǒng)疾?。?7-18］，患者多年幼發(fā)病，青少年時期因骨骼肌運(yùn)動能力嚴(yán)重?fù)p傷失去行走能力，最終于青年時期呼吸肌無力或者心肌衰竭致死［19］。研究發(fā)現(xiàn)隨著疾病進(jìn)展，杜氏肌營養(yǎng)不良癥小鼠呈現(xiàn)體質(zhì)量增加、活躍度降低、懸掛支撐時間縮短、爬桿緩慢、抓力逐漸減小等變化。地夫可特治療對小鼠骨骼肌重量無明顯影響，治療4 周時提升小鼠抓力，治療8 周后明顯增加了懸掛支撐時間和前肢抓力，并減少了爬桿耗費(fèi)時間。以上結(jié)果說明隨著地夫可特干預(yù)時間延長，其對杜氏肌營養(yǎng)不良癥小鼠肌肉力量和運(yùn)動耐力的改善作用逐漸加強(qiáng)。步態(tài)分析發(fā)現(xiàn)地夫可特增加杜氏肌營養(yǎng)不良癥小鼠前后肢步行速度和前肢步行距離，尤其是在改善前肢步態(tài)方面效果尤其明顯。

肌酸激酶作為衡量骨骼肌損傷的重要指標(biāo)，在杜氏肌營養(yǎng)不良癥中會發(fā)生明顯變化［20-21］。生化檢測發(fā)現(xiàn)地夫可特治療降低了小鼠肌酸激酶水平，同時具有減輕乳酸脫氫酶的趨勢，然而它對小鼠血糖產(chǎn)生一定影響，提醒我們高血糖患者使用該藥時應(yīng)監(jiān)控血糖變化。此外，杜氏肌營養(yǎng)不良癥肌肉伴隨炎癥病變［22］，病理組織學(xué)分析提示杜氏肌營養(yǎng)不良癥小鼠骨骼肌大量炎性細(xì)胞浸潤和膠原纖維積聚，暗示此疾病可能是通過激活炎癥反應(yīng)促進(jìn)纖維化過程加重骨骼肌損傷。地夫可特治療具有重要的抗炎作用，并且具有減輕肌肉纖維化的潛力。

以上分析表明地夫可特治療增強(qiáng)杜氏肌營養(yǎng)不良癥小鼠肌肉力量和耐力，改善步態(tài)緩滯失衡表現(xiàn)，同時具有減輕肌肉炎癥損傷，削弱肌肉纖維化損傷的趨勢。提示地夫可特可能是通過減輕炎性細(xì)胞浸潤和膠原纖維聚集，從而緩解骨骼肌病變，提高運(yùn)動耐力和力量。后續(xù)還需從分子機(jī)制層面探討地夫可特對杜氏肌營養(yǎng)不良癥小鼠骨骼肌炎癥和纖維化損傷的治療機(jī)制，尋找藥物作用的分子靶標(biāo)，進(jìn)一步為肌肉退行性疾病的治療提供一定的科學(xué)依據(jù)。